Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Одной из основных задач звремешгай структурной биологии является исследование принципов и ехаиизмов белкового фолдинга, т.е. сил, стабилизирующих уникальную ативную структуру белка, способную к выполнению биологических функций.
Согласно общепринятой на сегодняшний день точке зрения на процесс глкового фолдинга, конформационный переход белка из полностью гнатурировашгого (развернутого) в натишгое (компактное) состояние гуществляется, как правило, последовательно через набор промежуточных но гепени структурной упорядоченности конформаций (интермедиатов олдинга). Интермедиаты фолдинга в настоящее время обнаружены для ольшинства исследованных белков, включая простые однодоменные оиструкции. Таким образом, выяснение механизмов белкового фолдинга іюдится к установлению набора интермедиатов и их характеристике, прежде зего определению нх стабильности и динамики переходов между фуктурными состояниями. При этом основополагающей характеристикой фуктурных состояний является их термодинамическая стабильность, пределенная в терминах энергетических параметров перехода между эстояниями (энтальпия денатурации или свободная энергия стабилизации).
Основными объектами для изучения фолдинга в настоящее время вляются одно- и двухдомеиные белки. Иммуноглобулины, или антитела, грающие основную роль в системе гуморального иммунитета, среди риродных белковых структур являются одними из наиболее сложно рганизованных молекул. Первостепенная роль антител в обеспечении ммунной защиты организма обуславливает актуальность и масштабность груктурно-функциональных исследований иммуноглобулинов. Однако на їгодняшний день еще больший интерес к проблеме обусловлен широким тектром практического использования антител в иммуноферментном и адиоиммунном анализах, для цитотоксической иммунотерапии и ммуновизуализацли раковых опухолей.
Для такой сложной молекулы как иммуноглобулины получение счерпывающих характеристик фолдинга невозможно без анализа двух групп кспериментальных объектов - "полноразмерных" иммуноглобулинов и екомбинаптных "укороченных" антител со сниженным числом доменов.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа была выполнена в лаборатории химии белка [нститута биоорганической химии ПАН Беларуси. Часть исследований была ыполнена в рамках темы "Исследование принципов формирования, габилизации и активации природных и рекомбинантных антител для создания а их основе новых средств иммунодиагностики и иммунотерапии", ыполняемои в период с 1996 - 2000 гт. в соответствии с Государственной рограммой фундаментальных исследований п области биологических наук Органический синтез, структура и функция биополимеров и
низкомолекулярных биорегуляторов" (№ госрегистрации 19961101). Кроїш этого, частично исследования проведены в рамках следующих научно исследовательских программ Фонда фундаментальных исследовани? Республики Беларусь: "Принципы стабилизации молекулы, динамик? структурных состояний и функциональная активность иммуноглобулинов v рекомбинантных антител" (проект Б95-211), № госрегистрации 19961092: "Новый класс химерных иммунотоксинов - энзимо-иммунотоксины экспрессия, стабильность и активность" (проект Б98-221), № госрегистращн 19992578; "Рекомбинантный VL домен моноклопального иммуноглобулинг IgG2a: экспрессия, очистка и структурно-функциональное исследование' (проект Б98М-080), № госрегистрации 19992576; программы Министерства здравоохранения: "Изучить структурные изменения иммуноглобулинов G с помощью разработанных новых тест-систем на основе белка А у детей с онкогематологическими заболеваниями", № госрегистрации 19982881.
Цель и задачи исследования. Цель данного исследования состоит в установлении корреляции между конформацией, стабильностью и активностью моноклональных антител в сравнении с рекомбинантным укороченным аналогом - одноцепочечным Fv фрагментом - комбинацией структурно-физического и функционального подходов. В соответствии с этим в настоящей работе ставились следующие задачи: 1) исследование термодинамической стабильности моноклональных антител субклассов IgGl и IgG2a в широком диапазоне концентраций денатурантов, рН и температур; 2) полифункциональный анализ моноклональных антител для характеристики взаимодействия пространственно разобщенных структурных элементов мйлекулы иммуноглобулинов; 3) разработка эффективного метода экспрессии, очистки и фолдянга рекомбинантного одноцепочечного scFv фрагмента моноклопального антитела F11 (субкласс IgG2a) в растворимом и активном виде; 4) исследование термодинамической стабильности рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента.
Объект и предмет исследования. Объектом исследования являлись три мышиных моноклональных антитела двух субклассов, IgGl и IgG2a, и двухдоменныи рекомбинантный scFv фрагмент моноклопального антитела субкласса IgG2a, экспрессированный в клетках Escherichia coli. Моноклональиые антитела несут идиотипические различия (по строению антигенсвязывающего центра в вариабельных доменах) и изотипические (по строению константных доменов тяжелой цепи). Основным предметом исследования стали промежуточные по степени упорядоченности молекулы структурные состояния белков.
Гипотеза. Анализ литературных данных и предшествующих результатов лаборатории позволил предположить, что: 1) существуют стабильные в реальном времени промежуточные структурные состояния иммуноглобулинов, не описанные ранее и потому представляющие интерес с точки зрения механизмов фолдинга и функционирования иммуноглобулинов в процессе их практического применения; 2) рекомбинантные одноцепочечные Fv фрагменты
в принципе могут обладать конформационными свойствами, отличными от нативных иммуноглобулинов.
Методология її методы проведенного исследования. Целенаправленное получение и изучение различных конформациошшх состояний и структурных вариантов иммуноглобулинов комбинацией структурно-физического и функционального подходов представляет основной методологический подход. Использованная комбинация методов включала дифференциальную сканирующую калориметрию, круговой дихроизм и флуоресцентную спектроскопию для анализа вторичной и третичной структуры, а также иммунохимический анализ для определения функциональной активности и характера взаимодействия активных центров исследованных молекул.
Научная новизна и значимость полученных результатов. Практически все полученные в рамках настоящей работы результаты, включая экспериментальные данные и сделанные на их основе заключения, отвечают требованиям новизны.
Впервые получен весь значимый набор термодинамических параметров,
описывающих копформационную стабильность "полноразмерных"
моноклоналышх антител и рекомбинаптного одноцепочечного Fv фрагмента в широком диапазоне рН, стабилизирующих различные структурные состояния. Установлена общая схема фолдингатрех иммуноглобулинов субклассов IgGl и IgG2a мыши, включающая между нативным (N) и полностью развернутым (U) состояниями, в порядке снижения структурной организации, декооперированные N^i и Ни состояния, частично развернутое 1-состояние, а также "альтернативно свернутое" А-состояние.
Па примере взаимодействия иммуноглобулинов субкласса IgG2a мыши с белком А из Staphylococcus aureus впервые обнаружено, что аффинность связывания белка А как функционального аналога Fcy-рецепторов иммуноглобулинов может изменяться в зависимостн от индивидуальных структурных особенностей вариабельных доменов иммуноглобулинов. Показано, что особенности строения пшервариабельных участков антител способны оказывать влияние на термодинамическую стабильность иммуноглобулинов одного субкласса и осуществлять тонкую "подстройку" механизмов взаимодействия пространственно разобщенных функциональных центров иммуноглобулинов.
Разработан высокоэффективный метод экспрессии, очистки и рефолдинга рекомбинаптного одноцепочечного Fv фрагмента в растворимой форме из бактериальных тел включения. Метод основан на оптимизации условий экспрессии целевого белка с высоким удельным содержанием в телах включения, а также протокола очистки в денатуранте и рефолдинга. Применение контролируемого ступенчатого диализа очищенного рекомбинаптного белка позволило добиться близкого к 100% выхода рефолдинга рекомбинаптного Fv фрагмента в высокой концентрации.
Впервые на примере рекомбинаптного одноцепочечного Fv фрагмента
показана функциональная активность промежуточного структурного состояния белка, подобного "расплавленной" глобуле. Такие промежуточные конформации традиционно относились к группе компактных денатурированных состояний. Установлено, что конформация функционально активного scFv фрагмента при физиологических условиях характеризуется значительно измененной вторичной и дестабилизированной третичной структурой. Этот результат представляет собой новые данные о механизмах фолдинга и стабилизации молекулы scFv фрагментов иммуноглобулинов и полиглобуляркых белков в целом.
Практическая и социальная значимость полученных результатов. Полученные в настоящей работе экспериментальные данные о конформационном состоянии и динамике фолдинга моноклональных антител имеют прямое отношение к ряду физиологических процессов. Такими процессами являются, например, транслокация иммуноглобулинов через клеточные мембраны, направляемая коыформационными переходами в условиях снижения рН внутри и вне клетки, а также взаимодействие с клеточными рецепторами. Кроме того, наши данные позволяют предложить адекватные модели поведения иммуноглобулинов во многих современных иммунобиотехнологических процессах (например, широко применяемые аффинные хроматографии на стафилококковых белках А и G, на иммобилизованном антигене, а также методы модификации антител). В соответствии с этим, результаты работы могут быть использованы для модификации существующих и разработки новых усовершенствованных методов получения иммуноглобулинов и их структурных аналогов для практического использования в иммунодиагностике и иммунотерапии. Социальная значимость представленного исследования определяется, прежде всего, возможностью конструирования и использования улучшенных иммунотерапевтических и диагностических агентов нового поколения на основе рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента, высокоэффективный метод получения которого разработан в рамках представленного исследования.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Характеристика рН-индуцированных конформационных переходов
моноклональных антител субклассов IgGl и IgG2a с помощью комбинации
термодинамического и спектроскопических подходов, что позволило
установить общую схему фолдинга, включающую, по меньшей мере, четыре
макроскопических состояния, промежуточных по степени структурной
организации между нативным (N) и полностью развернутым (U) состояниями.
2. Выявление особенностей связывания белка А стафилококка с двумя
моноклональными антителами одного субкласса IgG2a мыши, находящихся в
комплексе с антигеном, позволило установить, что аффинность связывания
белка А как функционального аналога Fcy-рецепторов иммуноглобулинов
может изменяться в зависимости от индивидуальных структурных
особенностей антител, которые локализованы в гипервариабельных участках
штигенсвязывагощего центра.
3. Установление (информационных характеристик рекомбинантного
эдноцепочечного Fv фрагмента (scFv) с помощью дифференциальной
:каиирующей калориметрии, КД и флуоресцентной спектроскопии позволило
показать, что scFv фрагмент при физиологических условиях обладает
свойствами частично структурированного состояния, характерного для
эелковых структур в условиях неполной денатурации, однако обладает
функциональной активностью.
4. Оптимизация условий экспрессии, очистки, рефолдинга и применение
контролируемого диализа для разработки высокоэффективного метода
получения рекомбинантного Fv фрагмента моноклоналышго антитела F11
[субкласс JgG2a мыши) в растворимом и активном виде, обеспечивает близкий
к 100% выход рефолдинга рекомбинантного белка.
Личный оклад соискателя. Все исследования, связанные с физико-химическими структурными исследованиями фолдинга и стабильности моноклопальных антител к ферритину и рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента, их термодинамическим анализом, разработкой аналитических систем и проведением функционального анализа объектов исследования с помощью конформационных "зондов", выполнены автором самостоятельно. При проведении калориметрических исследований соискатель пользовался консультациями к.б.н. А.П. Власова. Плазмида, несущая геи рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента предоставлена к.х.н. И.А. Беспаловым и д.б.н. СМ. Деевым (последний - ИМБ РАН, Москва), а плазмида с геном VL домена получена к.х.н. СП. Марцевым и докторами А. Коцци и П. Арозио (Институт Сан-Рафаэле, Милан). Полистирольные шарики с активированными фенальдегидными группами предоставлены В.В. Шманаем, ИФОХ НАНБ. Экспрессия, очистка и рефолдинг изолированного Vl домена осуществлены к.х.н. СП. Марцевым, к.х.н. З.И. Кравчук и аспирантом А.П. Дубновицким, секвенирование очищенного рекомбинантного Fv фрагмента проведено в ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва. На стадиях планирования работы и критического обсуждения полученных результатов соискатель пользовался консультационной помощью к.х.н., в.н.с. ИБОХ НАНБ СП. Марцева.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на II Европейском симпозиуме Protein Society [Cambridge, 1997), на 17-ом Международном Конгрессе биохимиков и молекулярных биологов (San Francisco, 1997), на международной конференции "Protein structure, stability and folding: fundamental and medical aspects (Moscow, 1998), на II и III съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков [Минск, 1996, 1998). Результаты диссертации неоднократно обсуждались на заседаниях лаборатории химии белка ИБОХ НАН Беларуси.
Онубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 статьи и тезисы 6 докладов. Общий объем опубликованных материалов составляет 32 страницы.
Структура її обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы. В главе 1 приводится обзор литературных данных о структурно-функциональных исследованиях рекомбинантных одноцепочечнык Fv фрагментов и "полноразмерных" иммуноглобулинов; обзор содержит анализ методов изучения стабильности белков, данные о стабильности одиоцегючечных Fv фрагментов и IgG. В главе 2 представлены результаты исследований, в главе 3 - обсуждение полученных результатов, а в главе 4 -экспериментальные методы. Работа изложена на 119 страницах рукописного текста, содержит 30 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 184 ссылки.
![Иммунологические последствия индукции антител к IFN#3[Г]#1 и IL-4 их пептидными фрагментами](/i/i/4597/290118.png "Иммунологические последствия индукции антител к IFN#3[Г]#1 и IL-4 их пептидными фрагментами Шевелев Сергей Владимирович")
