Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. 12
2.1. Иммуноглобулины. Основные понятия. 12
2.1.1. Структура. 12
2.1.2. Типы иммуноглобулинов. 14
2.1.3. Генетические основы многообразия иммуноглобулинов. 16
2.1.4. Связывание гаптена. 18
2.1.5. Гибридомы и моноклональные антитела. 20
2.2. Абзимы — биокатализаторы с неограниченными возможностями. 21
2.2.1. Применение в медицине. 21
2.2.2.Применение в химии. 22
2.2.3. Возможная роль абзимов в химии углеводов . 23
2.3. Иммунная система обладает внутренним свойством генерировать абзимы при различных патологиях. 26
2.4. Возможные механизмы образования абзимов. 28
2.4.1. Анти-идиотипический. 28
2.4.2. Иммунный ответ на гаптен. 30
2.5. Доказательство принадлежности каталитической активности антителам. 30
2.6. Ферментативные свойства природных абзимов, гидролизующих нуклеиновые кислоты и фосфорилирующих белки. 32
2.7.Проблемы получения гомогенных препаратов абзимов. 38
2.8. Специфические субстраты для исследования глюкозидгидролаз. 42
2.8.1. Использование хромо- и флуорогенных меток . 42
2.8.2. Применение ферментативного подхода для синтеза субстратов. 46
3. Материалы и методы. 49
3.1. Реактивы и ферменты. 49
3.2. Синтез субстратов. 49
3.2.1. п-Нитрофенил-а-О-глюкопиранозид. 49
3.2.2. Индол этил-p-D-глюкопиранозид. 49
3.2.3 MeUmb-, pNp- и Ind-мальтоолигосахариды 50
3.2.4.рЫр-(МеишЬ)-4.6-0-бензилиден-(этилиден-)-мальтоолигосахариды. 50
3.2.5. Индол этил- p-D- гал актопиранозил-4-О- 6HC-(O>D-глюкопиранозил)-4-0-а-0-глюкопиранозид. 50
3.2.6. Индолэтил 6-г4-6-(5-(2-аминоэтиламино)-1-нафталенсульфонат)-6-дезокси-р-0-галактопиранозил-4-0-бис-(а-0-глюкопиранозил)-4-0-а-0-глюкопиранозид. 51
3.3. Доноры и пациенты. 51
3.4. Выделение абзимов. 52
3.5. Получение и очистка фрагментов иммуноглобулинов. 53
3.6. Другие методы. 54
3.7. Анализ степени очистки антител методом электрофореза в денатурирующих условиях 54
3.8. Анализ амилолитической активности антител методом электрофореза в денатурирующих условиях 54
3.9. Доказательство принадлежности амилолитической активности антителам. 55
3.10. Проверка активности. 56
3.11. Тип действия. 57
3.12. Измерение флуоресценции. 57
3.13. Анализ трапсгликозилируюшей активности. 58
4. Результаты и обсуждение. 59
4.1. Электрофоретическая гомогенность препаратов абзимов. 59
4.2. Синтез субстратов. 63
4.3. Амилолитическая активность различных препаратов иммуноглобулинов . 65
4.4. Гидролитические свойства амилолитических абзимов. 70
4.4.1. рН-зависимость гидролиза субстратов. 70
4.4.2. Кинетические параметры гидролиза. 71
4.4.3. Зависимость каталитической эффективности от длины субстрата. 73
4.5. Тип действия. 74
4.5.1. а-Глюкозидазная активность. 76
4.5.2. Анализ конечных продуктов гидролиза субстратов. 77
4.5.3. Сравнительный анализ начальных и конечных продуктов гидролиза субстратов. 78
4.5.4. Различия в специфичности связывания субстратов препаратами антител из крови пациентов с СКВ. 80
4.6. Другие гликозидгидролазные активности. 82
4.7. Анализ констант ингибирования. 83
4.8. Трансгликозилирующая активность абзимов. 84
4.9. Субстратная специфичность абзимов в сравнении с а- амилазами. 84
4.10. Возможные пути образования амилолитических абзимов у людей с аутоиммунными заболеваниями и в человеческом молоке. 85
4.11. Тестирование амилолитической активности — дополнительный критерий для диагностики аутоиммунных заболеваний. 86
5. Заключение 87
6. Выводы 89
7. Публикации по теме диссертации 90
8. Благодарности 91
9. Список литературы 92
- Возможная роль абзимов в химии углеводов
- Использование хромо- и флуорогенных меток
- Амилолитическая активность различных препаратов иммуноглобулинов
- Различия в специфичности связывания субстратов препаратами антител из крови пациентов с СКВ.
Введение к работе
1. I. Актуальность проблемы.
Феномен наличия у иммуноглобулинов каталитических свойств активно исследуется в течение последних десятилетий. Это привело к возникновению нового направления в классической иммунологии и энзимологии, новой области биокатализа - абзимологии. (Антитела-энзимы были названы «абзимами» как аббревиатура от AntiBody и enZIME).
Впервые гипотеза, согласно которой антитела, комплементарные структуре переходного состояния химической реакции, должны катализировать эту реакцию, ускоряя достижение переходного состояния и стабилизируя его, была высказана Б.Дженксом в 1969г (Jencks, W. 1969).Он же предвидел возможность получения абзимов как антител к стабильным аналогам переходных состояний. Идеи Дженкса получили экспериментальное подтверждение; в целом за последние 30 лет с использованием рассмотренного подхода направленного синтеза абзимов были получены антитела, способные катализировать более 100 различных химических реакций.
Открытие природных каталитических антител, явившееся реальным подтверждением теории, произошло лишь в 1989г (Paul et al., 1989). Столь значительное отставание практики от теории связано с уровнем развития методов выделения и очистки антител, а именно, с возможностью доказать принадлежность каталитической активности непосредственно антителам, а не каким-либо примесям ферментов. До этого считалось, что основная функция антител заключается только в связывании и элиминировании антигенов, а обнаруженная каталитическая активность (Slobin, 1966., Kit et al., 1991., Кульберг и др., 1969) принадлежит «ферментам, сорбированным на молекулах антител» (Slobin, 1966., Кульберг и др., 1969). Итак, в результате разработки методологии доказательства каталитической активности абзимов (Paul et al., 1989) (подробнее см. ниже), каталитические IgG и IgM, гидролизующие пептиды (Paul et al., 1989), белки (Kalaga et al., 1995), ДНК (Shuster et al., 1992; Gololobov et al., 1995), ДНК и РНК (Buneva et al., 1994; Viassov ct a!., 1998a, 1998b; Andrievskaia et ai., 2000; Baranovskiy et al., 2001) были обнаружены в сыворотке крови пациентов с различными аутоиммунными патологиями: бронхиальная астма (Paul et al., 1989), СКВ (системная красная волчанка) (Shuster et al., 1992; Gololobov et al., 1995; Buneva et al., 1994; Viassov et al., 1998a, 1998b; Andrievskaia et al., 2000), аутоиммунный тиреоидит, полиартрит (Kalaga et al., 1995; Viassov et al., 1998a, 1998b), PC (рассеянный склероз) (Baranovskii et al., 2001). Также абзимы с различными каталитическими активностями были найдены в крови и молоке здоровых матерей (Buneva et al., 1998; Nevinsky et al., 1998, 2000a, 2000b). Препараты slgA, выделенные из человеческого молока, обладают проте инки казной (Nevinsky et al., 1998), ДНКазной или РНКазной активностями (Kanyshkova et al., 1997; Buneva et al., 1998; Nevinsky et al., 2000b), а также IgG и slgA способны гидролизовть ATP (Semenov et al., 1998).
В то же время антитела из крови здоровых доноров, а также больных гриппом, пневмонией, туберкулезом, тонзиллитом, язвой 12-перстной кишки и некоторыми онкологическими заболеваниями (рак матки, молочной железы, кишечника) не проявляли каталитических активностей (Baranovskii etal., 1997).
Давно известно, что аутоиммунные заболевания ассоциированы с циркуляцией аутоантител, связь которых с основным патологическим процессом установить удается не всегда. Так, ревматоидный фактор, который часто обнаруживают при ревматоидном артрите, представляет собой специфические антитела к сывороточному гамма-глобулину, но совершенно непонятно, почему они возникают и в чем заключается их действие. Аналогичным образом, при так называемых коллагенозах типа СКВ и дерматомиозита, часто находят циркулирующие антитела против ДНК или комплексов ДНК с гистонами, однако и в этом случае происхождение и функции аутоантител остаются неясными (Silverstein et al., 1987). Перечисленные выше открытия каталитических функций у аутоантител поставили много дополнительных вопросов об их природе и возможной биологической роли. Можно предположить, что в каталитической активности абзимов запрограммированы дополнительные энзиматические возможности организма, появление которых происходит только в особых условиях, например, при беременности женщин, АИЗ, или других пока еще не обнаруженных случаях (Semenov et al., 1998). Перспективными направлениями дальнейших исследований в области биокатализа, обусловленного антителами, является поиск новых каталитических активностей антител, расширение круга исследованных заболеваний, а также детальное сравнение абзимов у здоровых людей и пациентов с АИЗ. Такие данные могут прояснить роль каталитических антител в этиологии и/или патогенезе различных заболеваний (так и их возможную функцию в случае здоровых рожениц), расширить наши представления о путях метаболизма биологически активных соединений в организме человека, привести к расширению классических представлений о роли иммуноглобулинов и могут способствовать более глубокому пониманию механизмов возникновения аутоиммунного ответа (Andrievskaia et al.,1998).
1.2. Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы заключалась в изучении амилолитической активности препаратов иммуноглобулинов, выделенных из сыворотки крови пациентов с АИЗ, здоровых доноров, а также из молока здоровых рожениц.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Протестировать на возможную гликозидгидролазную активность различные препараты иммуноглобулинов, используя в качестве субстратов крахмал, гликоген, мальтоолигосахариды, другие сахара (pNp-a/fi-D глюкопиранозиды, pNp-a/fi-D-маннопиранозиды, pNp-a/jB-D галактопиранозиды, pNp-a/p- N-ацетилглюкоаминиды, pNp-a-L фукопиранозид, pNp-P-D-фукопиранозид и pNp-a-D-ксилопиранозид). 2. Доказать принадлежность обнаруженной активности непосредственно антителам.
3. Определить рН-оптимум, кинетические параметры, тип действия, зависимость скорости гидролиза от длины субстрата для реакций, катализируемых препаратами антител.
4. Сравнить основные характеристики и свойства известных амилаз и гликозидгидролизующих антител.
1.3. Основные положения, выносимые на защиту.
1. Препараты IgG и IgM из сыворотки крови пациентов с различными АИЗ, IgG и slgA из молока здоровых матерей способны гидролизовать а-1,4-глюкозидные связи как в полимерных субстратах (крахмал, гликоген, амилоза), так и в мальтоолигосахаридах.
2. Ферментативная активность - внутреннее свойство человеческих абзимов.
3. Изменение репертуара антител от индивида к индивиду - основная особенность поликлональных абзимов.
4,Характер действия абзимов отличается от характера действия типичных а-амилаз. 1.4. Научная новизна полученных результатов.
В настоящей работе впервые было показано, что препараты человеческих антител обладают амилолитической активностью. Чистые IgM фракции, выделенные из крови нескольких десятков пациентов с PC или СКВ, имели специфическую амилолитическую активность, на три порядка превышающую активность препаратов IgM из крови здоровых доноров.
Fab-фрагмснты, соответствующие IgG и IgM фракциям антител, демонстрируют уровень активности, практически равный уровню ферментативной активности исходных иммуноглобулинов.
Фракции поликлональных абзимов от различных доноров состоят из различных моноклональных AT с отличающимися физико-химическими параметрами для субстратов и демонстрируют каталитическую гетерогенность кинетических параметров и различные типы действия при гидролизе природных и искусственных субстратов. Часть абзимов проявляла только экзо-амилазную активность, в то время как другие обладали также и а-глюкозидазной.
Ни один из исследованных препаратов иммуноглобулинов не показал трансгликозилирующей активности.
1.5. Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные данные вносят существенный вклад в наши представления о скрытых возможностях иммунной системы и имеют большое значение для дальнейшего изучения свойств, функций, физиологической и патофизиологической роли аутоантител, в частности, каталитических аутоантител, и, как следствия, более глубокого понимания механизмов возникновения аутоиммунного ответа, а также этиологии и патогенеза аутоиммунных заболеваний.
Результаты исследований позволяют предложить субстраты, позволяющие с большой чувствительностью определять амилолитическую активность абзимов, что может стать инструментом для диагностики аутоиммунных заболеваний.
1.6. Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Материалы диссертации были представлены на I симпозиуме по семейству а-амилаз (Словакия 2001), на симпозиуме «Человеческие антитела и гибридомы-2003» (Осака, Япония, 2003), на III съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004).
Возможная роль абзимов в химии углеводов
Сегодня нет сомнений в том, что каталитические антитела могут играть роль основных молекулярных инструментов в прикладной биотехнологии и медицине, благодаря практически неограниченным возможностям в реализации заданной специфичности. Сейчас стабильные аналоги переходных состояний, сконструированные с учетом всех требований, выполнение которых обеспечивает наличие необходимых функциональных групп в активном центре создаваемого биокатализатора, используются как галтены для выработки антител, запрограммированных либо катализировать исследуемую реакцию, либо быть использованными в качестве диагностических или терапевтических инструментов
Более того, в последние годы быстро внедряются методы «доработки» свойств абзимов путем направленной модификации антигенсвязывающего участка моноклональных антител на уровне кодирующих их генов с применением методов сайт-направленного мутагенеза или селективной химической модификации (Sastry et al., 1991; Guo et ah, 1995; Miller et al., 1997; Roberts et al., 1994; Stewart et al., 1994).
Терапевтический потенциал абзимов к биополимерам широко известен. Могут быть получены антитела, способные разрушать специфические патогены или опухолевые клетки (Kakinuma et al., 2002), очищать организм от аутоиммунных метаболитов, защищать нормальные клетки от цитотоксичности, осуществлять пассивную иммунотерапию большинства болезней или формировать каталитический иммунитет в рамках профилактической вакцинации. Созданы антитела, способные связывать и гидролизовать кокаин до его проникновения з ЦНС (Deng el а!., 2002); получены монокловальные антитела к gp 41(Hifumi et al., 2002) и gp 120 (Zhou et al., 2002), способные гидролизовать эти консервативные последовательности многих вирусов СПИД; поликлональные антитела, катализирующие гидролиз карбарила, карбаматного инсектицида, оказывающего токсическое воздействие на людей и животных, секретируемые in vivo, были также активны in vivo, понижая концентрацию карбарила в крови мышей (Wang et al., 2001). В настоящее время становится ясным, что общая методология конструирования и наработки абзимов с высокой специфичностью и каталитической эффективностью может иметь огромную важность для практической медицины (Ponomarenko et al., 2002).
Трудно переоценить возможности абзимов и в области органической химии. Так, на основе метода иммунного ответа на переходные состояния химических реакций были созданы антитела, способные катализировать более 100 типов химических реакций (Lerner et al., 1981, 1991; Shultz et al., 1990, 1995; Benkovic 1992), в основном, гидролитических (Lerner et al., 1991; Benkovic 1992), а также негидролитических, способных осуществлять катионную циклизацию (Li et al., 1994); проявлять ацил-трансферазную активность (Janda et al., 1990) и некоторые другие (Janda et al., 1993). Абзимы, полученные вышеупомянутым методом обладают очень высокой каталитической эффективностью: для трансформаций, катализируемых антителами, происходит ускорение реакции на шесть порядков, по сравнению с кислотно-катализируемыми реакциями (HHvert, 1992). В некоторых случаях абзимы демонстрируют более высокую стереоспецифичность, чем природные ферменты. Этот подход, т.е. иммунизация на основе различных гаптенов- химически стабильных аналогов переходных состояний, позволяет получать новые энзиматические активности, не имеющие аналогов в традиционной энзимологии (Suzuki, 1994).
Так как настоящая работа посвящена амилолитической активности природных абзимов, представляется интересным подробнее ознакомиться с результатами работ по получению абзимов-гликозидаз. Во-первых, существование подобных искусственных антител дает основание предполагать возможность обнаружения гликозидазной активности у природных; во-вторых, анализ зависимости эффективности полученных абзимов от структуры гаптена может пролить свет на механизм гидролиза, катализируемого абзимами и строение их активного центра. Разработка биологических катализаторов, способных селективно расщеплять или формировать гликозидные связи, внесла бы огромный вклад в возможность манипулировать структурами углеводов. Один из подходов к этой проблеме - использование возможностей иммунной системы генерировать селективные катализаторы с огромным разнообразием структурных специфичностей на основе антител (Yu et al., 1998).Этот подход требует стратегии программирования иммунного ответа в соответствии с механистической информацией о реакции гидролиза гликозидной связи. Общепринятый механизм гидролиза гликозидов включает (рис.5): а)протонирование гликозидного экзо-кислорода и искажение гликозидного кольца с образованием полукресловидного конформера, ведущее к образованию переходного состояния; б) уход протонированной алкоксильной группы с формированием оксокарбениевого иона, и, наконец, в) реакцию с водой, ведущую к образованию пиранозного кольца. Ранние попытки использовать информацию о механизме реакции для дизайна гаптенов заключались в индукции антител к положительно заряженным аналогам оксокарбениевого иона (гаптен 1 на рис. 5) (Suga et al., 1994; Reyraond et al., 1991; Yu et al., 1994). Эти антитела ускоряли реакцию гидролиза в 100-1000 раз. Позднее было предложено использовать пятичленные кольцевые иминоциклитолы (гаптсн 1 на рис.6) (Yanda et al..
Использование хромо- и флуорогенных меток
Природными субстратами для а-амилаз являются крахмал, гликоген, амилоза, различные мальтоолигосасхриды. Исследования активности традиционных а-амилаз обычно проводят при использовании мальтоолигсахаридов в качестве субстратов, детектируя продукты гидролиза с помощью цветных реакций образовавшихся восстанавлвающих концов по методу Сомоджи-Нельсона (Nelson, 1944) с последующим спектрофотометр ичес ким определением количества образовавшихся продуктов.
Гораздо более удобным является метод исследования гликозидгидролаз с помощью субстратов с хромогенными или флуорогенными метками. Использование подобных искусственных субстратов традиционно считается эффективным методом изучения кинетических свойств и типа действия гликозидгидролаз вообще. Этот метод определения кинетических параметров гораздо чувствительнее и аналитически проще, чем методы, в которых продуктами ферментативного гидролиза являются моно- и олигосахариды, не имеющие хромофорных маркеров (Armand et al., 1997). В частности, легко отделять и детектировать продукты реакции гидролиза хромогенно (или флуорогенно) меченых субстратов методами ВЭЖХ, что позволяет легко и точно определять количества конкретных продуктов, и, соответственно, рассчитывать кинетические параметры и устанавливать тип действия гликозидаз (Usui et al., 1993). В качестве агликона обычно используют п-нитрофенил- (Kaufman et al., 1980; McCroskey et al., 1982; Haegele et al., 1982; McGregor et al., 1992; Usui et al., 1988; Kandra et al., 1997), 2-хлоро-4-нитрофенил- (Hencel et al., 1984; Hafkenscheid et al., 1985; Teshima et al., 1985), метилумбеллиферил- (Inaba et al., 1983; Malet et al., 1995; Borriss et al., 2003). Для защиты мальтоолигосахаридных субстратов от гидролиза экзо-глюкозидазами невосстанавливающий конец субстрата блокируют Недостатком вышеописанных субстратов является то, что прямое спектрофотометрическое детектирование действия фермента возможно лишь в случае гидролиза связи между сахаром и агликоном. Новые субстраты, несущие две флуорогенные группы на восстанавливающем и невосстанавливаю щем концах молекулы, лишены подобных недостатков (рис. 9). Принцип использования таких субстратов основан на том, что хромофорный донор и флуорофорный акцептор, подобранные так, что области длин волн эмиссии донора и поглощения акцептора спектрально перекрываются, будучи расположенными на определенном расстоянии друг от друга, находятся в состоянии передачи резонансной энергии (Fairclough, 1978). Т.е. флуоресценция бифункционального субстрата, измеренная на длине волны эмиссии акцептора, значительно превышает флуоресценцию свободного акцептора. После гидролиза любой из гликозидных связей субстрата две флуорогенных группы разделяются, эффекта резонансной передачи энергии больше нет. Уменьшение флуоресценции на длине волны эмиссии акцептора — признак, по которому удобно следить за энзиматической реакцией. В качестве подходящей пары были выбраны индол этанол и ED ANS (5-(2-аминоэтиламино)-1-нафталенсульфонат) (рис.9.). Кроме перекрывания спектральных областей эти группы позволяют включить их в молекулу олигосахарида (Armand et al., 1996).
Химически синтезировать длинную олигосахаридную цепочку очень сложно. Также усложняются с ростом цепи процедуры химической модификации олигосахаридов, полученных гидролизом природных полимеров. Например, синтез га-нитрофенил-мальтогексаозы, -гептаозы и -октаозы непосредственно из циклодекстринов (Farkas et al., 1997) требует предварительного гидролиза циклического исходного соединения, что осуществляется ацетолизом уксусным ангидридом в условиях длительного нагревания. Неудивительно, что выходы довольно низкие (22%).
Для преодоления этих трудностей в процессе создания подходящих (достаточно длинных) субстратов применяется хемо-энзиматический подход.
В процессе гидролиза олигосахаридов и гликозидов в условиях термодинамического контроля реакции, сохраняющие гликозид гидролазы, такие как р-галактозидаза (Yanahira et al., 1995), р-глюкозидаза (Christakopoulos et al., 1994), р-ксилозидаза (Armand et al., 1996, Eneyskaya et al., 2003), эндоглюканаза (Schou et aL, 1993), а-амилаза (Omichi et al., 1991) проявляют трансгликозилирующую активность и образуют смеси олигосахаридов с большими степенями полимеризации со средними выходами и низкой специфичностью связи. В условиях кинетического контроля можно достичь большей эффективности трансгликозилирующей реакции, используя активированный углеводный донор. В этом случае получающиеся высшие мальтоолигосахариды демонстрируют и высокую специфичность связи. Этот подход впервые был использован для синтеза мальтоолигосахаридов из a-D-мальтозил фторида с помощью a-амилазы в качестве катализатора в смеси метанола с фосфатным буфером (рН 7) (Kobayashi et al., 1992). Эта стратегия применима и для синтеза олигосахаридов с помощью амилаз (Payre et а!., 1995), целлюлаз (Moreau et al., 1996), а также эндоглюканаз (Armand et al., 1997).
Принцип трансгликозилирующей реакции заключается в следующем. Фермент сначала реагирует только с субстратом, образуя фермент-субстратный комплекс и высвобождая агликон. Затем гликозильная единица переносится на акцептор — воду (реакция гидролиза), либо другую молекулу субстрата (трансгликозилирование) (рис 10). Очевидно, что высокие концентрации субстрата делают реакцию трансгликозилирования более вероятной. Иногда добавление органического растворителя способствует трансгликозилированию. Например, 1,5:1 (об/об) смесь ацетонитрила с малеатным буфером (0,05М, рН 7.0) дает хорошие результаты (Armand et al., 1997). Хотя присутствие органического растворителя необходимо для трансгликозилирования, в этих условиях падает активность фермента. Проблему решают добавлением свежих порций фермента в течение реакции. Соотношение концентрации донор/акцептор также имеет значение. Оптимальной является пропорция 3:1 (Armand et al., 1997).
Амилолитическая активность различных препаратов иммуноглобулинов
Реакции субстратного трансгликозилирования были изучены для набора различных типов иммуноглобулинов, проявляющих амилолитическую активность. Как показал ВЭЖХ (колонка Lichrosorb С18) и ТСХ-анализ продуктов реакции, ни один из препаратов иммуноглобулинов не привел к образованию pNp-мальтоолигосахаридов с большей степенью полимеризации, чем субстрат, что должно было бы произойти в реакции трансгликозилирования. Более того, трансгликознлирующая активность препаратов иммуноглобулинов анализировалась при использовании pNpGlc4, pNpGlcs и pNpGlc6 в ЮмМ концентрациях. Ни в одном случае не были зафиксированы продукты трансгликозилирования.
ЯМР-анализ, широко используемый для установления стереохимии действия гликозидгидролаз, не может быть использован в случае абзимов, поскольку они обладают низкой удельной ферментативной активностью. Тем не менее, отсутствие реакции трансгликозилирования в случае препаратов иммуноглобулинов может служить косвенным доказательством того, что абзимы катализируют гидролиз глюкозидной связи с инверсией аномерной конфигурации.
Объединяя все полученные данные о каталитических свойствах амилолитических человеческих антител, мы можем продемонстрировать яркие различия между традиционными а-амилазами и антителами с амилолитической активностью. а-Амилазы - это сохраняющие гликоз ид гидролазы, обладающие трансгликозилирующей активностью. Наоборот, амилолитические абзимы вообще не проявили трансгликозилирующей активности. S4 Независимость начальной скорости гидролиза абзимами от длины субстрата, в ТО время как а-амилазы из слюны демонстрируют линейную зависимость начальной скорости гидролиза от степени полимеризации субстрата. Амилолитические антитела в некоторых случаях проявляют х-глюкозидазную активность, а-амилазы не способны гидролизовать pNpGlc и мальтозу 4Л0. Возможные пути образования амилолитических абзимов у людей с АИЗ и в человеческом молоке. Возможно, что одинаковые механизмы осуществляются в обоих случаях, т.к. ферментативные свойства препаратов IgM и IgG из молока и из крови пациентов с АИЗ совершенно одинаковые. Короткий обзор успешных попыток продуцировать моноклональные антитела с гликозидазной активностью in vitro может прояснить этот вопрос. Известный аналог переходного состояния гликозидгидролазной реакции — 1-дезоксинайримицин (ингибитор а-глюкозидаз и глюкоамилаз) (Braun et al., 1995) несколько раз был использован для генерирования моноююнальных антител (Yu et al., 1998). Также было показано, что ингибиторы гликозидгидролаз, не связанные с несущим белком, могут служить в качестве гаптенов для наработки абзимов с заданной гликозидгидролазной активностью. Полученные абзимы демонстрировали каталитическую эффективность kca/KM порядка 100 - 1000 (с.мМ) 1 и обладали различными гликозидгидролазньши специфичностями. Например, были получены серии моноклональных антител с p-D-глюкозидазной, a/p-D галактозидазной, P-D-N-ацетилглюкозаминидазной, P-D-фукозидазной активностями, наряду с a-D-глюкозидазной функцией. (Yu et al., 1998., Suga et aL, 1994) Такое отсутствие определенной специфичности может быть объяснено, если принять во внимание тот факт, что аналоги переходного состояния, имитирующие пиранозные кольца, не дают абсолютной специфичности по отношению к глюкозе при иммунном ответе. В нашем случае, отсутствие других гликозндгидролазных активностей в IgG/IgM фракциях, выделенных из крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями, дает основание предположить реализацию антиидиотипического механизма образования антител при АИЗ. В самом деле, этот подход может привести к высокой стереоспецифичности и стереоселективности абзимов, образующихся в человеческой крови и молоке. С другой стороны, удельные активности известных моноклональных антител, полученных иммунизацией аналогами переходных состояний, редко приближаются к значению удельных активностей соответствующих ферментов, а обычно на несколько порядков ниже. Считается, что связано это с тем, что редко удается получить антитела, у которых наряду со структурной стабилизацией переходного состояния были бы еще правильные каталитические группы в правильном месте. В принципе, каталитических групп, как таковых, т.е. групп, осуществляющих гомогенный катализ, может не быть совсем. Если каталитических групп нет, то не должно быть и рН-зависимости активности как отражения процессов протонирования-депротонирования каталитических групп. Наличие рН-зависимости (если это не является отражением влияния рН на общую структуру абзима) также говорит в пользу антиидиотипического происхождения абзимов. Индивидуальные пациенты с PC демонстрируют исключительно широкий спектр клинических симптомов, т.е. определенная диагностика PC остается очень сложной задачей. Так как в наших экспериментах около 100% пациентов с PC характеризовались высокой амилолитической активностью IgM фракций, анализ этой активности с помощью высокочувствительных методов, основанных на использовании флуорогенных субстратов, вполне может применяться как дополнительный критерий при диагностике этой патологии. 5. В настоящей работе впервые показано наличие амилолитической активности у препаратов IgG и IgM сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом рассеянный склероз и системная красная волчанка (Ivanen et al., 2002; 2004; Savel ev et al.,2003), а также у препаратов IgG и slgA из человеческого молока (Ivanen et al., 2002; Savel ev et al., 2003). Нами установлено, что фракции IgM, выделенные из крови пациентов с PC и СКВ, имеют амилолитическую активность, на три порядка превышающую активность IgM из крови здоровых доноров (Ivanen et aL2002; 2004; Savel ev etal., 2003). Установлено, что за реализацию амилолитической активности препаратов антител в значительной степени отвечают Fab-фрагменты: Уровни активности исходных иммуноглобулинов и соответствующих им Fab-фрагментов практически равны (Ivanen et al., 2002; 2004; Savel ev et al., 2003). Значения кинетических параметров Км и kcat в реакции гидролиза п-нитрофенил-мальтопентаозида, катализируемой препаратами IgG из крови пациентов с СКВ и соответствующими Fab-фрагментами практически не меняются (Neustroev et al., 2003). Для исследования амилолитической активности антител (определения кинетических параметров и типа действия) нами были синтезированы и использованы специфические субстраты, представляющие собой мапьтоолигосахариды, содержащие хромо- и флуорогенные метки. Подобные субстраты отвечают требованиям кинетических экспериментов с антителами т.к. позволяют измерять скорость гидролитических реакций, катализируемых абзимами, при концентрациях субстрата порядка I0"6 М/л (порядка К для антител), что необходимо для определения кинетических параметров на основе стандартного метода начальных скоростей реакций.
Различия в специфичности связывания субстратов препаратами антител из крови пациентов с СКВ.
Итак, различия в типе действия гораздо очевиднее демонстрируют каталитическую гетерогенность иммуноглобулинов, чем сравнение кинетических параметров антител. Наиболее явное различие в том, что часть препаратов демонстрируют экзо-амилазную активность, в то время как другие проявляют также и а-глюкозидазную, выражающуюся в способности абзимов гидролизовать короткие мальтоолигосахариды. Следовательно, все протестированные препараты иммуноглобулинов могут быть разделены на две основные группы в соответствии с их типом действия. Такие отличия зафиксированы для всех изученных типов иммуноглобулинов с амилолитической активностью (Suganuma et al., 1996; Savel ev et al., 2001, 2003; Ivanen et al., 2002; Neustroev et al., 2003). Анализ соотношения продуктов гидролиза внутри обеих групп (экзо-амилолитически и экзо-амилолитически/а-D-глюкозидазно действующие антитела) также обнаруживает каталитическую микрогетерогенность. Таким образом, некоторые препараты slgA и IgG из человеческого молока, отнесенные к группе с экзо-амилазным действием, продемонстрировали различия в относительном содержании продуктов гидролиза мальтоолигосахаридов со степенью полимеризации 3 - 6 , проведенного в одинаковых условиях с использованием различных образцов абзимов (таблица 9) (Savel ev et al., 2001). Другие важные проявления гетерогенности изученных антител заключаются в их способности гидролизовать pNpGlci, в различных выходах конечных продуктов гидролиза pNpGlc6, различных зависимостях скоростей гидролиза от длины субстратов.
Наши данные по гетерогенности а-амилазной активности абзимов согласуются с опубликованными данными, касающимися энзиматической неоднородности РНКазных и ДНКазных активностей абзимов из крови СКВ и PC пациентов (Andrievskaia et al., 2000., BaranovskU et at, 2001., Nevinsky et al, 2002) и из человеческого молока (Kanyshkova et al., 1997).
С нашей точки зрения, самым надежным доказательством того, что амилолитическая активность принадлежит именно антителам, является вариабельность типов действия, демонстрируемая различными фракциями абзимов. Совершенно невероятно, чтобы такое разнообразие типов действия определялось присутствием примесных ферментов. Набор из 12 препаратов IgM от различных пациентов с PC был проанализирован на наличие других гликозидгидролазных активностей. В качестве контроля использовались образцы IgM от здоровых пациентов. pNp a/p-D-глюкопиранозиды, pNp-a/p-D-маннопиранозиды, pNp-a/p-D галактопиранозидьі; nNp-a/Й- N-ацетилглгокоаминидьк pNpa-L-фукопиранозил, pNp-p-D-фукопиранозид и pNp-p-D-ксилопиранозид были протестированы как возможные субстраты для IgM от пациентов с PC и здоровых доноров. Реакции проводились в 5мМ фосфатном буфере, рН 6,8, при 37С. Ни препараты IgM от пациентов с PC, ни соответствующие антитела от здоровых доноров не проявили заметной гликозидгидролазной активности по отношению ко всем этим субстратам. Еще одна характеристика субсайтной структуры амилолитических абзимов - это константа ингибирования (Ki), которая была оценена для мал ьтооли го сахарид ов различной длины цепи, при использовании pNp-мальтогексаозида в качестве субстрата. Следует отметить, что во всех случаях ингибирование гидролиза pNp-мальтогексаозида мал ьтоолигосахар идами было конкурентным по отношению к субстрату. Для slgA фракций из человеческого молока глюкоза, мальтоза и мальтотриоза ингибировали гидролиз pNp-мальтогексаозида при высоких концентрациях (Kj 20mM), в то время как дальнейшее увеличение длины олигомера приводило к значительному увеличению аффинности ингибитора (таблица 12). Интересно, что значения К, для мальтогексаозы одного порядка со значениями Км гидролиза pNp-мальтогексаозида некоторыми препаратами IgG и slgA (Savelev et al., 2001., Ivanen et aL, 2002). Реакции субстратного трансгликозилирования были изучены для набора различных типов иммуноглобулинов, проявляющих амилолитическую активность. Как показал ВЭЖХ (колонка Lichrosorb С18) и ТСХ-анализ продуктов реакции, ни один из препаратов иммуноглобулинов не привел к образованию pNp-мальтоолигосахаридов с большей степенью полимеризации, чем субстрат, что должно было бы произойти в реакции трансгликозилирования. Более того, трансгликознлирующая активность препаратов иммуноглобулинов анализировалась при использовании pNpGlc4, pNpGlcs и pNpGlc6 в ЮмМ концентрациях. Ни в одном случае не были зафиксированы продукты трансгликозилирования. ЯМР-анализ, широко используемый для установления стереохимии действия гликозидгидролаз, не может быть использован в случае абзимов, поскольку они обладают низкой удельной ферментативной активностью. Тем не менее, отсутствие реакции трансгликозилирования в случае препаратов иммуноглобулинов может служить косвенным доказательством того, что абзимы катализируют гидролиз глюкозидной связи с инверсией аномерной конфигурации. Объединяя все полученные данные о каталитических свойствах амилолитических человеческих антител, мы можем продемонстрировать яркие различия между традиционными а-амилазами и антителами с амилолитической активностью.
