Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Участие иммунной системы в регуляции физиологических процессов б организме 9
1.1. Естественные аутоантитела в сыворотке крови 9
1.2. Происхождение аутоантител 11
1.3. Аутоантитела к ДНК:
характеристика и биологическое значение 14
1.3.1. Выявление аутоантител к ДНК в сыворотке крови здоровых лиц 14
1.3.2. Взаимодействие анти-ДНК аутоантител с ДНК 17
1.3.3. Свойства аутоантител к ДНК 20
1.3.4. Биологическая активность аутоантител к ДНК 22
1.4. Интеграция функциональных систем организма в поддержании гомеостаза 26
1.4.1. Взаимосвязь иммунной и эндокринной систем 27
1.4.2. Возраст и содержание половых гормонов 29
1.4.3. Возрастные изменения иммунной системы 30
Заключение по обзору литературы 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 36
2.1. Оборудование и реактивы 36
2.2. Объект исследования 37
2.3. Определение аутоантител к ДНК методом иммуноферментного анализа 38
2.3.1. Подбор оптимальной концентрации конъюгата 39
2.3.2. Определение специфичности аутоантител к нативной и денатурированной ДНК 40
2.3.3. Статистическая обработка результатов 42
2.4. Осаждение иммуноглобулинов сыворотки крови сульфатом аммония 43
2.5. Обессоливание препаратов иммуноглобулинов методом гель-фильтрации 43
2.6. Электрофорез иммуноглобулинов в полиакриламидном геле 44
2.7. Аффинная хроматография иммуноглобулинов на ДНК-целлюлозе 45
ГЛАВА 3. Результаты экспериментов 49
3.1. Содержание аутоантител к ДНК в сыворотке крови в норме 49
3.2.Уровень содержания аутоантител к ДНК у здоровых лиц разных возрастных групп 54
3.3. Аутоантитела к ДНК в сыворотке крови мужчин и женщин 56
3.4. Специфичность аутоантител здоровых лиц к нативной и денатурированной ДНК 62
3.5. Выделение и характеристика аутоантител к ДНК 77
3.5.1. Приготовление аффинных сорбентов 77
3.5.2. Выделение аутоантител к ДНК из сыворотки крови 79
3.5.3. Фракционирование аутоантител к ДНК 84
3.5.4. Фракционный состав аутоантител к ДНК сыворотки крови мужчин и женщин 91
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 97
Выводы 112
Литература
- Естественные аутоантитела в сыворотке крови
- Интеграция функциональных систем организма в поддержании гомеостаза
- Определение аутоантител к ДНК методом иммуноферментного анализа
- Содержание аутоантител к ДНК в сыворотке крови в норме
Введение к работе
Актуальность проблемы
Значительную часть иммуноглобулинов, циркулирующих в сыворотке крови у здоровых людей составляют аутоантитела к собственным антигенам организма, которые играют важную роль в регуляции иммунного ответа [Lacroix-Desmazes et al., 1998]. Особое место среди них занимают аутоантитела к ДНК, присутствие которых в сыворотке крови давно используется как клинический признак аутоиммунных заболеваний. Аутоантитела к ДНК в небольших количествах выявляли и в сыворотке крови здоровых людей, но долгое время этим данным не придавали значения.
Интерес к аутоантителам к ДНК и к их биологической роли в норме появился в середине 80-х годов. Было показано, что содержание аутоантител к ДНК у здоровых людей изменяется при стрессе и физических нагрузках [Шубик и Левин, 1985], с переменой климатических условий и сезонов года [Добродеева и Суслонова, 1990]. Рядом авторов отмечалось повышение уровня содержания аутоантител к ДНК при старении организма [Shuller et al., 1981; Kasjanov et al., 1984; Xavier et al., 1995].
Однако до сих пор не ясно, являются ли аутоантитела к ДНК обязательным компонентом сыворотки крови в норме. С одной стороны, в литературе приводятся сведения о присутствии аутоантител к ДНК у всех обследованных лиц в группах здоровых людей [Несвижский и Воробьев, 1996]. С другой стороны, имеются сообщения о том, что аутоантитела к ДНК обнаруживаются только у 15-28% здоровых лиц [Добродеева и Суслонова, 1990; Буковская, 1993]. До настоящего времени ряд исследователей придерживаются мнения о том, что аутоантитела к ДНК являются однозначным атрибутом патологического аутоиммунитета и отсутствуют в сыворотке крови здоровых людей [Azizah et al., 1996; Candore et al., 1997; Маркина и др., 2001].
Значительно возрос интерес к аутоантителам к ДНК в норме в связи с обнаружением способности этих аутоантител проникать через мембраны клеток [Yanase et al., 1997]. Было показано, что аутоантитела к ДНК могут соединяться с компонентами ядра и изменять активность экспрессии генов [Madaio et al., 1997]. Приведенные факты свидетельствуют о том, что биологическая роль аутоантител к ДНК в норме может быть связана с регуляцией активности генов и участием в фундаментальных биохимических процессах, не связанных с иммунологической защитой организма.
Одним из основных препятствий на пути к выяснению биологической роли аутоантител к ДНК в норме является отсутствие систематических исследований этих аутоантител в сыворотке крови здоровых людей. По этой же причине до сих пор остается неясной и роль аутоантител к ДНК в возникновении и развитии аутоиммунных патологий.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось исследование аутоантител к ДНК в сыворотке крови здоровых лиц. Были поставлены следующие задачи: определить пороговый уровень содержания аутоантител к ДНК в сыворотке крови здоровых лиц; исследовать содержание аутоантител к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови мужчин и женщин разных возрастных групп; разработать схему выделения и очистки аутоантител к ДНК из сыворотки крови здоровых людей; охарактеризовать фракционный состав аутоантител, взаимодействующих с нативной и денатурированной ДНК у здоровых лиц разного возраста и пола.
Научная новизна
Установлен пороговый уровень содержания аутоантител к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови здоровых лиц. Показано, что у здоровых людей уровень содержания аутоантител к нативной ДНК колеблется в пределах 0,07-0,45 относительных единиц, к денатурированной ДНК - в пределах 0,12-0,59 относительных единиц. Впервые выявлен половой диморфизм содержания аутоантител к ДНК. Средний уровень содержания аутоантител к обоим типам ДНК в сыворотке крови у женщин достоверно превышает аналогичные показатели у мужчин. Установлена неидентичность возрастной динамики изменений уровня содержания аутоантител к ДНК в сыворотке крови у мужчин и женщин. Впервые показано возрастное изменение соотношения субпопуляций аутоантител, специфичных к определенному типу ДНК и аутоантител, способных взаимодействовать как с нативной, так и с денатурированной ДНК. Высказано предположение о взаимосвязи субпопуляционного состава аутоантител к ДНК с возрастными изменениями гормонального профиля у здоровых людей.
Практическая значимость
Установление порогового уровня содержания аутоантител к ДНК позволяет судить о вероятном диапазоне их колебания в сыворотке крови здоровых людей. Данные об уровне содержания аутоантител к ДНК в сыворотке крови здоровых лиц разных возрастных групп и пола могут быть использованы в качестве дифференциального контроля при разработке диагностических тестов на основании определения аутоантител к ДНК. Полученные результаты указывают на необходимость использования в качестве точки отсчета - при оценке уровня содержания аутоантител к ДНК в сыворотке крови больных аутоиммунными заболеваниями - уровень аутоантител к ДНК в сыворотке крови здоровых людей соответствующего возраста и пола. Выявленный нами половой диморфизм возрастных изменений соотношения субпопуляций аутоантител, способных взаимодействовать с нативной и денатурированной ДНК, может быть использован для ранней диагностики аутоиммунных заболеваний и выявления групп риска с учетом половой принадлежности здоровых лиц.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на III Республиканской научно-технической конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1997); научно-практической конференции молодых ученых Казанской государственной медицинской академии (Казань, 1998); XII юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001); VIII Всероссийском съезде неврологов (Казань, 2001); II Российской конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 2001); IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Республики Татарстан (Казань, 2001); III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета в 1997-2003 г.
По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Естественные аутоантитела в сыворотке крови
Аутоантитела (ААТ) - это антитела, циркулирующие в сыворотке крови здоровых индивидуумов в отсутствие преднамеренной специфической иммунизации антигеном-мишенью [Coutinho et al., 1995]. Среди публикаций довольно часто встречается еще одно название таких ААТ - естественные ААТ.
Впервые ААТ были обнаружены в сыворотке крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями, характерной чертой которых является гиперпродукция ААТ к отдельным эндогенным антигенам (АГ) организма. Впоследствии в литературе стали появляться данные об обнаружении в сыворотке крови практически здоровых людей и неиммунизированных животных ААТ к самым различным макромолекулам и тканям собственного организма [Добродеева и Суслонова, 1990; Shi et al., 1990; Ichiki et al., 1993; Kindas-Mugge et al.,1993]. Было показано, что ААТ, содержащиеся в сыворотке крови здоровых лиц, способны реагировать с актином, тубулином, тиреоглобулином, миоглобином, фетуином, трансферрином, альбумином, цитохромом, коллагеном, инсулином [Guibert et al., 1982; Сидорова, 1993].
Мнение о том, что аутореактивность является непременным атрибутом патологического состояния, преобладало среди иммунологов вплоть до 70 - 8 Ох гг прошлого столетия. Открытие Jerne (1974) способности антител реагировать с вариабельными областями аутогенных Ig, привело к рассмотрению аутореактивности как важного элемента нормальной иммунной системы. Следствием этой гипотезы явилось предположение о том, что ААТ прежде всего развивались для распознавания «своего», а способность антител к распознаванию «не-своего» была приобретена позже [Stewart, 1992]. В первой половине 90-х годов, с накоплением обширного материала по распознаванию различных аутоантигенов в норме, была сформулирована концепция аутоиммунитета, согласно которой аутоиммунные реакции были признаны постоянным и обязательным компонентом иммунного ответа практически на любой антиген, а распознавание «своего» - одной из важнейших функций организма, связанных с поддержанием гомеостаза [Семенов, 1995].
Диапазон специфичностей естественных аутореактивных ААТ человека для узнавания соответствующего набора аутоантигенов закладывается еще в раннем онтогенезе и остается стабильным на протяжении всей жизни [Stahl et al., 2000]. При сравнении спектра антигенной реактивности ААТ в сыворотке крови детей (2-4 года), взрослых (25-35 лет) и пожилых людей (старше 80 лет), было показано, что аутореактивный репертуар IgG здоровых индивидуумов гомогенен как среди представителей каждой возрастной группы, так и между группами [Lacroix-Desmazes et al., 1995; Mouthon et al., 1996]. В частности, репертуар аутореактивности естественных ААТ у некоторых здоровых людей сохранялся неизмененным спустя 20 лет [Lacroix-Desmazes et al., 1999]. Необходимо подчеркнуть, что в данном случае речь идет именно о наборе специфичностей ААТ, а не об уровне их содержания, который с возрастом может подвергаться колебаниям.
В литературе приводится интересное сравнение: индивидуальный набор аутоантигенов и, соответственно, набор ААТ к ним в цельной сыворотке, по сути, являются своеобразным «антительным» аналогом отпечатка пальца каждого индивидуума [Francoeur, 1988].
Реактивность ААТ по отношению к аутоантигенам в цельной сыворотке не идентична активности, наблюдаемой в препаратах очищенных ААТ, поскольку в цельной сыворотке аутореактивность ААТ как бы «замаскирована» [Hurez et al., 1993; Леках и др., 1997; Stahl et al., 2000]. Например, IgG цельной сыворотки отличается гетерогенностью взаимодействия ААТ с аутоантигенами у разных индивидуумов [Lacroix-Desmazes et al., 1995]. В то же время, реактивность очищенных IgG-антител по отношению к аутоантигенам проявляет удивительную гомогенность среди здоровых лиц [Mouthon et al., 1998].
Что касается репертуара реактивности IgG к чужеродным антигенам, то он, напротив, отличается гетерогенностью среди здоровых лиц, особенно разнообразен он у пожилых людей [Lacroix-Desmazes и др., 1995].
Таким образом, естественная аутореактивность тщательно отбирается для распознавания ограниченного набора аутоантигенов и с возрастом сохраняется стабильной, в то время как репертуар IgG-реактивности к чужеродным антигенам разнообразен и зависит от истории функционирования иммунной системы каждого индивидуума. Иными словами, естественный репертуар аутореактивных IgG отбирается в физиологических условиях для реагирования с набором аутоантигенов, общих для всех здоровых индивидуумов [Lacroix-Desmazes и др., 1995]. Столкновение с чужеродными антигенами в первые годы жизни может играть дополнительную роль в формировании зрелой аутореактивной иммунной системы. По-видимому, ААТ вносят вклад в установление и поддержание иммунологической памяти каким-то другим, отличным от классических иммунных реакций, способом [Mirilas et al., 1999].
Интеграция функциональных систем организма в поддержании гомеостаза
Решение вопроса о том, что есть норма в биологии и медицине, имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение. Так, например, необходимость в установлении четких критериев различия нормы и патологии возникает при постановке диагноза и выработке стратегии лечения.
Попытки определить общее понятие нормы предпринимались исследователями неоднократно. Суммируя различные определения нормы, Лебедев К.А. и др. (1989) пришли к. выводу, что норма есть понятие динамическое, включающее в себя характеристики функционирования и адаптации целостной системы организма. Иными словами, норма - это функциональный оптимум состояния системы.
В поддержании оптимального функционирования организма человека главная роль принадлежит иммунной, эндокринной и нервной системам, которые, будучи интегрированными на всех уровнях, являются важнейшими системами коммуникаций между органами и тканями [Панков, 1998]. Как же осуществляется взаимодействие между этими важнейшими регулирующими системами организма?
Установлено, что клетки иммунной системы наряду с интерлейкинами -молекулами, участвующими в передаче сигналов между иммунокомпетентными клетками - способны продуцировать различные регуляторные пептидные гормоны: адренокортикотропный, тиреотропный, соматотропный, окситоцин, нейрофизин и т.д. [Земсков и др., 1999]. Моноциты, лимфоциты, селезеночные макрофаги продуцируют или стимулируют выработку эндорфинов, у-меланоцитстимулирующего гормона, кортикотропиноподобного пептида. Показано, что многие медиаторы иммунной системы обладают выраженным гормоноподобным действием. Например, а- и (3-интерфероны индуцируют в культуре ткани надпочечников синтез кортикостероидов, меланина, тироксина.
В свою очередь, эндокринная система способна непосредственно модулировать функции иммунной системы. На лимфоцитах, моноцитах и макрофагах присутствуют рецепторы для глюкокортикостероидов, соматотропного гормона, ацетилхолина, обнаружено специфическое связывание андрогенов клетками тимуса и селезенки [Земсков и др., 1999; Martin, 2000]. Гормоны коры надпочечников ингибируют пролиферацию лимфоцитов, подавляют активацию лимфоидных клеток при иммунном ответе. Активирующим эффектом на иммунную систему обладают соматотропный гормон и инсулин, тироксин стимулирует пролиферативные и дифференцировочные процессы. [Ярилин и др., 1997]. Пролактин активизирует биосинтез гормонов тимусом и усиливает продукцию антител лимфоцитами человека [Панков, 1998].
На функционирование иммунной системы существенное влияние оказывают половые гормоны - эстрогены и андрогены. Они усиливают выработку гормонов тимуса, способствуют возрастной инволюции тимуса. Casson и др. (1993) исследовали эффект дополнительного введения дегидроэпиандростерона - предшественника в цепи синтеза половых стероидов - на клеточные иммунные реакции у женщин в стадии постменопаузы. Авторы обнаружили, что введение этого стероида приводит к угнетению Т-клеточного митогенеза и сокращению фракции клеток CD4+ (лимфоцитов Т-хелперного звена).
Установлено, что на поверхности иммунокомпетентных клеток присутствуют рецепторы к половым гормонам, участки связывания эстрогенов обнаружены на периферических мононуклеарных клетках крови, клетках селезенки и тимуса [Danel et al., 1983; Martin, 2000]. Стероидные гормоны способны влиять на баланс секретируемых иммунокомпетентными клетками цитокинов, участвующих в регуляции иммунного ответа. В экспериментах in vitro показано, что дегидроэпиандростерон ингибирует выработку IL-6 (кофактора дифференцировки и пролиферации В-лимфоцитов, стимулирующего выработку Ig всех классов [Ярилин и др., 1997]) нестимулированными клетками селезенки человека [James et al., 1997]. Показано, что эстрогены могут стимулировать клетки CD4+ к продукции IL-4, ответственного за поликлональную активацию В-лимфоцитов [Huber et al., 1999].
Эстрогены способствуют поликлональнои активации и экспансии плазматических клеток [Bynoe et al., 2000; Kanda et al., 1999]. Показано, что эстрадиол способен нарушать толерантность В-клеток и индуцировать СКВ-подобные проявления у неаутоиммунной линии мышей [Tsokos, 2000]. Предполагают, что участие эстрогенов в поликлональнои активации аутореактивных В-клеток является важным звеном в развитии аутоиммунных заболеваний у женщин, которые встречаются у них в 10 раз чаще, чем у мужчин [Martin, 2000]. Повышение уровня содержания эстрогенов тормозит апоптоз и способствует длительной персистенции аутореактивных популяций В-лимфоцитов, которые в обычных условиях подлежат уничтожению [Bynoe et al., 2000]. Тестостерон, напротив, оказывает ингибирующее влияние на выработку иммуноглобулинов [Kanda et al., 1996].
Определение аутоантител к ДНК методом иммуноферментного анализа
Определение уровня содержания ААТ к ДНК проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА), оптимизированным ранее в нашей лаборатории [Саттарова, 1994].
В качестве антигена использовали нДНК, выделенную из эритроцитов цыплят. Степень депротеинизации препарата ДНК оценивали по соотношению оптических плотностей раствора ДНК при длинах волн 280 и 260 нм (Е28(/Е2бо)- У ДНК, используемой нами в работе, это соотношение составило 2,0, что соответствует максимальной степени депротеинизации ДНК. О степени нативности препарата ДНК судили по величине гиперхромного эффекта, который в наших экспериментах составил 43%.
Денатурированную ДНК получали из нативной ДНК методом тепловой денатурации.
Исследуемые образцы сыворотки инкубировали при 56С в течение 40 мин для инактивации белков системы комплемента.
Для выявления в лунках планшета антител, связавшихся с ДНК, использовали конъюгированные с пероксидазой антитела против иммуноглобулинов человека (Вектор-BEST) и моноклональные антитела CH1/HRP против IgG человека (ООО "Сорбент"), именуемые далее как «конъюгат». Рабочую концентрацию конъюгата определяли, исходя из данных предварительного эксперимента по выяснению оптимального разведения каждой серии конъюгата.
ИФА проводили по следующей схеме. В лунки активированных ультрафиолетовым светом планшетов (облучение в течение 2 часов на расстоянии 15 см от источника) вносили раствор ДНК (10 мкг/мл - как нДНК, так и дДНК) на 0,1 М фосфат - 0,05 М цитратном буфере, рН 5,0 (ЦБ). Планшеты с сорбируемой ДНК инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, после чего несвязавшуюся ДНК трижды отмывали фосфатно-солевым буфером с твином (ФСБТ): 0,01М фосфатный буфер, рН 7,2; 0,1М
NaCl; 0,05% твин-20. Далее в подготовленные планшеты вносили образцы сыворотки крови, разведенные ФСБТ в соотношении 1:100, после чего планшеты инкубировали в течение 1,5 часов при 37С, а затем 0,5 часа при 4С. По окончании инкубации планшеты трижды промывали ФСБТ и вносили рабочий раствор конъюгата, приготовленный на ФСБТ. После внесения раствора конъюгата планшеты инкубировали и промывали, как описано выше. После указанных манипуляций планшеты несколько раз ополаскивали дистиллированной водой и вносили субстратную смесь, приготовленную на ЦБ и содержащую 0,05% Н2О2 и 0,4 мкг/мл орто-фенилендиамина. Планшеты с субстратной смесью инкубировали в течение 0,5 часа в темноте при комнатной температуре, после чего измеряли уровень ответа цветной реакции ИФА на спектрофотометре "Multiskan" в единицах
ОПТИЧеСКОЙ ПЛОТНОСТИ При ДЛИНе ВОЛНЫ 492 HM (ОІІ492)
Одним из важных условий при определении ААТ, содержащихся в сыворотке крови здоровых людей в довольно небольших титрах, является оптимальная рабочая концентрация конъюгата. Поскольку отдельные партии конъюгата всегда варьируют по качеству, то перед использованием каждой новой серии необходимо проверять ее реакционную способность титрованием.
В работе были использованы лиофильно высушенные AT ("Вектор-BEST" - конъюгат-1) и раствор моноклональных AT CHi/HRP ("Сорбент" -конъюгат-2). Конъюгат-1 растворяли в 100 мкл ФСБТ, после чего титровали ФСБТ в диапазоне концентраций 1:50-1:400. Конъюгат-2 титровали ФСБТ в диапазоне 1:1000-1:20000.
Далее проводили реакцию ИФА по указанной в пункте 2.3 схеме. В качестве АГ использовали нДНК, в качестве источника AT - сыворотку крови больных СКВ. Оптимальную рабочую концентрацию конъюгата выбирали на линейном участке кривой титрования, где наблюдались максимальный уровень ответа реакции ИФА (ОП492 не менее 0.8-1.0) и нулевое значение неспецифического связывания конъюгата с полистиролом.
В результате экспериментальной проверки было выяснено, что оптимальные рабочие концентрации указанных конъюгатов 1 и 2 составляют: 1:50 и 1:2000, соответственно.
Для исследования специфичности ААТ к нДНК и ААТ к дДНК анализировали специфичную и перекрестную реактивность ААТ к нативной и денатурированной ДНК методом истощения сыворотки соответствующими антигенами в диапазоне истощающего антигена 0,3-10 мкг/мл. Схема эксперимента приведена на рис.1.
Готовили серию растворов (в ФСБТ) нДНК и дДНК следующих концентраций: 0,32; 0,63; 1,25; 2,5; 5; 10 мкг/мл. Цельную сыворотку крови (предварительно инкубированную в течение 30 мин при 56С) вносили в полученные растворы ДНК в конечной концентрации 1:100 и инкубировали в течение 1 часа при 37С с непрерывным перемешиванием, затем еще 30 мин при 4С, без перемешивания. Истощенную таким образом сыворотку вносили на планшет с иммобилизованной ДНК, далее реакцию ИФА проводили по вышеописанной схеме (п.2.3). В качестве контроля использовали неистощенный образец этой же сыворотки, инкубированный в аналогичных условиях.
Содержание аутоантител к ДНК в сыворотке крови в норме
Нами исследовано содержание ААТ к нДНК и дДНК в сыворотке крови практически здоровых людей в возрасте от 4 до 82 лет (140 человек). Результаты анализа представлены на рис.3. Как видно из рисунка, во всех анализируемых образцах сыворотки крови обнаружены ААТ к обоим типам ДНК. Уровень содержания ААТ к нДНК (рис.За) колеблется в пределах от 0,06 до 0,49 отн.ед. Подавляющая часть индивидуальных показателей уровня содержания ААТ к нДНК образует компактную группу, в которой содержание ААТ не превышает 0,25 отн.ед. Тем не менее, у 20% обследованных лиц показатели уровня содержания ААТ к нДНК превосходят этот уровень, в ряде случаев индивидуальные значения содержания ААТ различаются почти на порядок.
Содержание ААТ к дДНК (рис.36) находится в пределах 0,06-0,68 отн.ед. В большинстве обследованных образцов сыворотки крови уровень содержания ААТ к дДНК не превышает 0,46 отн.ед. В то же время, 11% показателей существенно выше этого значения. Аналогично содержанию ААТ к нДНК, различия среди индивидуальных показателей содержания ААТ к дДНК могут достигать величины целого порядка.
Распределение частот индивидуальных показателей уровня содержания ААТ к ДНК представлено на рис.4. Из рисунка видно, что индивидуальные значения уровня содержания ААТ как к нДНК, так и к дДНК, распределены несимметрично, т.е. максимальная частота встречаемости индивидуальных показателей уровня содержания ААТ не совпадает со средними значениями коридора варьирования содержания ААТ.
Закономерность варьирования индивидуальных показателей уровня содержания ААТ к ДНК оценивали с применением коэффициентов асимметрии (табл.1).
Варьирование индивидуальных показателей содержания ААТ к обоим типам ДІЖ проявляет выраженную положительную асимметрию (поскольку величина среднего арифметического превышает показатель структурного среднего - медианы) и, следовательно, не подчиняется законам нормального распределения. Коэффициент асимметрии распределения уровня содержания ААТ к нДНК составляет 1,23, аналогичный показатель для ААТ к дДНК равен 0,80, что существенно превышает допустимое для нормального распределения значение на уровне значимости 95%. Это делает некорректным использование для характеристики полученных выборок таких статистических параметров, как среднее и стандартное отклонение. В связи с этим оценку среднего уровня содержания ААТ к ДНК проводили с использованием медианы и перцентилей - 2,5-го и 97,5-го [Гланц, 1999]. Вычисленный таким образом средний уровень порогового содержания ААТ к ДНК в популяции здоровых лиц представлен на рис.5. Он составляет 0,17 (0,07; 0,45) и 0,29 (0,12; 0,59) отн.ед. для анти-нДНК и анти-дДНК ААТ, соответственно (рис.5). Для более четкой характеристики распределения выборки индивидуальных показателей уровня содержания ААТ как к нДНК, использовали 25-й и 75-й перцентили, между которыми расположено 50% значений уровня содержания ААТ.
Образцы сыворотки крови здоровых лиц, использованные для исследования ААТ к ДНК, принадлежали людям различных возрастов. Мы распределили индивидуальные показатели уровней содержания ААТ к ДНК на 6 выборок, согласно физиологическим границам определенных возрастных периодов жизни человека [Аршавский, 1982; Сметник и Тумилович, 1995]. Возрастной состав группы здоровых лиц представлен в таблице 2. Уровни содержания ААТ к нДНК на разных стадиях онтогенеза представлены на рис.6, (рисунок организован аналогично рис.5). Из рисунка видно, что практически во всех возрастных подгруппах распределение значений уровня содержания ААТ к нДНК асимметрично, и, следовательно, не подчиняется законам нормального распределения. Индивидуальные показатели уровня содержания ААТ в детском возрасте распределяются достаточно компактно. Средний уровень содержания ААТ к нДНК (медиана) стабилен в период от 4 до 36 лет. В период полового созревания (2-я подгр.) отмечается существенное увеличение размаха вариабельности индивидуальных показателей уровня содержания ААТ, наблюдаемое в дальнейшем в возрастных подгруппах 3-5. В возрасте 36-43 лет (4-я подгр.) средний уровень содержания ААТ к нДНК достоверно увеличивается, после чего проявляется тенденция к снижению до исходного уровня с дальнейшей стабилизацией в пожилом возрасте. Одновременно с этим в пожилом возрасте происходит сужение коридора колебаний индивидуальных значений уровня содержания ААТ к нДНК.
Содержание ААТ к дДНК в подгруппах здоровых лиц разного возраста приведено на рис.7. Достоверное повышение уровня содержания ААТ к дДНК на протяжении жизни отмечается дважды: в период полового созревания (подгр.2) и в возрасте 36-43 лет (подгр.4). Расширение диапазона колебаний индивидуальных значений уровня содержания ААТ к нДНК происходит в подростковом возрасте. Максимальный размах вариабельности индивидуальных показателей уровня содержания ААТ наблюдается в период 36-43 лет, после чего диапазон колебаний несколько сужается.
Группа обследованных здоровых людей включала в себя лиц обоего пола. Средние уровни содержания ААТ к нДНК и дДНК в сыворотке крови мужчин и женщин представлены на рис.8. Как видно из рисунка, у женщин средний уровень содержания ААТ как к нДНК, так и к дДНК, в 1,3 раза превышает аналогичные показатели в группе мужчин (различия статистически достоверны, Р 0,05). Следует отметить, что у женщин размах вариабельности индивидуальных показателей уровня содержания ААТ к обоим типам ДНК превосходит размеры диапазона колебаний уровня содержания ААТ у мужчин.
Для того, чтобы исследовать влияние возраста на уровень содержания ААТ к ДНК в сыворотке крови, индивидуальные показатели содержания ААТ к нДНК и дДНК у мужчин и женщин распределили на возрастные подгруппы, как показано выше.
