Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Электромагнитные поля и их влияние на живые организмы 8
1.2. Влияние КВЧ-излучения на микроорганизмы 13
1.3. Действие электромагнитных волн сантиметрового диапазона (СВЧ) на живые организмы 25
1.4. Предположительные механизмы действия электромагнитных излучений на биологические объекты 32
1.5. Торфяные почвы и структура бактериального комплекса в них 40
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 45
2.2. Методы исследования 47
2.2.1. Условия культивирования бактерий 47
2.2.2. Получение споровых суспензий и суспензий вегетативных клеток бацилл и актиномицетов 48
2.2.3. СВЧ-облучение 49
2.2.4. Изучение влияния уровня увлажнения спор на действие СВЧ 49
2.2.5. Определение биомассы 49
2.2.6. Определение уровня дыхания 49
2.2.7. Определение размера колоний стрептомщетов 50
2.2.8. Мулътисубстратное тестирование 50
2.2.9. Исследование интенсивности прорастания спор стрептомицета в э/сидкой питательной среде 51
2.2.10. Исследование интенсивности прорастания спор стрептомицета в почве при разных уровнях влажности после воздействия СВЧ-излучения 52
2.2.11. Состав используемых сред 53
2.2.12. Статистическая обработка 54
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Влияние СВЧ-излучения на сохранение жизнеспособности почвенных бактерий 55
3.2. Изменение физиологических характеристик у стрептомицетов под воздействием СВЧ 65
3.3. Зависимость эффекта действия микроволн от внешних факторов 75
3.4. Изучение влияния СВЧ-излучения на интенсивность прорастания спор Streptomyces xanthochromogenes
в жидкой питательной среде 80
3.5. Изучение влияния СВЧ-излучения на развитие Streptomyces xanthochromogenes в почве 83
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 91
Выводы 96
Литература 97
- Электромагнитные поля и их влияние на живые организмы
- Действие электромагнитных волн сантиметрового диапазона (СВЧ) на живые организмы
- Получение споровых суспензий и суспензий вегетативных клеток бацилл и актиномицетов
- Влияние СВЧ-излучения на сохранение жизнеспособности почвенных бактерий
Введение к работе
Актуальность темы. В природных условиях существует множество физических факторов, влияющих на все живые организмы. К этим факторам относят температуру, давление, УФ-излучение, магнитные поля, электромагнитные излучения различных диапазонов, электрические импульсы. Изменение параметров любого из этих факторов может вызвать угнетение или стимуляцию физиологической активности у биологических объектов.
В настоящее время происходит интенсивное развитие отраслей промышленности, использующих электромагнитное излучение. Поэтому сейчас практически повсеместно биосфера находится под воздействием различных электромагнитных излучений (ЭМИ). В связи с развитием техники, радиосвязи, телевидения, радиолокации и радионавигации в настоящее время электромагнитные излучения разделяют на три группы: поля естественного происхождения, излучения биологической природы и поля искусственного происхождения (Казеев и др., 2004).
Электромагнитные излучения являются физическим фактором среды,
который оказывает существенное влияние на различные живые организмы. На
Земле не существует естественных источников электромагнитного излучения в
сантиметровом диапазоне (СВЧ). Однако ЭМИ в сантиметровом диапазоне
применяются в медицине и микробиологии (Wu, 1994). Многие исследователи
использовали СВЧ-излучение для подавления роста микроорганизмов при
стерилизации всевозможных объектов (Shin et al., 1997; Rosaspina et al., 1994).
Есть сведения о стимулирующем действии этого излучения на некоторые
микроорганизмы в случаях, когда нагревание объектов не происходит или
сводится к минимуму (Булина и др., 1997; Rai et al., 1999). В ряде работ (Puri,
Barracough, 1993) было предложено использование микроволнового излучения
для фумигации почв при определении углерода микробной биомассы. . % )
Однако до сих пор нет данных о влиянии СВЧ-излучения на почвенные \/ і бактерии и их физиологическую активность.
Целью работы является изучение влияния микроволнового излучения на рост почвенных бактерий и их физиологические характеристики в почве и в чистых культурах.
Задачи исследования:
Изучение действия СВЧ-излучения на представителей некоторых родов почвенных бактерий.
Исследование влияния микроволн . на разные виды бацилл и стрептомицетов.
Изучение действия электромагнитных волн сантиметрового диапазона на штаммы одного вида бацилл.
Исследование влияния СВЧ-излучения на некоторые физиологические признаки стрептомицетов.
Исследование интенсивности прорастания спор стрептомицетов в жидкой среде и в почве под влиянием микроволн.
Научная новизна. Впервые показано, что действие микроволн на почвенные мицелиальные и другие бактерии зависит от их таксономического положения и способности к образованию темноокрашенных пигментов. Установлено, что СВЧ-излучение сильнее действует на споры, чем на вегетативные клетки бацилл и стрептомицетов. На примере бацилл показано, что все исследованные штаммы одного вида реагируют на микроволны одинаково. Выявлено, что под воздействием электромагнитных волн сантиметрового диапазона изменяются как физиологические характеристики культуры (накопление биомассы, интенсивность дыхания, выживаемость), так и способность к усвоению субстратов. Установлено, что устойчивость спор стрептомицетов по отношению к СВЧ-облучению возрастает с уменьшением уровня увлажненности спор.
Показано, что при развитии Streptomyces xanthochromogenes в жидкой среде обработка посевного материала микроволнами оказывает влияние на развитие культуры, начиная от стадии прорастания спор и до образования микроколоний.
Выявлено, что в почве для стимуляции прорастания спор и роста мицелия Streptomyces xanthochromogenes требуется в два раза более длительная обработка СВЧ-излучением по сравнению с жидкой средой.
Практическая значимость. Полученные данные могут быть использованы при оценке действия электромагнитных волн как фактора загрязнения на природные микробные популяции и лабораторные культуры. Выявлены экспозиции облучения СВЧ-излучением стрептомицетных культур, позволяющие регулировать их физиологическую активность, что может использоваться в биотехнологических целях.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на конференциях «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2005, 2006), Международной научной конференции «Проблемы сохранения, восстановления и обогащения биоразнообразия в условиях антропогенно-измененной среды обитания» (Украина, Кривой Рог, 2005), Международной научной конференции «Экология и биология почв» (Ростов-на-Дону, 2007), V съезде Общества почвоведов им. В.В.Докучаева (Ростов-на-Дону, 2008), заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Публикации. Материалы исследований изложены в 7 печатных работах, в том числе в 2 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 117 страницах текста, содержит 21 иллюстрацию, _5_ таблиц. Список литературы содержит 195 источников, из которых 63 — зарубежных.
Электромагнитные поля и их влияние на живые организмы
Электромагнитные поля являются физическим фактором среды, который существенно влияет на живые организмы различного уровня организации (Бецкий, Кислов, 1990). Электромагнитная волна - это возмущение электромагнитного поля, распространяющееся в пространстве и несущее с собой энергию и импульс без переноса вещества.
В свободном пространстве (в вакууме или в атмосфере) скорость электромагнитной волны равна 300 тыс. км в секунду, то есть электромагнитные волны распространяются со скоростью света, а свет является электромагнитной волной.
Излучение электромагнитной волны сопровождается переходом электронов в атомах или молекулах с более высокой энергетической орбиты на более низкую. Этот эффект может иметь место как под воздействием внешнего электромагнитного поля, так и при больших температурах.
Мощные электромагнитные поля естественного происхождения генерирует Солнце. Нет другого внешнего фактора, который оказал бы такое сильное воздействие на живые объекты как электромагнитная волна. Жизнь на земле сформировалась под воздействием электромагнитного излучения Солнца. В биосфере постоянно происходят периодические электромагнитные процессы с частотами по всему электромагнитному спектру. Естественно предположить, что любой участок этого спектра сыграл ту или иную роль в эволюции живых организмов (Пресман, 1968; Бецкий и др., 1988; Девятков и др., 1991; Бецкий, 1993).
Солнце - это гигантский ядерный котел (температура поверхности -5780 К, а в центре -1.6-10 К). Такая температура может поддерживаться только термоядерными реакциями синтеза гелия и водорода - как основного источника электромагнитной энергии Солнца. Эту энергию Солнце излучает почти по всей шкале электромагнитных волн - от радиоволнового излучения до гамма-излучения (табл. 1).
На широте Москвы, летом, на квадратный метр площади у поверхности Земли приходится 1 кВт интегральной электромагнитной мощности Солнца. Максимум излучения приходится на видимый, инфракрасный (ИК) и ультрафиолетовый (УФ) диапазоны длин волн.
Излучение в области длин волн от 300 до 1100 нм, приходящееся в основном на видимый свет, обеспечивает возможность осуществления реакций при поглощении его подходящими системами (Гусев, Минеева, 2003). В этом диапазоне излучение запускает такие процессы как фотосинтез, фототаксис, фотореактивацию ДНК, синтез некоторых макромолекул.
Важнейшим источником естественного излучения является солнечная радиация. Основная масса падающей на Землю солнечной энергии (примерно 75%) приходится на долю видимых лучей, почти 20% - на ИК-область спектра и только приблизительно 5% - на УФ с длиной волны 300-380 нм. Нижний предел длин волн солнечной радиации, падающей на земную поверхность, определяется плотностью, так называемого, озонового экрана. Излучение с длиной волны до 220 нм вызывает ионизацию молекул кислорода верхних частей атмосферы, приводя к образованию слоя озона (Оз) с максимальной концентрацией на высоте около 25 км от поверхности Земли. Озоновый слой эффективно поглощает электромагнитное излучение с длинами волн в области 220-300 нм, выполняя функцию экрана. Таким образом, УФ с длиной волны до 220 нм полностью поглощается молекулами кислорода атмосферы, а в области 220-300 нм эффективно задерживается озоновым экраном. Важной частью солнечного спектра является область, примыкающая с обеих сторон к 300 нм. Начиная с 300 нм и дальше, излучение индуцирует фотосинтетические и фототаксические реакции, при этом у прокариот диапазон длин волн, в котором возможны оба процесса, значительно шире, чем у эукариот.
Фотосинтез, сопровождающийся выделением Ог, свойственный всем эукариотным фотосинтезирующим организмам и двум группам прокариот (цианобактерии и прохлорофиты), возможен в диапазоне от 300 до 750 нм. Для прокариот, способных к осуществлению бескислородного фотосинтеза, диапазон излучений, обеспечивающих фотосинтетическую активность, увеличивается в сторону более длинных волн, захватывая ближнюю ИК-область: для зеленых бактерий вплоть до 840 нм, пурпурных бактерий - до 920 нм, а для некоторых представителей этой группы - до 1100 нм. Спектры активности фототаксиса у прокариот совпадают со спектрами фотосинтетической активности.
Свет в диапазоне от дальнего УФ до дальней красной области оказывает влияние на разнообразные жизненные функции (подвижность, циклы развития, синтез каротиноидов) не только фототрофных, но и хемотрофных прокариот. Фоторецепторами, запускающими или контролирующими определенные метаболические пути, служат разные типы молекул: флавины, каротиноиды, порфирины. Солнечная радиация в диапазоне 220-300 нм, достигающая Земли, активно поглощается также молекулами белков и нуклеиновых кислот. Хотя повреждение негенетического материала может приводить к отрицательным эффектам, особенно при облучении клеток высокими дозами, при облучении более низкими дозами основной причиной инактивации клеток служит повреждение ДНК (Гусев, Минеева, 2003).
Под воздействием УФ света у эпифитных бактерий, дрожжей и грибов, характерных для почв высокогорных районов с повышенной радиацией, образуются каротиноидные и меланоидные пигменты, служащие защитой от радиации (Звягинцев и др., 2005).
Действие электромагнитных волн сантиметрового диапазона (СВЧ) на живые организмы
В настоящее время исследования действия сверхвысокочастотных (СВЧ) волн сантиметрового диапазона не многочисленны.
В природных условиях излучения сантиметрового диапазона были зарегистрированы только в области внутреннего плато Восточной Антарктиды (max 22-24 Wm2) (Van den Broeke et al., 2005). С развитием техники количество источников электромагнитных волн СВЧ-диапазона ежегодно увеличивается. К приборам, индуцирующим электромагнитные поля можно отнести: передатчики навигационной службы, высокочастотные нагреватели, передатчики радио и телевещания, многие медицинские диагностические и лечебные приборы, мобильные телефоны, микроволновые печи, микроволновые наземные и спутниковые радары и многое другое. Карманные передатчики вокруг себя могут производить поля 500 В/м, поля от радаров воздушного движения, измеренные в городской атмосфере, составляли 10 В/м (Mantiply et al., 1997). Все это создает угрозу электромагнитного загрязнения окружающей среды.
Использование СВЧ-излучения в настоящее время известно, в основном для стерилизации и пастеризации различных объектов пищевой промышленности. Нетепловое бактерицидное действие электромагнитного поля высокой частоты, подавляющее жизнеспособность многих микроорганизмов, отмечалось исследователями ещё в середине XX века (Nyrop, 1994). Бактерицидный эффект зависит от продолжительности СВЧ-облучения и начальной концентрации микроорганизмов в обрабатываемой среде (Глибин, 1952).
Изучалось бактерицидное действие СВЧ-облучения на микроорганизмы, вызывающие порчу пива и безалкогольных напитков (Гусева и др., 1972). Были проведены эксперименты по обработке микроволновым излучением мелассы, молока, хлеба, сока и др.
Наиболее часто используют действие СВЧ-излучения для пастеризации молока и молочных продуктов. При пастеризации молока с использованием этого облучения обнаружены некоторые положительные аспекты по сравнению с обычной тепловой пастеризацией. При стандартной тепловой пастеризации денатурация происходит раньше, чем при микроволновой обработке, вероятно, из-за другого распределения тепла и уменьшения горячих поверхностей (Lopezfandino et al., 1996). В других исследованиях сырое коровье и козье молоко нагревалось микроволновой энергией до 73,1-96,7С. Действие температурной обработки оценивалось степенью изомеризации лактозы, денатурации белка, инактивации щелочной фосфатазы и пероксидазы и общей численностью бактерий. В результате показано, что непрерывная обработка СВЧ-излучением является более эффективным и мягким методом для пастеризации молока (Villamiel et al., 1996).
Обработку электромагнитным излучением в СВЧ-диапазоне применяли не только для пастеризации молока и молочных продуктов, но и апельсинового сока. Показано, что при стандартной пастеризации теплом у апельсинового сока иногда изменяется запах и вкус из-за перегревов на теплообменной поверхности. Использование СВЧ-излучения позволяет нагревать сок равномерно, не изменяя вкус и запах (Nicdel et al., 1993). Также применяют СВЧ-излучение и для пастеризации других пищевых продуктов, например, яиц. Таким образом, многие исследователи считают использование микроволновой энергии более удобным и эффективным для пастеризации пищевых продуктов (Mcbee, 1996).
В литературе известно применение электромагнитного излучения СВЧ-диапазона в микробиологии. Как говорилось, СВЧ-излучение использовалось для подавления роста микроорганизмов и стерилизации различных объектов. Было показано подавляющее действие СВЧ-излучения на рост различных бактерий, таких как Bacillus subtilis var. niger, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilis, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus. Применяя СВЧ-облучение различной интенсивности и продолжительности воздействия, добивались гибели бактерий (Wu, 1996).
Поскольку СВЧ-излучение является, как правило, тепловым, изучалась также и роль нагревания в действии этого излучения. При СВЧ-облучении культуры Bacillus subtilis было показано четкое, прогрессивное падение жизнеспособности со временем и достижение общей инактивации после 5 мин при 102 С. А при использовании стандартного прогревания в тех же условиях количество спор, способных образовывать колонии, было все еще высоким. Таким образом, действие микроволнового излучения на Bacillus subtilis нельзя приписывать только нагреванию (Salvatorelli et al., 1996).
Получение споровых суспензий и суспензий вегетативных клеток бацилл и актиномицетов
Для выращивания стрептомицетов использовали модифицированные среды 1 и 2 Гаузе (Гаузе и др., 1983). Для подавления роста грибов в среду добавляли нистатин (50 мкг/мл).
Бактерии культивировали на глюкозо-пептонно дрожжевой среде (Методы..., 1991).
Посевы культивировали в термостате при 28С. Срок инкубирования стрептомицетов на твердой питательной среде 7 суток, в погруженной культуре при постоянном качании 200 об/мин - 4 суток (Прокофьева-Бельговская, 1963). Бактерии культивировали в течение 2-7 суток в зависимости от скорости роста.
Для выявления влияния условий культивирования стрептомицетов на эффект действия облучения микроволнами использовали среды, приготовленные на фосфатном буфере с рН 5,3 и 7,2.
При облучении электромагнитным излучением (ЭМИ) актиномицетов и бацилл использовали их суспензии из спор и вегетативных клеток. Для получения споровой суспензии стрептомицета засевали чашки Петри чистой культурой, инкубировали в термостате при 28С в течение 1 недели. Затем собирали споры с поверхности агаризованной среды, суспензировали их в 100 мл воды, фильтровали через стеклянный фильтр № 4. Микроскопирование суспензии служило контролем в отношении отсутствия мицелия в нем. В качестве посевного материала использовали также суспензию, полученную из мицелия актиномицета. Для этого актиномицет выращивали в погруженной культуре на органической среде Гаузе 2 (Гаузе и др., 1983) на качалке, в течение 3-х суток, затем отфильтрованную биомассу суспензировали в воде (Зенова, 1992).
Для получения суспензий вегетативных клеток бацилл чашки Петри засевали чистыми культурами, инкубировали в термостате при 28С в течение 2-7-ми суток, смывали посевной материал с поверхности агаризованной среды и суспензировали его в 100 мл воды. Для получения споровых суспензий водную суспензию клеток бацилл выдерживали в течение 5 дней в холодильнике. Микроскопирование суспензий служило контролем в отношении отсутствия в них спор или вегетативных клеток.
Перед облучением суспензии актиномицетов и бацилл обрабатывали ультразвуком при частоте 22 кГц, силе тока 0,4 А в течение 2-х минут (Звягинцев и др., 1984).
Обработку СВЧ-излучением суспензий чистых культур и почвенных образцов проводили при частоте 2450 МГц, длине волны 12.5 см, мощности 80 Вт и экспозициях облучения: 15, 30, 45, 60 и 90 секунд.
Для изучения влияния уровня увлажнения спор на действие СВЧ использовали споровые суспензии Streptomyces xanthochromogenes. Опыт был поставлен в 3-х вариантах. В первом случае облучали споровую суспензию стрептомицета. Во втором варианте в воде были суспензированы облученные воздушно-сухие споры стрептомицета, а в третьем - лиофильно-высушенные споры. Учет проросших спор проводили методом посева суспензии спор, подсчитывая численность выросших на питательной среде колоний. Первоначальное количество спор в суспензиях учитывали в камере Горяева, используя формулу:
В = a-1000/S-h = а-1000-4000/1, где В - количество клеток в 1 мл суспензии; а - среднее количество клеток в камере Горяева; S - площадь малого квадрата, S = 0,0025 мм2; h - глубина камеры, h = 0,1 мм; 1000 - переход к 1 мл.
Влияние СВЧ-излучения на сохранение жизнеспособности почвенных бактерий
В результате проделанной работы установили, что электромагнитные волны сантиметрового диапазона оказывают влияние на изученные культуры представителей разных родов почвенных бактерий. Однако реакция на облучение СВЧ-излучением у представителей родов не одинакова.
Наиболее устойчивы к облучению оказались одноклеточные актинобактерии (Actinobacteria): Cellulomonas sp., Micrococcus agilis и Rhodococcus erythropolis (рис. 1). Эти бактерии или вообще не реагировали на облучение, или реагировали после достаточно длительной обработки (45-60 секунд).
Более чувствительными к облучению оказались представители грамотрицательных бактерий Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas fluorescens var. lemonieri (рис. 2). Действие микроволн на сохранение их жизнеспособности отмечается уже после 15-секундной обработки. Однако грамотрицательная бактерия Janthinobacterium agaricum оказалась устойчивой к облучению (рис. 2). Для всех используемых экспозиций облучения (от 15 до 60 секунд) не отмечено достоверного действия на жизнеспособность клеток этой бактерии. Отмечено, что при росте на твердых питательных средах Janthinobacterium agaricum образует темноокрашенный пигмент. Многие из известных темных пигментов являются антиокислителями и благодаря этим свойствам защищают образующие их культуры от действия электромагнитных излучений, например в УФ-диапазоне. Поэтому организмы образующие пигмент часто встречаются на поверхности листьев и характерны для многих высокогорных почв (Звягинцев и др., 2005).
Представители грамположительных споровых бактерий - бациллы и стрептомицеты, обладают сложным жизненным циклом. В почве они обнаруживаются как в виде вегетативных клеток, так и в виде спор. Для многих действующих на микроорганизмы факторов (t, тяжелые металлы, радиация и др.) известно, что они оказывают разное влияние на покоящиеся формы и активно растущие клетки.
При изучении влияния СВЧ-излучения на споры и вегетативные клетки бацилл и стрептомицетов установлено, что вегетативные клетки более устойчивы к воздействию микроволн, чем споры (рис. 3). Этот результат несколько неожиданный, так как обычно споры более устойчивы к внешним воздействиям, чем вегетативные клетки. Однако этому факту можно дать следующие объяснения: во-первых, активно растущие вегетативные клетки содержат больше антиокислителей, защищающих клетки от облучения (Тамбиев и др., 2003). Это подтверждается приведенными выше данными о том, что микроорганизмы, синтезирующие меланиновые пигменты, являющиеся антиокислителями, более устойчивы к облучению микроволнами. Во-вторых, по литературным данным известно, что действие КВЧ-излучения наиболее эффективно в тех случаях, когда по тем или иным причинам биохимическая активность биологических объектов снижена (Исаева, 1991; Реброва, 1992). В спорах биологическая активность более заторможена и именно поэтому действие микроволн оказывается более эффективным, чем на вегетативные, активно растущие клетки.
Изучение влияния СВЧ-излучения на сохранение жизнеспособности у представителей разных видов одного рода бактерий показало, что культуры, относящиеся к разным видам, неодинаково реагируют на облучение.
Исследуемые виды рода Streptomyces принадлежат к разным секциям и сериям. Streptomyces viridobrunneus относится к секции Cinereus, серии Chrysanallus; Streptomyces fumosus - секции Cinereus, серии Chromogenes; Streptomyces cinereorectus - секции Cinereus, серии Achromogenes; Streptomyces xanthochromogenes - секции Helvolo-flavus, серии Helvolus. Культуры Streptomyces viridobrunneus и Streptomyces fumosus образуют меланиновые пигменты (Гаузе и др., 1983). В результате исследования влияния облучения микроволнами на споровые суспензии этих культур получили, что представители видов Streptomyces viridobrunneus и Streptomyces fumosus более устойчивы к электромагнитным волнам (рис. 4). Культура Streptomyces fiimosus практически не реагирует на облучение. У культуры Streptomyces viridobrunneus для выявления эффекта влияния требуется длительное облучение (60 секунд). Представители родов Streptomyces cinereorectus и Streptomyces xanthochromogenes чувствительны к микроволнам (рис. 4). Эффект облучения у этих культур электромагнитными волнами отмечается уже после 15-секундной обработки.
Большая устойчивость к микроволнам Streptomyces viridobrunneus и Streptomyces fiimosus объясняется наличием у них меланинового пигмента, который является антиокислителем.
Похожие результаты получены для представителей разных видов бацилл (рис. 5). Культуры Bacillus pumilis и Bacillus brevis менее чувствительны к облучению, a Bacillus licheniformis и Bacillus megaterium более. Вероятно, это можно объяснить различиями в их физиологической активности. Эти культуры отличаются по своей способности к усвоению крахмала, возможности к восстановлению N03 в N02 и по способности к росту на агаре в анаэробных условиях.
В результате исследования влияния СВЧ-излучения на сохранение жизнеспособности представителей разных штаммов одного и того же вида Bacillus licheniformis установлено, что на представителей разных штаммов этого вида бацилл микроволны действуют одинаково (рис. 6).
