Введение к работе
Актуальность темы. Успехи в технологии получения рекомбинантных ДНК открыли возможность создания новых генотипов путем введения, удаления или изменения генома животного уже в первом поколении. Значительный прогресс, достигнутый в этой области, связан, прежде всего, с разработкой новых более эффективных способов получения трансгенных организмов и созданием качественно новых генных конструкций, обеспечивающих более высокие уровни экспрессии трансгенов в организме животных [Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2006]. Однако, несмотря на достигнутые успехи при получении трансгенных животных, все еще остается проблема, связанная с не прогнозируемостью физиологических последствий реализации внесённой генетической информации.
Данные последствия являются, с одной стороны, результатом изменений на уровне генотипа, обусловленных дестабилизацией генома трансгенных животных [Кленовицкий П.М. и др., 1999, Медведев С.Ю., 1992, Вгет, 1993, Constantini et al, 1989, Gasaryan et al, 1987]. С другой стороны, нарушения в функционировании отдельных систем организма могут быть связаны с дополнительной экспрессией интегрированных рекомбинантных генов и проявляться на различных уровнях организации индивидуумов: генетическом, цитологическом, тканевом, организменном [Nancarrow et al, 1991, Pursel et al, 1987, 1989, Эрнст Л.К. и др., 1993, Голъдман И.Л.и др., 1993, 1994]. И если влияние чужеродных генов на организм трансгенных животных достаточно полно изучено на макроуровне (организм в целом), то исследований на клеточном и тканевом уровнях (микроуровне) проводится мало. Хотя именно последнее в некоторых случаях может дать полный ответ на ряд вопросов, касающихся взаимодействия вырабатываемых в организме трансгенных животных рекомбинантных белков с собственными (эндогенными) белками организма и объяснить вызванные данным взаимодействием нарушения в нормальном развитии животного.
В связи с этим, для оценки влияния интеграции чужеродных генов на организм животных необходимо наряду с анализом генотипа проводить комплексные исследования трансгенных животных по фенотипическим признакам, затрагивая проявление экспрессии вырабатываемых рекомбинантных продуктов на уровне тканей и клеток.
Цель и задачи. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы являлось изучение фенотипического эффекта экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных разных форм на различных уровнях организации индивидуумов: организменном, тканевом и клеточном.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать технологию получения соматических трансгенных сельскохозяйственных животных (коров, коз, свиней) посредством использования ретровирусных векторов.
-
Изучить молекулярные аспекты трансформации клеток молочной железы сельскохозяйственных животных при локальном трансгенезе и исследовать динамику синтеза рекомбинантных белков с молоком полученных соматических трансгенных животных.
-
Изучить наследование трансгенов в ряде поколений свиней, интегрировавших ген соматолиберина человека, и кроликов со встроенными генами кластера RCA и оценить влияние интеграции чужеродной ДНК на сохранение стабильности генома трансгенных животных.
-
Исследовать изменения биохимического статуса, морфофункциональных характеристик внутренних органов и тканей, динамики роста, показателей откормочной и мясной продуктивности у трансгенных свиней по сравнению с аналогами. Выполнить анализ корреляционных зависимостей в организме трансгенных и интактных свиней.
-
Исследовать экспрессию генов кластера RCA в организме трансгенных кроликов и изучить характер изменения фенотипа кроликов под влиянием трансгенеза.
-
Выполнить теоретическое и экспериментальное обоснование отдельных элементов технологии трансгенеза кур, направленное на повышение результативности создания трансгенной птицы.
-
Изучить характер интеграции и экспрессии рекомбинантных генов в органах и тканях трансгенных кур.
-
Выполнить сравнительную оценку влияния интеграции и экспрессии рекомбинантных генов на фенотип и генотип трансгенных животных различных форм.
Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые исследованы механизмы создания соматических трансгенных животных (коров, коз, свиней) методом локального трансгенеза и изучены факторы, обуславливающие результативность генетической трансформации клеток молочной железы in vivo. Выполнено исследование уровня синтеза рекомбинантных белков - гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) и эритропоэтина человека (ЭПО) в молоко полученных трансгенных животных в динамике и оценены изменения морфофункциональных характеристик ткани молочной железы опытных животных под воздействием экспрессии трансгенов.
Впервые выполнена комплексная оценка влияния интеграции и экспрессии трансгена на генотип и фенотип свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека в ряде генераций в сравнительном аспекте. Изучен характер изменения корреляционных связей в организме опытных животных.
Изучена возможность использования генных конструкций на основе искусственных хромосом дрожжей (YAC) для получения трансгенных кроликов, интегрировавших гены-ингибиторы комплемента кластера RCA, как моделей для ксенотрансплантации. Проведена оценка влияния интеграции больших фрагментов ДНК (700 тысяч пар оснований) на
сохранение стабильности генома трансгенных животных. Исследована экспрессия генов кластера RCA в организме трансгенных кроликов и изучены особенности их фенотипа.
Оценена результативность генетической модификации эмбрионов кур in vivo с использованием ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность получения трансгенных кур. Исследован характер экспрессии репортерных генов lacZ и GFP (зеленый флюоресцирующий белок) в различных органах и тканях полученной трансгенной птицы.
На основании проведенных исследований дана оценка фенотипического эффекта экспрессии рекомбинантных белков в организме трансгенных животных разных форм.
Практическая значимость.
Разработана технология локального трансгенеза молочной железы сельскохозяйственных животных - коров, коз и свиней с целью создания соматических трансгенных животных - биореакторов. Установлены факторы, обуславливающие результативность генетической трансформации клеток вымени сельскохозяйственных животных in vivo. Получены соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки, продуцирующие с молоком гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) и эритропоэтин (ЭПО) человека.
Изучены биологические и некоторые продуктивные особенности свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека, в сравнительном аспекте в ряде поколений. Выявлены изменения показателей биохимического статуса и морфофункциональных характеристик внутренних органов. Установлено изменение характера корреляционных связей в организме трансгенных свиней.
Изучены биологические особенности кроликов, трансгенных по генам-ингибиторам комплемента кластера RCA. Установлено, что интеграция больших фрагментов ДНК (длиной 700 тысяч п.о.) на основе YAC не оказывает существенного влияния на жизнеспособность трансгенных кроликов, что позволяет рассматривать этих животных в качестве функциональной модели для изучения проблем ксенотрансплантации. Показана повышенная устойчивость клеток трансгенных кроликов к лизису сывороткой крови человека, что указывает на потенциальную значимость генов-ингибиторов комплемента кластера RCA в разработке технологий клеточной терапии.
Усовершенствована технология получения трансгенных кур, основанная на использовании ретровирусных векторов. Разработан способ введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo. Установлены факторы, влияющие на результативность генетической модификации эмбрионов кур. Получена трансгенная птица с интеграцией и экспрессией репортерных генов lacZ и GFP (зеленый флюоресцирующий белок) в ряде внутренних органов: сердце, печени, кишечнике, желудке, мышцах, репродуктивных органах.
Основные положения, выносимые на защиту.
Опосредованный ретровирусами перенос генов как результативный способ доставки экзогенной ДНК в клетки молочной железы животных и создания соматических трансгенных сельскохозяйственных животных -коров, коз и свиней.
Тип генной конструкции и вектора, способ подготовки инъекционного препарата и стадия введения в организм животных как факторы, обуславливающие результативность локального трансгенеза молочной железы и создания соматических трансгенных животных-продуцентов.
Изменения биохимического статуса, морфофункциональных характеристик внутренних органов и некоторых продуктивных показателей у свиней, трансгенных по гену соматолиберина, разных генераций.
Повышенная устойчивость различных типов клеток кроликов, трансгенных по генам-ингибиторам комплемента кластера RCA, к лизису сывороткой крови человека.
Динамика уровня хромосомных нарушений у трансгенных животных - свиней и кроликов в ряде генераций.
Усовершенствованная технология создания трансгенных кур и факторы, обуславливающие ее результативность.
Сравнительный анализ проявления интеграции и экспрессии рекомбинантных генов в фенотипе трансгенных сельскохозяйственных животных различных форм.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 25 международных конференциях (Дубровицы, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006; Быково, 2002; Москва, 2004, 2005, 2006; Бишкек, 2005; Чимкент, 2005; Боровск, 2006; Санкт-Петербург, 2007).
По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 12, книг -1, методических рекомендаций - 2, патентов - 1.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 324 страницах, содержит 69 таблиц, 35 рисунков, 17 графиков, 10 схем. Библиографический список содержит 407 источников, в том числе 366 на иностранных языках.
