Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Наследственные нейродегенеративные заболевания 12
1.1 Генная терапия в лечении нейродегенеративных заболеваний 12
1.1 Болезнь Альцгеймера 16
1.2 Болезнь Паркинсона 20
1.4 Нейродегенеративные заболевания, связанные с удлинением полиглутаминового фрагмента 25
Глава 2. Болезнь Хантингтона 30
2.1 Распространенность и клинические проявления болезни Хантингтона 30
2.2 Структура и функции хантингтина 34
2.3 Взаимодействие хантингтина с факторами транскрипции 37
2.4 Клеточная модель патогенеза болезни Хантингтона 40
2.5 Подходы к лечению болезни Хантингтона 43
Глава 3. Потенциальные механизмы токсичности хантингтина: факты и гипотезы 46
3.1 Образование агрегатов и токсичность 46
3.2 Инактивация транскрипционных факторов 48
3.3 Протеасомный стресс и регуляция клеточного цикла 50
Глава 4. Использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модели для изучения токсичности полиглутаминов 52
4.1 Дрожжи как экспериментальная модель для изучения программируемой клеточной гибели 52
4.2 Моделирование агрегации и токсичности полиглутаминов на дрожжах 54
4.3 Преимущества и ограничения дрожжевой модели 56
Материалы и методы исследования 59
Глава 1. Материалы исследования 59
1.1 Генотипы использованных штаммов дрожжей 59
1.2 Генотипы использованных штаммов бактерий 61
1.3 Генетические конструкции, плазмиды 61
1.4 Реактивы, ферменты, буферы 64
Глава 2. Культивирование дрожжей 65
2.1 Условия культивирования 65
2.2 Среды для культивирования 65
2.3 Оценка выживания по КОЕ 67
Глава 3. Микроскопия 68
3.1 Оценка выживания по окрашиванию клеток 68
3.2 Окрашивание клеток на ДНК. 68
Глава 4. Биохимические методы 69
4.1 Экстракция белков из дрожжевых клеток 69
4.2 Электрофоретическое разделение белков в ПААГ 69
4.3 Оценка уровня карбонилирования белков 70
4.4 Измерение скорости поглощения кислорода 71
Глава 5. Молекулярно-биологические методы 72
5.1 Выделение геномной ДНК из дрожжей 72
5.2 Выделение плазмидной ДНК из бактерий 72
5.3 Горизонтальный гель-электрофорез ДНК 73
5.4 Выделение ДНК из агарозного геля 73
5.5 Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 74
5.6 Реакция дефосфорилирования 74
5.7 Реакция лигирования 74
5.8 Полимеразная цепная реакция 75
5.9 Трансформация бактериальных клеток 77
5.10 Трансформация дрожжей 78
5.11 Секвенирование 80
Глава 6. Комплексные методики 81
6.1 Получение мутантных линий с полностью инактивированным геном 81
6.2 Общая схема генетического скрининга 82
Результаты 85
Глава 1. Исследование токсических свойств полиглутаминового фрагмента хантингтина на дрожжевой модели 85
Глава 2. Исследование агрегации полиглутаминового фрагмента хантингтина на дрожжевой модели 88
Глава 3. Исследование программируемой клеточной гибели дрожжей, вызванной экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина 91
3.1 Признаки программируемой клеточной гибели, детектируемые при экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах 91
3.2 Влияние антиоксидантов на выживаемость и колониеобразующие свойства дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина 95
Глава 4. Исследование функции гена YCA1 98
4.1 Влияние гена YCA1 на ядерную локализацию агрегатов полиглутаминового фрагмента хантингтина 98
4.2 Оценка уровня карбонилированных белков в штаммах, экспрессирующих полиглутаминовый фрагмент 100
4.3 Влияние гена YCA1 на выживаемость и колониеобразующую способность клеток, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина 101
4.4 Влияние экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина и гена YCA1 на клеточный цикл 104
Глава 5. Скрининг генов, вовлеченных в проявление токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина 108
5.1 Описание скрининга 108
5.2 Результаты скрининга 109
5.3 Анализ полученных мутантов на устойчивость к экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина 112
Глава 6. Исследование функции гена ASE1 116
Глава 7. Исследование функции генов CDH1 и CLB2 118
Обсуждение 123
Выводы 128
Список работ, опубликованных по теме диссертации 129
Список использованной литературы 130
- Болезнь Паркинсона
- Признаки программируемой клеточной гибели, детектируемые при экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах
- Анализ полученных мутантов на устойчивость к экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина
- Исследование функции генов CDH1 и CLB2
Введение к работе
Актуальность проблемы
Существует целый класс заболеваний человека, которые вызваны дисфункцией или гибелью клеток нервной системы. Эти заболевания, называемые нейродегенеративными, проявляются в нарушении функций организма, связанных с деятельностью головного мозга. Появление внутриклеточных белковых агрегатов является общим свойством многих нейр о дегенеративных заболеваний, таких, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона (Taylor et al., 2002). До сих пор неясно, является ли образование таких агрегатов ключевым фактором, необходимым для развития патологического процесса, или же оно представляет собой клеточный ответ, направленный на противодействие накоплению неправильно собранных белков.
Агрегация и токсичность полиглутаминов в настоящее время широко исследуется на различных клеточных культурах и организмах. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются весьма удобной в экспериментальном плане моделью для изучения заболеваний, связанных с образованием белковых агрегатов, в частности, болезни Хантингтона (Outeiro and Giorgini, 2006). Первая дрожжевая модель для изучения патофизиологических эффектов хантингтина была предложена в 2002 году: было показано, что экспрессия N-концевой части удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae приводит к замедлению роста, нарушению клеточного цикла, образованию агрегатов в цитоплазме и ядре (Meriin et al., 2002).
Одним из главных преимуществ «дрожжевой» модели является возможность проведения скрининга по поиску генов, вовлеченных в развитие патологического процесса, вызванного удлинением полиглутаминового фрагмента хантингтина. Легкость генетических манипуляций позволяет выявить гены, регулирующие продолжительность жизни дрожжей,
активирующие клеточные механизмы ответа на стрессовые факторы, и затем использовать полученные результаты для лучшего понимания генной регуляции старения и дегенерации нейронов.
Показано, что клеточные и молекулярные признаки токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина у дрожжей и нейронов во многом схожи (Sokolov et al., 2006), поэтому есть основания полагать, что полученные данные позволят выявить общие закономерности развития патологии и будут способствовать поиску новых методов лечения болезни Хантингтона.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было исследование причин токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, а также поиск генов, кодирующих белки, которые вовлечены в агрегацию полиглутаминов.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Установить патофизиологические последствия экспрессии удлиненного
полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах.
2. Выяснить, какую роль в проявлении токсичности удлиненного
полиглутаминового фрагмента хантингтина играет дрожжевая метакаспаза
Ycal.
Провести поиск генов, кодирующих белки, которые участвуют в развитии патологии при экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина.
Определить роль идентифицированных генов в механизме клеточной гибели дрожжей, вызванной экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина.
Научная новизна работы
Показано, что экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина сопровождается некоторыми признаками программированной клеточной гибели: образованием активных форм кислорода (АФК), фрагментацией митохондрий, деградацией ядерной ДНК. При этом нарушение гена дрожжевой метакаспазы влияло как на локализацию полиглутаминовых агрегатов, так и на выживание клеток.
В ходе дрожжевого скрининга установлено, что нарушение гена ASE1, который кодирует белок, являющийся субстратом для АРС-комплекса, снижает токсичность полиглутаминового фрагмента хантингтина. В то же время показано, что гиперэкспрессия гена CDH1, являющегося активатором АРС-комплекса, и нарушение гена CLB2, кодирующего циклин В, также повышает выживаемость и колониеобразующую способность клеток, экспрессирующих мутантный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.
На основании этих данных разработана модель механизма токсичности полиглутаминового фрагмента хантингтина для дрожжей, включающая взаимодействие мутантного хантингтина с ядерными белками - факторами транскрипции, нарушение функционирования убиквитин-протеасомной системы и систем, ответственных за регуляцию клеточного цикла.
Научно-практическая ценность исследования
Работа имеет теоретическое значение для понимания механизмов развития патофизиологических процессов в клетках, связанных с агрегацией по лиг лутаминсо держащих белков. Полученные результаты могут косвенно свидетельствовать о процессах, приводящих к патологии клеток при болезни Хантингтона и других полиглутаминзависимых нейродегенеративных заболеваниях, и, возможно, в дальнейшем могут быть использованы при разработке новых способов лечения таких болезней.
Апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите на семинаре Института биохимии имени А.Н. Баха. Материалы диссертации были представлены на XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), 6-й международной конференции по апоптозу дрожжей (Левен, Бельгия, 2008).
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), раздела «Материалы и методы исследования» (6 глав), результатов (7 глав), обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 147 страницах, содержит 46 рисунков и 9 таблиц. Список литературы включает 189 работ, из них 183 на иностранных языках.
Болезнь Паркинсона
В 1912 г. Ф. Леви описал аномальные белковые образования внутри нейронов, главным компонентом которых являлся белок альфа-синуклеин. В настоящее время считается, что мутации в гене альфа-синуклеина являются причиной возникновения еще одного неизлечимого нейродегенеративного заболевания, приводящего к двигательным расстройствам и нарушению координации движений, -болезни Паркинсона, которая была описана в 1817 г. Дж. Паркинсоном как «дрожательный паралич» и является одним из самых распространенных нейродегенеративных расстройств (Trojanowski and Lee, 1998). Такие нарушения обусловлены гибелью нервных клеток, в первую очередь утратой пигментсодержащих нейронов черной субстанции, вырабатывающих дофамин.
Нейропатологической особенностью болезни Паркинсона является присутствие в клетках мозга так называемых телец Леви -амилоидоподобных структур, образованных альфа-синуклеином (рис. 3). Аналогичные образования характерны также для болезни Альцгеймера и хореи Хантингтона. Являются ли эти агрегаты причиной деструктивных изменений или, напротив, выполняют защитные функции, удерживая аномальные, токсичные для нейрона белки от распространения по всей клетке, - в настоящее время неизвестно. Исследования на трансгенных мышах и плодовых мухах подтверждают важную роль агрегации альфа-синуклеина для проявления его токсических свойств при болезни Паркинсона (Feany and Bender, 2000; Giasson et al., 2002). Появление точечных мутаций в альфа-синуклеине усиливает его олигомеризацию и приводит к образованию структурных фибриллярных интермедиатов или протофибрилл.
В патогенез болезни Паркинсона большой вклад вносят нарушения в работе шаперонов и убиквитин-протеасомной системы. Мутация в гене альфа-синуклеина приводит к каскаду реакций, в результате которых накапливается большое количество неправильно собранных белков, образующих агрегаты. Как только таких белков становится слишком много, клеточные механизмы очистки перестают справляться с работой и нейроны погибают (Ross and Pickart, 2004; Winklhofer and Tatzelt, 2006).
В последнее время появились сообщения об идентификации целого ряда других генов, имеющих отношение к паркинсонизму (Gasser, 2005). В частности, в 1998 г. был идентифицирован ген, кодирующий белок паркин, мутация в котором приводит к наследственному паркинсонизму, но другого типа (Kitada et al., 1998). Такая мутация обычно встречается у людей, заболевших в возрасте до 40 лет, и чем моложе пациент, тем выше вероятность, что в основе заболевания лежит мутация в данном гене. Мутации в гене паркина встречаются чаще, чем в гене альфа-синуклеина. Имеющиеся на сегодня данные позволяют предположить, что гибель нейронов при данной форме паркинсонизма происходит, в частности, вследствие нарушения процесса убиквитинилирования - составного компонента системы удаления аномальных белков. У некоторых больных, несущих мутацию в гене паркина, в нейронах черной субстанции отсутствуют тельца Леви. Это означает, что, пока происходит убиквитинилирование, белковые агрегаты не образуются. Поскольку у людей с мутацией в гене паркина паркинсонизм развивается в молодом возрасте, можно предположить, что у них отсутствует защитный механизм, обеспечивающий кластеризацию токсичных белков (Mata et al., 2004).
По всей видимости, механизмы агрегации и проявления токсичности альфа-синуклеина и паркина сходны (см. рис. 4, Losano and Kalia, 2005). Мутантный белок (альфа-синуклеин или паркин) приобретает такую пространственную конфигурацию, при которой протеасома не может его расщепить (рис. 4а). Затем аномальные белки собираются в кластеры - так называемые тельца Леви (рис. 46). Вначале эти кластеры дают клетке некоторые преимущества, и она погибает позже, чем в том случае, когда неправильно упакованные белки распределяются по всему нейрону (рис. 4в), поскольку аномальные белки держатся вместе, а не распространяются по клетке, вызывая повреждения. Когда аномальных белков становится слишком много, клеточная убиквитин-протеасомная система перестает справляться с работой, шаперонов не хватает, токсичные белки накапливаются, и в конце концов нейроны погибают.
Лечение болезни Паркинсона, так же, как и болезни Альцгеймера, в настоящее время преимущественно сводится к устранению симптоматики заболевания, и не приводит к полному выздоровлению пациентов.
В качестве фармакологических препаратов при лечении болезни Паркинсона используются предшественник дофамина диоксифенилаланин, антагонисты дофиминовых рецепторов, ингибиторы моноаминооксидазы и обратного нейронального захвата дофамина, холиноблокаторы, а также антиоксиданты (Schapira, 2005; Radad et al., 2005; Shults, 2005). Помимо этого, применяются хирургические способы лечения, а также высокочастотная электростимуляция определенных разделов головного мозга (Broggi et al., 2006).
Направления исследований в области лечения этой болезни в настоящее время сводятся к поиску способов, устраняющих не только симптомы, но и неиродегенеративные процессы, приводящие к патологии. Предпринимаются попытки разработать вещества, стимулирующие работу шаперонов или проявляющие сходную с ними активность в клетке. Большие надежды возлагаются на генную терапию, использование эмбриональных стволовых клеток и нейротрансплантацию (Mandel et al., 1999; Mochizuki and Mizuno, 2003). И в этих исследованиях использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве одной из моделей для изучения агрегации и токсичности альфа-синуклеина играет не последнюю роль. Показано, что экспрессия альфа-синуклеина в дрожжах вызывает эффекты, сходные с теми, что происходят в нейронах мозга, что позволяет говорить о перспективах использования данной модели для изучения болезни Паркинсона и других наследственных нейродегенеративных заболеваний ( Witt and Flower, 2006).
Признаки программируемой клеточной гибели, детектируемые при экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах
На линиях клеток млекопитающих, используемых в качестве модели полиглутаминзависимых заболеваний, показано, что их гибель сопровождается признаками апоптоза (Wellingtonand and Hayden, 2000). Мы решили выяснить, справедливо ли это для дрожжевой модели болезни Хантингтона, и какие признаки программированной клеточной смерти можно детектировать при экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина.
Считается, что увеличение потенциала митохондриальной мембраны влечет за собой образование активных форм кислорода (АФК), что затем приводит к запуску каскада программируемой клеточной гибели (Skulachev, 1996; Korshunov et al., 1997; Davermann et al., 2002). Для того, чтобы проверить, повлияет ли экспрессия мутантного хантингтина на величину потенциала митохондриальной мембраны, клетки, экспрессирующие 25Q и 103Q в течение 12 часов, окрашивали Митотрекером Оранжевым. Было показано, что Митотрекер Оранжевый накапливается в митохондриях потенциалзависимым образом, поэтому с его помощью можно оценивать степень гиперполяризации митохондрий (Pozniakovsky et al., 2005). Митотрекер Оранжевый сравнительно слабо окрашивал клетки, экспрессирующие 25Q, в то же время он накапливался в митохондриях клеток, экспрессирующих 103Q (рис. 22). Также были отмечены существенные отличия в морфологии митохондрий у этих двух штаммов: при экспрессии 25Q митохондрии представляли собой совокупность филаментов, объединенных в сеть, а в клетках, экспрессирующих 103Q, можно было наблюдать отдельные фрагменты митохондрий, имеющие округлую форму (рис. 22).
Фрагментация митохондрий является признаком программированной гибели как у млекопитающих, так и у дрожжей (Skulachev et al., 2004), таким образом, было получено еще одно свидетельство проапоптотического действия экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина на дрожжи.
Окраска клеток зондами, детектирующими активные формы кислорода, показала, что уровень АФК в клетках дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент, существенно выше, чем в клетках, экспрессирующих полиглутаминовый фрагмент нормальной длины (рис. 23).
При оценке значения трансмембранного потенциала митохондрий с помощью флуоресцентных зондов возможно возникновение целого ряда артефактов, связанных с изменением объема митохондрий или взаимодействием зонда с веществами клетки. Поэтому мы решили исследовать это явление другими методами. Косвенно о трансмембранном потенциале можно судить по соотношению скоростей дыхания в присутствии разобщителя и без него.
Добавление FCCP, являющегося разобщителем электронного транспорта и синтеза АТР, к клеткам дрожжей не вызвало существенного отличия в скоростях поглощения кислорода между штаммами, экспрессирующими нормальный и удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина (рис. 24). Таким образом, вопрос о вкладе генерации АФК в токсичность мутантного полиглутаминового фрагмента остается открытым и требует дальнейшего рассмотрения.
Анализ полученных мутантов на устойчивость к экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина
Далее мы проверили, как инактивация некоторых генов, полученных в ходе скрининга, влияет на выживаемость дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина. Наибольший интерес вызвали следующие гены: РТР2, NPT1, ASE1, VPS36, TUS1, ICY1. Ген РТР2 кодирует тирозиновую фосфатазу, которая участвует в инактивации МАР-киназ в ответ на изменение осмотического давления на клетку. Этот ген вызвал интерес, поскольку известно, что апоптоз дрожжей, индуцированный половым феромоном (Severin and Hyman, 2002) или осмотином медиируется МАР-киназным каскадом. Ген NPT1 кодирует никотинатфосфорибозилтрансферазу, участвующую в биосинтезе НАД+ и регулирующую сайленсинг ДНК, кодирующих рибосомальную РНК, теломер, и МАТ локуса. Ген ASE1 кодирует белок митотического веретена, который является субстратом АРС-комплекса - основного регулятора клеточного цикла. Этот ген вызывал интерес в свете полученных ранее данных о влиянии экспрессии полиглутаминового фрагмента хантингтина на клеточный цикл. Ген VPS36 кодирует белок, являющийся компонентом ESCRT-II комплекса и участвующий в убиквитин-зависимом сортинге белков в эндосомы, что также интересно с точки зрения проявления токсичности полиглутаминового фрагмента.
Ген TUS1 кодирует белок - фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, модулятор Rholp как компонента каскада поддержки клеточной целостности. Функция гена ICY1 в настоящее время не установлена, однако известно, что мутанты по этому гену проявляют нарушения инвазивного роста и имеют характерную вытянутую морфологию. Мы предположили, что полная инактивация данных генов может снизить проявления токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах, и решили проверить это экспериментально. Для этого полученные мутантные штаммы растили на жидкой и твердой среде, содержащей галактозу, и оценивали скорость роста по оптической плотности и колониеобразующую способность.
В качестве контролен использовали штамм W303-1A 103Q, а также штамм W303-1A Aade2 103Q, чтобы убедиться в отсутствии артефактов, вызванных нарушением генов с использованием конструкции КапМХ4. Результаты обсчета размера колоний с помощью программы ImageJ представлены на рис. 36.
Штаммы с полностью нарушенными генами РТР2 и NPT1 росли несколько медленнее, чем контроль, как на среде, содержащей галактозу, так и в условиях отсутствия экспрессии полиглутаминового фрагмента, что свидетельствует о необходимости этих генов для нормальной жизнедеятельности клетки. Штаммы с полностью нарушенными генами VPS36, TUS1 и ICY1, в которых также экспрессировали мутантный фрагмент хантингтина, показывали высокую степень выживаемости по сравнению с контрольным штаммом W303-1A Aade2 103Q как по размеру колоний и количеству КОЕ на твердой среде, так и по соотношению оптической плотности в жидкой среде, содержащей галактозу. Однако было установлено, что устойчивость клеток в этих случаях достигается, по всей видимости, за счет активного выведения конструкции с полиглутамином за пределы ядра и клетки в целом. В то же время штамм с полностью инактивированным геном ASE1 оказался устойчивым к экспрессии мутантного хантингтина, не теряя при этом конструкцию. Этот штамм показывал большую, чем в контроле, скорость удвоения на жидкой среде, содержащей галактозу, а также лучшую выживаемость и колониеобразующую способность на твердой среде.
Штаммы, которые формировали более крупные колонии, были подвергнуты дополнительному тесту в более жестких условиях: их инкубировали в течение двух суток на твердой среде, содержащей только галактозу (рис. 37).
В ходе такой проверки для дальнейшего анализа был выбран штамм с нарушенным геном ASE1 , поскольку он стабильно показывал лучшую выживаемость и колон иеобразующую способность по сравнению с контрольными штаммами.
Исследование функции генов CDH1 и CLB2
Поскольку инактивация гена ASE1 улучшала выживаемость и колониеобразующую способность дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина, было высказано предположение, что если каким-то другим способом ускорить деградацию циклинов в клетках, экспрессирующих хантингтин, можно наблюдать похожий эффект.
Одним из генов, влияющих на этот процесс, является ген CDH1 (или НСТ1). Ген CDH1 входит в группу генов - регуляторов клеточного цикла и, подобно своему гомологу CDC20, является активатором АРС комплекса, регулирует убиквитинилирование циклинов, влияет на выход клеток из митоза и на взаимодействие АРС-комплекса с субстратами, такими как CDC20, ASE1, SIN8, FIN1. Мы предположили, что активация АРС-комплекса посредством гиперэкспрессии Cdh1 может устранить перегрузку протеасомы, вызванную наличием агрегатов мутантного хантингтина, и таким образом повысить выживаемость клеток и их способность к образованию колоний. Чтобы проверить это предположение, мы получили штаммы с гиперэкспрессией Cdh1, также экспрессирующие удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина, в одном из штаммов дополнительно был нарушен ген дрожжевой метакаспазы YCA1. Эти штаммы растили 1 сутки на твердой среде, содержащей раффинозу, затем пересаживали на среду с галактозой для индукции экспрессии, спустя 24 часа измеряли размер колоний, а также оценивали интенсивность флуоресценции 103Q-CFP. С помощью флуоресцентной микроскопии было подтверждено, что клетки не избавляются от конструкции 103Q-CFP и по-прежнему содержат агрегаты мутантного хантингтина (рис. 39). Гиперэкспрессия Cdh1 в диком типе никак не сказалась на размере колоний, в то же время гиперэкспрессия этого белка в штамме, экспрессирующем мутантный хантингтин, привела к существенному увеличению его способности образовывать колонии (рис. 40 и 41). Интересно также, что дополнительное нарушение гена дрожжевой метакаспазы в данном штамме усиливало этот эффект.
Еще один способ уменьшить протеасомный стресс - нарушить ген CLB2, кодирующий циклин В-типа. Согласно нашей гипотезе, нарушение этого гена также должно приводить к увеличению способности штамма, экспрессирующего мутантный хантингтин, образовывать колонии. Для проверки этого предположения был получен штамм 103Q Ас1Ь2, который имел характерную морфологию клеток (рис. 39), при этом сохранял конструкцию 103Q-CFP. Нарушение этого гена также положительно сказалось на способности штамма, экспрессирующего мутантный хантингтин, образовывать колонии (рис. 40 и 41).
Для того, чтобы точнее оценить, как повлияла экспрессия полиглутаминового фрагмента на мутантные штаммы, мы сравнили размер колоний, выросших на среде, содержащей галактозу, с размером колоний, выросших на среде без галактозы, т.е. в условиях отсутствия экспрессии полиглутаминового фрагмента. Достоверные различия с контролем были установлены для всех мутантных штаммов, однако нарушение гена CLB2 и сверхэкспрессия белка Cdh1 показали наибольшее влияние на способность дрожжей формировать колонии в условиях экспрессии полиглутаминового фрагмента (рис. 42).
Оценка уровня экспрессии полиглутаминового фрагмента с помощью флуоресцентной микроскопии удобна в техническом плане, но при этом сложна для количественной обработки результатов и требует подтверждения другими методами. Поэтому мы также оценивали количество белковых агрегатов, образованных полиглутаминовым фрагментом хантингтина, с помощью биохимических методов. Детекция полиглутаминов с помощью белкового фореза в ПААГ (рис. 43) оказалась недостаточно эффективной в связи с большим количеством мажорных белков в интересующей нас области (размер около 40 кДа), поэтому мы использовали также метод дот-блоттинга (рис. 44), с помощью которого показали, что уровень экспрессии полиглутаминовых фрагментов приблизительно одинаковый во всех мутантных штаммах.
