Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Источники, структура и механизм действия р-галактозидаз 6
1.1. Классификация р-галактозидаз 6
1.2. Р-Галактозидазы растений 8
1.3. Р-Галактозидазы млекопитающих и человека 9
1.4. Р-Галактозидазы микроорганизмов 14
1.4.1. Бактериальные Р-галактозидазы 14
1.4.2. Грибные и дрожжевые Р-галактозидазы 16
1.4.3. Третичная структура р-галактозидаз 18
1.5. Механизм каталитического действия р-галактозидаз 24
1.5.1. Каталитическая активность Р-галактозидаз 24
1.5.2. Механизм каталитического действия р-галактозидаз 29
1.5.3. Активаторы и ингибиторы Р-галактозидаз 33
Глава II. Биокатализаторы на основе Р-галактозидазы 37
2.1. Практическое использование Р-галактозидаз 37
2.2. Адсорбция и другие физические методы иммобилизации Р-галактозидаз 42
2.3. Химические методы иммобилизаци р-галактозидаз (ковалентное связывание) 47
2.4. Свойства и применение иммобилизованных Р-галактозидаз... 52
Глава III. Объекты и методы исследования 60
3.1. Характеристика ферментов и использованных химических реактивов 60
3.1.1. Ферменты 60
3.1.2. Химические реактивы 62
3.1.3. Буферные растворы 63
3.2. Определение ферментативной активности р-галактозидазы 64
3.3. Методика изучения термоинактивации фермента 67
3.3.1. Термоинактивация Р-галактозидазы в растворе 67
3.3.2. Термоинактивация Р-галактозидазы в адсорбционных слоях 67
3.4. Адсорбционная иммобилизация р-галактозидазы 68
3.4.1. Адсорбционная иммобилизация р-галактозидазы на силикагеле 68
3.4.2. Получение совместных адсорбционных слоев фермента и полисахаридов 69
3.5. Количественное определение белка методом Брэдфорда 69
3.6. Оценка пофешностей в определении экспериментальных величин 70
Глава IV. Механизм реакции гидролиза гликозидной связи субстрата в активном центре Р-галактозидазы из Escherichia coli в рамках теории цепей перераспределения связей 73
4.1. Механизм реакции. 73
4.2. Влияние метанола на гидролиз орто- и пара-нитрофенил-Р-галактопиранозидов Р-галактозидазой из Escherichia coli ... 76
4.3. Структурный анализ аминокислотных последовательностей . Р-галактозидаз из различных источников 83
Глава V. Термоинактивация Р-галактозидаз из различных источников 88
5.1. Ассоциативно-диссоциативные процессы в растворах р-галактозидаз 88
5.1.1. Диссоциация и удельная активность олигомеров Р-галактозидаз 89
5.1.2. р-Галактозидаза животного происхождения из печени быка 94
5.1.3. Р-Галактозидаза бактериального происхождения из Escherichia coli 96
5.1.4. Р-Галактозидаза дрожжевого происхождения из Kluyveromyces fragilis 99
5.1.5. Удельные активности олигомерных форм р-галактозидаз 101
5.2. Термоинактивация Р-галактозидаз различного происхождения 102
5.2.1. Кинетические механизмы термоинактивации 102
5.2.2 Диссоциативная термоинактивация р-галактозидаз 107
5.2.3. Индукционный период на кривых термоинактивации р-галактозидаз 115
5.3. Влияние различных факторов на стабильность р-галактозидаз 117
5.3.1. Активность и стабильность Р-галактозидаз 118
5.3.2. Влияние температуры на стабильность Р-галактозидаз 120
5.3.3. Влияние катионов магния на стабильность р-галактозидазы из Escherichia coli 123
5.4. Термоинактивация и параметры стабильности олигомерных ферментов 125
5.5. Некоторые особенности термоинактивации Р-галактозидазы животного происхождения из печени быка 127
Глава VI. Адсорбционные слои р-галактозидазы из Penicillium canescens на силикагеле и их стабилизация полисахаридами 133
6.1. Адсорбционная иммобилизация Р-галактозидазы 133
6.1.1. Адсорбция р-галактозидазы Penicillium canescens на силикагеле 133
6.1.2. Каталитические свойства адсорбционных слоев Р-галактозидазы 135
6.1.3. Кинетика адсорбции Р-галактозидазы на силикагеле 137
6.2. Совместные адсорбционные слои р-галактозидазы и полисахаридов на поверхности силикагеля 143
6.2.1 Каталитические свойства совместных адсорбционных слоев Р-галактозидазы и полисахаридов 144
6.2.2. Термостабильность адсорбционных слоев р-галактозидазы... 146
Выводы 151
Список литературы 153
- Механизм каталитического действия р-галактозидаз
- Определение ферментативной активности р-галактозидазы
- Влияние метанола на гидролиз орто- и пара-нитрофенил-Р-галактопиранозидов Р-галактозидазой из Escherichia coli
- Термоинактивация Р-галактозидаз различного происхождения
Введение к работе
Актуальность проблемы р-Галактозидаза - фермент углеводного обмена растений, микроорганизмов, животных и человека. Одна из функций фермента в организме млекопитающих - гидролиз молочного сахара лактозы на два легко усваиваемых моносахарида - глюкозу и галактозу. Значительная часть населения Земли из-за недостатка этого фермента не способна усваивать молочные продукты, поэтому препараты Р-галактозидазы используют при производстве безлактозных продуктов для детского и диетического питания. В последние годы обсуждается перспектива использования р-галактозидаз для производства обладающих бифидогенными свойствами олигосахаридов, которые также входят в состав лечебно-профилактических продуктов питания. В этом случае используется трансферазная активность фермента. р-Галактозидазы находят применение в медицине при лечении и диагностике некоторых заболеваний, при решении экологических проблем, связанных с загрязнением окружающей среды отходами молочной промышленности, а также могут быть использованы в лабораторном синтезе. В связи с этим проблема получения высокоактивных и стабильных катализаторов на основе иммобилизованных Р-галактозидаз актуальна в настоящее время. Несмотря на то, что нестабильность ферментов - одна из причин, ограничивающих их применение в качестве промышленных катализаторов, исследования стабильности р-галактозидазы носили чисто качественный характер. Сравнительные физико-химические исследования активности и стабильности Р-галактозидаз из различных источников до сих пор не проводились.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование активности и стабильности Р-галактозидаз из различных источников и получение активных и стабильных катализаторов на основе иммобилизованной Р-галактозидазы.
Научная новизна Впервые проведено систематическое исследование р-галактозидаз из четырех различных источников бактериального (Escherihia coli), дрожжевого (Kluyveromyces fragilis), грибного (Penicillium canescens) и животного происхождения (печень быка). Проанализированы общие закономерности механизма их каталитического действия, рассмотрены кинетические механизмы термоинактивации и влияние различных факторов на ^активность и стабильность ферментов.
Впервые определены активности различных олигомерных форм Р-галактозидаз, исследованы процессы диссоциации олигомеров и показана их роль в стабилизации и дестабилизации фермента.
Впервые предложены критерии стабильности, которые можно использовать и для других олигомерных ферментов: температура исчезновения индукционного периода на кинетических кривых термоинактивации; число промежуточных стадий процесса, не сопровождающихся потерей ферментом каталитической активности: «критическая» температура смены кинетического режима термоинактивации.
Результаты исследования позволили оптимизировать стабильность и
каталитические свойства этих ферментов и предложить способ получения
гетерогенного катализатора на основе иммобилизованной Р-галактозидазы из грибов
Penicillium canescens. Для стабилизации адсорбционных слоев р-галактозидазы
использованы полисахариды растительного (амилоза)г и лшиишиїи—(ширин)
происхождения. І РОС- НАИНОНАлгнА»
W:
і « ад
Практическая значимость работы Получен активный и стабильный гетерогенный катализатор на основе р-галактозидазы, иммобилизованной на поверхности широкопористого гидротермального силикагеля в присутствии полисахаридов.
Предложены критерии стабильности, которые могут быть использованы для ферментов олигомерного состава.
Апробация работы Основные результаты работы были представлены на международной конференции «Biocatalysis-2000: Fundamentals and application» (Москва, Россия, 2000); II Всероссийском научном совещании «Высокоорганизованные каталитические системы» (Москва, Россия, 2000); международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001» и «Ломоносов-2005» (Москва, Россия).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 6 статей и 4 тезисов докладов.
Объем и структура работы Диссертационная работа состоиг из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. В литературном обзоре, состоящем из двух глав, представлены имеющиеся в литературе структурные данные и свойства Р-галактозидазы из различных источников, а также рассмотрены различные способы иммобилизации р-галактозидазы и свойства полученных на их основе гетерогенных катализаторов. В экспериментальной части даны методики приготовления рабочих растворов, приведены кинетические параметры исследованных ферментов и методики проведения экспериментов. В главе результаты и обсуждение, состоящей из трех разделов, представлены полученные в работе экспериментальные данные и проведен их анализ. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка и 28 таблиц. Список цитируемой литературы включает 203 наименования.
Механизм каталитического действия р-галактозидаз
Принято считать, что природный субстрат (3-галактозидазы - дисахарид лактоза, однако для некоторых ферментов, в том числе и животного происхождения лактоза не является субстратом. Наиболее часто используемые синтетические субстраты - орто- и пара-нитрофенил-Р-О-галактопиранозид. Известны и другие субстраты р-галактозидаз. Например, ферменты растительных источников проявляют каталитическую активность в отношении пектинов, целлюлозы и ряда п-нитрофенилглюкозидаз [6]. Из различных тканей кролика выделили три вида фермента с различной субстратной специфичностью [41]. Кислая р-галактозидаза гидролизовала только синтетический субстрат 4-метилумбеллиферил-р-О-галактозид; фермент, обнаруженный в клеточной фракции, гидролизовал и другие синтетические гликозиды, но не был активен по отношению к лактозе, фермент, выделенный из растворимой (цитозольной) фракции тканей печени, почек и тонкого кишечника, гидролизовал арил-P-D-глюкозиды, -фукозиды и -галактозиды, но также не обладал активностью к лактозе. р-Галактозидаза, гидролизующая лактозу, была обнаружена только в тканях тонкого кишечника молодых особей [41]. Нейтральная Р-галактозидаза, выделенная из печени быка, активна только в отношении нитрофенил-Р-галактозида [37]. В таблице 7 приведены каталитические свойства различных р-галактозидаз по отношению к некоторым природным и наиболее часто используемым в научных исследованиях синтетическим субстратам. Как видно из приведенных данных, различные Р-галактозидазы проявляют свою каталитическую активность в широком интервале значений рН: ферменты из растительных источников, грибные и кислые р-галактозидазы животных и человека активны при рН 2.5-4.5; бактериальные, дрожжевые и часть Р-галактозидаз животных и человека активны при нейтральных рН (6-7). Температурный интервал, в котором Р-галактозидазы проявляют каталитическую активность 5-60С. Кинетика реакций с участием р-галактозидаз хорошо описывается в рамках уравнения Михаэлиса-Ментен. Если константу Михаэлиса определяли для различных субстратов, то ее значение уменьшается в ряду лактоза - оНФГ - пНФГ, что свидетельствует о меньшем сродстве данных ферментов к лактозе по сравнению с синтетическими субстратами. Например, для бактериального фермента из E.Coli значение константы Михаэлиса в приведенном ряду субстратов уменьшается дважды приблизительно на порядок [78, 79].
Константа Михаэлиса зависит от температуры [80], для растительных р-галактозидаз изменяется в процессе созревания плодов [83]. Большое влияние повышение температуры оказывает и на активность фермента. Так активность р-галактозидазы из Kluyveromyces fragilis [80] составляет при температурах 5, 25 и 40С соответственпр 54, 225 и 580 мкмоль/мин на 1 мг фермента. Сравнение каталитических свойств Р-галактозидазы Kluyveromyces fragilis с ферментом из Escherichia coli показало, что бактериальный более активен при гидролизе синтетического субстрата, тогда как при гидролизе лактозы более активными оказались препараты из дрожжевого фермента [84]. Для проведения каталитической реакции используются различные буферные системы. Наиболее часто применяют, фосфатные, нитратные и трис-буферные системы [84]. При использовании лактозы в качестве субстрата используют буферные растворы сложного состава, приближенные к солевому составу молока. Р-Галактозидаза способна гидролизовать не только гликозидные, но и сложные эфирные связи, причем скорость гидролиза гликозидной связи в пара-нитрофенил-Р-галактозиде и эфирной связи в парагидроксибензоил Р-галактозе одинакова [85]. Помимо гидролазной активности (гидролиз Р-галактозидной связи) Р-галактозидазы могут проявлять и трансферазную активность, дисахарид в этом случае является субстратом для синтеза более сложных олигосахаридов. Такие свойства были обнаружены у различных Р-галактозидаз. Они были применены для синтеза линейных олигосахаридов, моно- и дисахаридных коныогатов, нуклеозидов. Выход и распределение продуктов зависит от источника фермента, условий проведения реакции, в частности от природы добавленного растворителя [86], и субстрата, используемого в качестве донора галактозила [87]. Например, р-галактозидаза из Kluyveromyces fragilis продуцирует главным образом трисахариды, а фермент из Bacillus circulans - олигосахариды более сложного состава [88]. В реакции, катализируемой грибными Р-галактозидазами, в основном образуются Р(1-6) олигосахариды. В случае бактериального фермента наряду с Р(1-6) образуются Р(1-4)-дисахариды [89, 90]. Таким образом решаются проблемы снижения конкурентного гидролиза с целью усиления протекания трансгликозилирования по межмолекулярному механизму и увеличения выхода целевых продуктов реакции. В таблице 8 приведены значения процентного содержания галактоолигосахаридов в продуктах реакции трансгликозилирования лактозы, катализируемого р-галактозидазами из различных микроорганизмов. Из представленных в таблице р-галактозидаз максимальную трансгликрзидазную активность проявляет фермент дрожжевого происхождения из Bullera singularis [73]. Через 23 часа проведения реакции с лактозой в оптимальных условиях (Т=50, рН 5) содержание олигосахаридов в реакционной смеси составило 50%, причем основными продуктами являются три- и тетрасахариды, их доля составила 21 и 20% соответственно, массовая доля пентасахаридов оказалась равной 9%. Надо отметить, что в данных условиях проведения реакции трансфертная активность вдвое превышает гидролазную активность фермента, и содержание в продуктах моносахаридов глюкозы и галактозы составляет 21%. Однако кривая накопления олигосахаридов проходит через максимум, и, если время реакции превышает 23 часа, наблюдается некоторое уменьшение содержания галактоолигосахаридов, сопровождающееся увеличением концентрации моно- и дисахаридов. Авторы отмечают тот факт, что в случае использования в качестве субстрата творожной сыворотки конверсия галактоолигосахаридов и скорость реакции несколько выше, чем в реакции с чистой лактозой.
Еще одним продуктом действия р-галактозидазы на лактозу (помимо моносахаридов и олигосахаридов различного состава) является аллолактоза (галактозил-Р-О-(І-б)глюкопираноза) [79]. Этот дисахарид образуется в результате внутримолекулярного трансгалактозилирования, путем прямого переноса галактозила из 4 в 6 положение остатка глюкозы внутри фермент-субстратного комплекса. Лактоза и аллолактоза являются субстратами в последующих реакциях межмолекулярного трансгликозилирования. На отношение трансферазной активности к гидролазной в реакциях р-галактозидазы (E.coli) на лактозу также влияет ряд факторов. Отношение уменьшается при рН 6, в отсутствие ионов Mg2+ и в реакциях с сс-лактозой [79]. Гидролиз гликозидов можно рассматривать как перенос галактозила на гидроксильную группу молекул воды. Природным субстратом для р галактозидазы являются О-гликозиды, однако в реакциях трансгликозилирования субстратом могут служить фториды, азиды р-галактопиранозила, а также различные галактозид пир идиниевые соли [91]. Р-Галактозидаза участвует в реакциях переноса галактозы к некоторым углеводам: фруктозе (при получении лактулозы), глюкозе, N-ацетилглюкозамину и N-ацетилгалактозамину. Добавление галактозы оказывает ингибирующее действие на трансферазную активность фермента, тогда как глюкоза ускоряет реакцию трансгалактозилирования [37]. В настоящее время биотехнологический синтез с использованием Р-галактозидаз во многих случаях становится альтернативой химическому синтезу. Так, например, Р-галактозидаза из печени быка и из E.coli успешно использованы для гликозилирования моноаллилового и монобензилового эфиров [92]. Механизм каталитического действия р-галактозидаз до конца не выяснен, однако развитие новых методов позволило исследователям выявить наиболее важные для катализа аминокислотные остатки в активном центре фермента. Большая заслуга в этом принадлежит M.Sinnott и R.E.Huber. Работы последнего посвящены исследованию р-галактозидазы методом сайт-специфического-мутагенеза, суть которого заключается в замещении отдельных аминокислотных остатков в молекуле фермента [93-95, 108-112]. Данный метод позволяет определять влияние изменений в структуре фермента на его активность и тем самым помогает выяснить, какую функцию выполняет замещенная аминокислота.
Большинство исследований касаются наиболее изученной Р-галактозидазы из Escherichia coli. На рисунке 2 показаны аминокислотные остатки и катионы магния, входящие в состав активного центра р-галактозидазы из E.coli по данным рентгеноструктурного анализа [51]. Для проявления каталитической активности этого фермента помимо магния необходимы ионы Mn2+, Na+ или К+. Методом сайт-специфического-мутагенеза было обнаружено, что лигандами ионов магния в активном центре р-галактозидазы являются три аминокислотных остатка: Glu-461 [93], His-418 [94] и Glu-416 [95]. По данным
Определение ферментативной активности р-галактозидазы
Для определения активности (5-галактозидазы использовали синтетические субстраты 2-нитрофенил-(3-0-галактопирапозид (орто-НФГ) и 4-нитрофенил-р-О-галактопиранозид (пара-НФГ). Под воздействием фермента происходит гидролиз Р-галактозидной связи: Продуктами реакции являются галактоза и о-нитрофенол (о-НФ) или п-нитрофенол (п-НФ) соответственно. Нитрофенолы в щелочной среде окрашивают растворы в желтый цвет, имеют следующие максимумы поглощения: о-НФ при длине волны X = 420 им, п-НФ А. = 400 нм, и легко определяемы спектрофотометричсски. Остальш іе компоненты в этой области спектра не активны. Концентрацию активного фермента определяли, исходя из того, что количество образовавшегося за единицу времени продукта реакции пропорционально концентрации активной формы фермента. Скорость ферментативной реакции определяли из начального линейного участка кинетической кривой накопления о-НФ или п-НФ и выражали в о.е./мин или мкмольБ/мин. Предварительно строили калибровочную кривую по орто- и пара-нитрофенолу (см.рис.5), из которой находили коэффициент пересчета оптической плотности в концентрацию (мкмоль о-НФГ или п-НФГ). Активность фермента во всех случаях определяли при комнатной " температуре, ферментативную реакцию проводили в соответствующих буферных растворах. При работе с грибной Р-галактозидазой использовались фосфат-цитратные буферные растворы, для трех других ферментов использовали фосфатные буферные растворы. При определении активности Р- галактоз и лазы дрожжевого. бактериального и животного происхождения (рН 7.5) реакцию проводили непосредственно в кювете толщиной 0.5 или 1 см. Объем реакционной смеси составлял 2 мл. Состав реакционной смеси был следующим: - 0,02 ч-0,2 мл раствора фермента определенной концентрации, - 0.05 -1,8 мл раствора субстрата с концентрацией fS]0 = 10"2+ 4-Ю"3 М; - буферный раствор.
Для измерения оптической плотности растворов использовали фотоэлектроколориметр КФК-2МП и спектрофотометр Genesys-5 (А=400нм, 420 нм 1=1 см). Определение активности р-галактозидазы Penicillium canescens по этой методике невозможно, поскольку ферментативная реакция в этом случае идет в кислой среде, где не проявляется желтое окрашивание о-нитрофенола. В этом случае ферментативную реакцию проводили в пробирке, из которой через определенные промежутки времени отбирали пробу (0,5 мл) и вносили ее в пробирку с 1,5 мл 1 М раствора Na2C03 для остановки каталитической реакции и проявления характерного окрашивания нитрофенола. Из прямолинейного участка кинетических кривых в координатах оптическая плотность (D) - время (t), определяли начальную скорость реакции, которая характеризовала каталитическую активность фермента. Зависимость ферментативной активности Р-галактозидазы грибного происхождения от концентрации белка в растворе в интервале использованных в работе концентраций представлена на рисунке 6. Определение активности иммобилизованной р-галактозидазы Penicillium canescens проводили при комнатной температуре по аналогичной методике: в пробирку с точной навеской гетерогенного образца добавляли раствор субстрата в фосфат-цитратном буфере (рН 4.2) и через определенные промежутки времени из контактного раствора отбирали пробы, которые помещали в 1М раствор Na2C03 и анализировали спектрофотометрически на содержание о-нитрофенола. За меру активности иммобилизованной Р-галактозидазы принимали начальную скорость реакции При проведении опытов по термоинактивации всех Р-галактозидаз использовали стандартную методику. Пробирку с раствором фермента помещали в термостат с предварительно заданной температурой и через определенные интервалы времени дозатором отбирали пробы для определения каталитической активности. Объем отбираемой пробы варьировали от 0.02 до 0.2 мл в зависимости от активности фермента. Термоинактивацшр каждого фермента проводили в его оптимуме рН - активности. Температурные интервалы определяли опытным путем: максимальной была температура, при которой фермент терял половину своей активности менее чем за 10 минут, минимальной была температура 4С. Следует отметить, что потеря каталитической активности растворами ферментов при хранении их в холодильнике незначительна: для бактериальной Р-галактозидазы к1(,ф составляет 5.0 10" с" , а для дрожжевой -1.5 10"6 с 1, два других фермента оказались более стабильными. Максимальная температура, при которой оказалось возможным исследовать кинетику процесса составила 42 для р-галактозидазы из Kluyveromices fragilis, 47 - для животного фермента из печени быка, 52 - для бактериальной р-галактозидазы из Escherichia coli и 62 - для фермента из Penicillium canescens. Поскольку Р-галактозидазы очень сильно различались по своей каталитической активности (см. табл. 12) экспериментально были определены пределы допустимых концентраций для каждого из них. При исследовании процесса термоинактивации использованы растворы с различной концентрацией ферментов: от 5 10 мг/мл (4.3 10 М в расчете на мономер) для бактериального фермента и до 5 мг/мл (1.25 10"4 М в расчете на мономер) для Р-галактозидазы животного происхождения. Термоинактивацию грибной Р-галактозидазы из Penicillium canescens, адсорбированной на поверхности широкопористого силикагеля в присутствии полисахаридов или в их отсутствие проводили по двум методикам: 1) определенные навески гетерогенного биокатализатора помещали в пробирки с буферным раствором (оптимум рН активности фермента) и выдерживали в термостате при необходимой температуре в течение разных периодов времени.
Определяли активность каждого образца по стандартной методике; 2) использовали один образец биокатализатора, и через определенные промежутки времени определяли его активность. Для адсорбционной иммобилизации фермента в качестве носителя использовали широкопористые гидротермальные силикагели с удельной поверхностыо 40 и 23 м/г и диаметром пор 1500-2000 А, которые предварительно были подвергнуты стандартной очистке. Непосредственно перед использованием силикагель прокаливали в течение нескольких часов при 200С. Адсорбцию грибной Р-галактозидазы из Penicillium canescens проводили из ее растворов в фосфат-цитратном буфере (рН 4.2) при температуре 4С. Бюксы, содержащие точную навеску силикагеля и 4 мл раствора фермента заданной концентрации (0,06 - 0,6 мг(белка)/мл) помещали в холодильник и периодически проводили анализ концентрации фермента по каталитической активности. Время адсорбции варьировали от 30 минут до 12 суток. Полученные гетерогенные образцы промывали несколько раз определенным количеством буферного раствора до тех пор, пока десорбцию белка с поверхности силикагеля обнаружить не удавалось. Количество адсорбированного белка определяли сравнением концентраций Р-галактозидазы в исходном и контактном растворах и рассчитывали по формуле: где С0 и С- концентрация в исходном и контактном растворах соответственно, Р- навеска силикагеля, V - объем раствора. Для получения совместных адсорбционных слоев фермент - полисахарид были использованы полисахариды растительного (крахмал) и животного (гепарин) происхождения. Данная методика отличалась от предыдущей тем, что в бюксы помимо раствора фермента и адсорбента добавляли полисахарид. Ранее [166] было показано, что совместная адсорбция полисахарида и фермента -оптимальный способ, позволяющий получить наиболее активные биокатализаторы. Иммобилизация Р-галактозидазы в присутствии гепарина. Точные навески фермента и гепарина растворяли в определенном объеме 0,2 М фосфат -цитратного буферного раствора (рН 4.2); 4 мл полученного раствора помещали в бюкс, содержащий точную навеску силикагеля (Буд = 40 м2/г) и проводили адсорбцию при 4С. Использовали смеси Р-галактозидазы и гепарина при молярном соотношении фермент : полисахарид, равном 1 : 20; 1 : 2; 2 : 1.
Влияние метанола на гидролиз орто- и пара-нитрофенил-Р-галактопиранозидов Р-галактозидазой из Escherichia coli
Рассмотренному выше механизму соответствует трехстадийная кинетическая схема с участием двух промежуточных соединений и образованием двух продуктов реакции на второй и третьей стадии, соответственно. E - фермент (в данном случае (3-галактозидаза); S - субстрат (орто- нитрофенил-Р-галактопиранозид (оНФГ) или пара-нитрофенил-р-галактопиранозид (пНФГ)); Xi=ESl - первое промежуточное соединение (фермент-субстратный комплекс); X2=ES2 - второе промежуточное соединение (галактозпл-фермент); P,=ROH -первый продукт реакции (орто- или пара-нитрофенол); P2=Gal - второй продукт реакции (галактоза). Эта схема детально проанализирована в литературе, поскольку такая трехстадииная схема описывает механизм катализа многих ферментов, например а-химотрипсина [172]. Кинетические параметры этой схемы в стационарных условиях выражаются следующими уравнениями: к2 и к}- константа скорости галактозидирования и дегалактозилирования соответственно, Ks - субстратная константа. Методы исследования механизма ферментативных реакций в стационарном режиме условно можно разделить на две группы: обратимое ингибирование или активация стадии ацилирования или гликозилирования ферментов и избирательное ускорение реакции деацилирования или дегликозирования ферментов в присутствии добавленных в среду нуклеофильных агентов [173]. Поскольку помимо реакции гидролиза (3-галактозидаза участвует в реакциях трансгликозилирования, присутствие нуклеофильных агентов, конкурирующих с молекулами воды, должно влиять на механизм действия фермента. Метод исследования механизма ферментативной реакции в присутствии нуклеофильных агентов получил название метода «иуклеофилыюго конкурирования». В энзимологии часто в качестве нуклеофильных агентов применяют спирты.
В данной работе мы использовали метанол, бутандиол-1,4 и бутандиол-2,3. На рисунке 8 показано максимальное изменение кинетических параметров гидролиза оНФГ (3-галактозидазой из Escherichia col і. полученное варьированием концентрации спиртов в реакционной смеси. Добавление спиртов приводит к значительному увеличению константы Михаэлиса, то есть к уменьшению сродства фермента к субстрату. Следует также отметить, что бутандиолы и метанол в различной степени влияют на скорость ферментативной реакции. В присутствие 0.2 М бутандиола-2,3 и тех же концентраций бутандиола-1.4 активность фермента увеличивается в 1.2 и 1.4 раза соответственно. Наибольшее влияние на скорость ферментативной реакции оказывает метанол: когда его концентрация в реакционной смеси достигает 0.75 М, активность р-галактозидазы из E.coli увеличивается более чем в 2 раза. Поэтому дальнейшее исследование проводилось с использованием метанола. Рассмотрим влияние метанола на кинетическую схему ферментативной реакции гидролиза гликозидной связи. Метанол вступает в реакцию на стадии дегликозилирования фермента согласно схеме (4): где N - добавленный нуклеофил (метанол), Рз - третий продукт реакции (метилгалактоза). В данном случае выражения для каталитической константы и константы Михаэлиса принимают вид: В ходе эксперимента мы регистрировали образование первого продукта реакции - орто-нитрофенола и пара-нитрофенола в реакциях гидролиза оНФГ и пНФГ соответственно. В стационарных условиях величины Км и константа скорости образования орто-нитрофенола возрастают с увеличением концентрации добавленного метанола, причем кривые зависимости в данном случае имеют тенденцию к насыщению (рис.9).
Это согласуется с предположением, что метанол, являясь нуклеофильным растворителем, конкурирует с молекулами воды согласно схеме (4). Рассчитанные кинетические параметры представлены в таблице 14. Каталитическая константа в реакции гидролиза о-НФГ в диапазоне концентраций метанола 0-1 моль/л варьирует в пределах 580-1280 мин"1. Поскольку спирты оказывают влияние на стадию дегалактозилирования, и в реакции с о-НФГ мы наблюдаем активацию фермента, то можно утверждать, что при гидролизе этого субстрата скорость-определяющей является стадия дегалактозилирования. Напротив, кинетические параметры гидролиза п-НФГ не зависят от концентрации метанола в реакционной смеси (рис.9, табл.14). Этот результат указывает на то, что в данном случае скорость-лимитирующеи является стадия галактозилирования фермента (кі«кз), на которую спирты не влияют, следовательно, ккат=к2. Константа скорости гликозилирования [3-галактозидазы из Е.соИ составляет 230 мин"1 (см.табл.14). Такие же результаты по влиянию метанола получены для фермента дрожжевого происхождения из Kluyveromyces lactis. Это может быть следствием единого механизма каталитического действия Р-галактозидаз, обусловленного сходством пространственного строения активных центров этих ферментов.
Этот вопрос более подробно рассмотрен в разделе 4.3. Нелинейность зависимости кинетических параметров от концентрации добавленного метанола может быть вызвана двумя причинами: специфическим связыванием метанола с галактозпл-фермептом Gali, то есть насыщением акцепторных центров связывания либо изменением рН среды, вызванным повышенными концентрациями метанола. В наших экспериментах влияние метанола на рН раствора можно исключить, поскольку объемное содержание метанола не превышало 4% [174]. Влияние метанола на активность (З-галактозидазы из E.coli исследовано и другими авторами [174-178]. В работе [175] в качестве субстратов использовали оНФГ и фенилгалактопиранозид (ФГ). Помимо метанола исследовалось также влияние диоксана на гидролиз этих субстратов. В присутствии диоксана, не являющегося нуклеофильным органическим растворителем, наряду с увеличением Км авторы работы [175] наблюдали некоторое уменьшение кат1 при гидролизе оНФГ. Влияние метанола и диоксана на гидролиз ФГ заключалось в некотором уменьшении ккат, тогда как значение Км при этом практически не изменяется. Регистрация образования второго продукта реакции (галактозы) в присутствии метанола позволила авторам [175] рассчитать константы скоростей отдельных стаднії процесса: к2 - константу скорости гликозилирования, к 3 и к4 - константы скоростей дегликозилирования и образования галактозы и метилгалактозы соответственно (таблица 15).
Термоинактивация Р-галактозидаз различного происхождения
Кинетические механизмы термоинактивации олигомерных ферментов проанализированы в работах О.М. Полторака и И.С. Чухрай [184-186]. Проведенные кинетические и структурные исследования показали, что необратимой инактивации фермента предшествуют процессы разрушения структуры конформационного замка (многоточечный контакт между белковыми глобулами в олигомере) и обратимая диссоциация олигомера на составляющие протомеры. Межбелковый контакт образуется и распадается в несколько стадий. В этот процесс могут быть включены низкомолекулярные эффекторы. Иногда конформационный замок можно рассматривать как стабильный межсубъединичный домен. Это заключение первоначально было сделано на основе результатов кинетических исследований термоинактивации олигомерных ферментов [184, 187] и впоследствии было подтверждено с привлечением данных РСА о структуре таких ферментов [185, 186]. В зависимости от белка, температуры и других факторов внешней среды реализуются различные механизмы термоинактивации, что проявляется в разнообразии экспериментальных кинетических зависимостей. Наиболее типичные из них представлены на рисунке 20. Рассмотрим возможные механизмы термоинактивации олигомерных ферментов и условия их осуществления более подробно. Необратимая инактивация первого порядка Если инактивация фермента происходит по кинетическому механизму необратимой инактивации первого порядка, кинетические зависимости спрямляются в координатах уравнения первого порядка (рис. 20а). Эффективные кинетические константы, определяемые в этом случае из экспериментальных данных, характеризуют только период полураспада активного белка и не дают информации о механизме процесса. Инактивация по схеме последовательных превращений первого порядка: При реализации этого механизма па кинетических кривых (рис. 20 б) существует индукционный период (т), в течение которого активность фермента остается постоянной.
Наличие индукционного периода на кинетических кривых можно объяснить, если предположить, что начальный этап разрушения связи между доменами представляет собой многоступенчатый процесс. В этом случае существует несколько «стабильных» и «нестабильных» промежуточных форм фермента. Если эти формы имеют примерно одинаковую каталитическую активность, кинетические кривые приобретают вид, приведенный на рис. 206. В течение индукционного периода (т) в контактном участке олигомера происходят скрытые структурные изменения, при этом возникает каталитически активный, но менее стабильный (способный к обрагимой диссоциации) олигомер. Если активной формой фермента являются димеры, а субъединицы неактивны, происходящие процессы можно отобразить следующей схемой: Кинетический анализ кривых термоинактивации с индукционным периодом [184] позволяет оценить минимальное число стадий, не сопровождающихся потерей ферментом каталитической активности, при многоступенчатом разрушении конформационного замка. Индукционный период будет наибольшим, когда все стадии в схеме (1) необратимы, а все константы скорости равны, т.е. когда схема (1) заменена на: Минимальное число промежуточных стадий процесса (п), не сопровождающихся потерей каталитической активности, и параметр 6 (см. рис. 21), определяемый по отрезку R, отсекаемому на оси ординат, связаны эмпирической формулой [184]: Определение параметра п дает информацию о свойствах ферментов, поскольку он является определенной характеристикой состояния межбелкового контакта олигомериого фермента. При хранении ферментов в них могут протекать начальные стадии инактивации, неощутимые при измерении каталитической активности препарата, но влияющие на стабильность фермента. Диссоциативная инактивация. Наиболее распространенным механизмом термоинактивации олигомерных ферментов является диссоциативный. Кинетические зависимости в этом случае имеют вид, представленный на рис 20в. При диссоциативной инактивации олигомерных ферментов обратимая диссоциация олигомера предшествует кинетически необратимым изменениям продуктов.
Для димерного фермента простейшая кинетическая схема имеет вид: Здесь Ei - мономер, способный обратимо образовать каталитически активный димер. Ed - денатурированный мономер, не способный образовать комплекс Е2 при данных условиях кинетического эксперимента. k /k K - константа равновесия диссоциации фермента; kj - константа скорости денатурации. Диссоциативная термоинактивация наблюдается в узком температурном интервале и при определенных концентрациях белка, соизмеримых с Kd,s при данной температуре. Положение «точки излома» и наклон кинетических кривых в координатах уравнения первого порядка позволяет определить три кинетических параметра схемы (4). Это будут либо константы скорости kb k.j и kd, либо две константы скорости кь и kj и одна константа равновесия диссоциации Kdis- (Kjis = ki/k-i) [185, 186]. Определение положения точки излома па кинетической кривой термоинактивации олигомерного фермента является основным условием, позволяющим провести кинетический расчет элементарных констант процесса. Расчет к! и k-i требует использования начальной кинетической кривой при t x, т.е. на стадии диссоциации до точки излома
![Активность системы эндотелина, изменения кардиогемодинамики у больных хронической сердечной недостаточностью и возможности [B]-адреноблокатора небиволола в их коррекции](/i/i/4372/305373.png "Активность системы эндотелина, изменения кардиогемодинамики у больных хронической сердечной недостаточностью и возможности [B]-адреноблокатора небиволола в их коррекции Найманн Юлия Игоревна")