Введение к работе
Актуальность проблемы
Известно, что основу всех метаболических процессов составляют ферменты, изучению молекулярных механизмов действия очищенных препаратов которых уделяется огромное внимание. Однако такой классический подход мало что даёт для оценки каталитических свойств ферментов клетки, находящихся в динамическом взаимодействии друг с другом и обуславливающих ее функционирование и поведение (Зимин, 2001).
По современным представлениям "растворимые" ферменты могут обратимо взаимодействовать с субклеточными структурами. Контролируемая метаболитами обратимая адсорбция энзимов на мембранах органелл расширяет регуляторные возможности клетки (Mitchison, 1992; Parkhouse et al., 1992; Shmelev et al., 1997; Lushchak, 1998).
Способность образовывать комплексы характерна и для ключевого фермента биотрансформации печени алкогольдегидрогеназы (АДГ). Проводились эксперименты по включению АДГ в искусственные мембраны. Показано, что увеличение количества алкогольдегидрогеназы, связанной на единицу массы носителя, сопровождается снижением её активности, причиной которого являются возникающие диффузионные затруднения, препятствующие доступу субстратов к активным центрам фермента (Riveros – Rosas, 1997).
При физиологическом состоянии организма в реакции, катализируемой АДГ, происходит реокисление НАДН и увеличение НАД. Таким образом, АДГ участвует в регуляции отношения НАДН/НАД в клетке, конкурируя с другими НАД-оксидоредуктазами за кофермент. Имеются доказательства тесной метаболической связи между обменами субстратов и продуктов алкогольдегидрогеназной и лактатдегидрогеназной реакций: этанол-ацетальдегид и лактат-пируват (Сатановская и др., 2002). Лактатдегидрогеназа (ЛДГ), как фермент гликолиза, играет важную роль в регуляции энергетического обмена клетки. Согласно литературным данным, ЛДГ способна взаимодействовать с мембранами субклеточных органелл, изменяя при этом свою активность (Hashimoto et al., 2008; De Bari et al., 2010). На основании различия кинетических характеристик для мембранной и «свободной» форм ЛДГ предполагается, что связывание фермента с митохондриями играет важную регуляторную роль в клетке. Динамическое равновесие между мембраносвязанной и «свободной» формами фермента в клетке регулируется субстратами и НАД/НАДН.
Существуют сведения о взаимодействии данных ферментов в условиях in vitro (Chaubey et al., 2001; Trivedi еt al., 2005; Tsai et al., 2007; Nicolau et al., 2012). Ранее уже высказывалась гипотеза о связи образованного комплекса ЛДГ – АДГ со структурными компонентами клетки, в частности, с митохондриями (Зимин и др., 2001; 2009; 2012). На примере алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, можно рассмотреть возможности формирования различных вариантов надмолекулярных ансамблей, включающих различные конформационные состояния ферментов, существование фермент - ферментных комплексов, а также взаимодействие ферментов с мембранными структурами.
Следует отметить, что современное развитие медицинской энзимологии практически невозможно без изучения каталитических свойств мультиэнзимных комплексов клетки. Подобные исследования, в частности, раскрывают молекулярную сущность функции печени и составляют рациональную основу для разработки новых подходов к профилактике, ранней диагностике и возможности эффективного лечения различных патологических альтераций данного органа (Зимин и др., 2009).
Поражения печени наблюдаются уже в первые часы после воздействия различных ксенобиотиков (Зимин и др., 2001; Михайлова и др., 2009; Попова и др. 2009; Clichici et al., 2011). К ксенобиотикам с высокой степенью избирательной гепатотоксичности относят хлорированные углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан (CCl4). Отравление экспериментальных животных этим токсином по морфологической характеристике и биохимическим изменениям близко к острым поражениям печени у человека. Имеются данные, что в результате введения четыреххлористого углерода происходит усиление свободнорадикальных процессов и как следствие изменение метаболизма печени, сопровождающееся нарушением активности ферментативных систем (Тутельян и др., 2009).
В настоящее время отсутствуют какие-либо представления о роли функционального взаимодействия ЛДГ-АДГ в составе надмолекулярного кластера в молекулярных механизмах поражения печени на модели острого токсического гепатита при однократном действии ксенобиотика.
Цель исследования
Целью данной работы явилось исследование кинетических параметров надмолекулярного кластера ЛДГ-АДГ в норме и при токсическом действии гепатотропного ксенобиотика CCl4.
Задачи исследования:
1) Изучить особенности каталитической активности и кинетических свойств препаратов очищенных ферментов ЛДГ, АДГ в процессе формирования кластера ЛДГ-АДГ.
2) Сравнить изменения регуляторных свойств НАД-оксидоредуктаз в субклеточных фракциях печени крыс в составе кластера ЛДГ-АДГ в норме и при гепатопатии.
3) Исследовать кинетические параметры ЛДГ и АДГ печени интактных животных и крыс, подвергшихся воздействию CCl4.
4) Определить степень взаимодействия ферментативного комплекса ЛДГ-АДГ с мембраной митохондрий в норме и при токсическом гепатите.
Научная новизна работы
Впервые обосновано положение о взаимодействии ЛДГ и АДГ в составе надмолекулярного функционального кластера, связанного с мембранами субклеточных органелл клеток печени и предложена новая гипотеза ферментативного катализа в гетерогенной надмолекулярной системе на основе кластеро-кинетической модели.
Выявлено, что АДГ и ЛДГ прочно связаны с мембранами митохондрий и устойчивы к солюбилизирующему действию 0,15 М NaCl.
Установлено, что характер взаимодействия ЛДГ, АДГ с мембранами субклеточных органелл печени, а также их каталитические свойства, зависят от физиологического состояния организма и изменяются при действии токсического ксенобиотика (тетрахлорметана).
Впервые выявлены особенности регуляции оксидоредуктаз печени при экспериментальном токсическом гепатите, выражающиеся в падении активности и нарушении процесса взаимодействия ферментов с мембраной митохондрий.
Научно-практическое значение работы
Получены данные изменения каталитических свойств ЛДГ, АДГ, которые расширяют современные представления о механизмах регуляции метаболической адаптации нормальной и патологически измененной печени, способствуя пониманию молекулярных механизмов резистентности данного органа к воздействию токсичных ксенобиотиков.
Основные научные положения, выносимые на защиту
-
Показана возможность образования надмолекулярного функционального кластера, ЛДГ-АДГ, для препаратов очищенных ферментов и различных компартментов клетки.
-
Установлено образование различных надмолекулярных кластеров ЛДГобр-АДГобр и АДГпр-ЛДГпр в субклеточных органеллах и участие их в молекулярных механизмах реализации метаболического эффекта гепатотоксичного ксенобиотика.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и опубликованы на III–ей международной конференции всероссийского конгресса студентов и аспирантов–биологов «Симбиоз Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010 г.); на IV–ой международной конференции всероссийского конгресса студентов и аспирантов–биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011 г.); на II–ой международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2011 г.); в международной конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Куба, 2011 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, и 7 тезисов докладов региональных, всероссийских и международных научных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа в объеме 202 страниц содержит главы: обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Диссертация иллюстрирована 22 таблицами, 23 рисунками. Библиографические указания включают 246 литературных источника (отечественных 105 иностранных 141).
