Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1. Дезоксиниваленол и другие трихотеценовые микотоксины 6
1.1.1. физико-химические свойства трихотеценовых микотоксинов 6
1.1.2. Распространенность ДОН и других фузариотоксинов в природе.. 8
1.1.3. Токсическое действие трихотеценовых микотоксинов 12
1.2. Основные пути биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков 15
1.2.1. Общие сведения 15
1.2.2. Основные пути биотрансформации и детоксикации трихотеценовых микотоксинов 20
1.2.2.1. Биотрансформация дезоксиниваленола 22
1.3. Влияние алиментарных факторов на метаболизм и токсичность ксенобиотиков 25
1.3.1. Селен 25
1.3.2. Пищевые волокна 30
1.3.3. Пробиотики 35
1.3.4. Биотрансформация и детоксикация чужеродных соединений при их комбинированном поступлении 37
2. Экспериментальная часть 40
2.1. Материалы и методы исследования 40
2.1.1. Животные и их содержание 40
2.1.1.1. Экспериментальные рационы 40
2.1.1.2 Условия эксперимента по изучению метаболизма ДОН 44
2.1.2. Реактивы и материалы, используемые в работе 45
2.1.3. Физико-химические методы исследования 46
2.1.3.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография 46
2.1.3.2. Масс- и хроматомасс-спектрометрия 47
2.1.4. Метод определения ДОН и его метаболитов в моче крыс 47
2.1.5. Статистическая обработка результатов 48
2.2. Результаты исследования 49
2.2.1. Модификация метода количественного определения ДОН и его метаболитов в моче и кале крыс 49
2.2.1.1. Подбор системы для элюирования ДОН и ДОМ-1 с адсорбционной колонки 49
2.2.1.2. Определение формы нанесения экстракта образца на колонку 50
2.2.1.3. Определение сульфатных конъюгатов ДОН и ДОМ-1 51
2.2.1.4. Модифицированный метод анализа ДОН и его метаболитов в экскретах крыс 54
2.2.2. Изучение распределения экскретируемых метаболитов ДОН в моче и кале крыс Вистар 58
2.2.3. Влияние индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков на метаболизм ДОН у крыс 60
2.2.4. Влияние уровня селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс 68
2.2.4.1. Влияние обогащения рациона селеном на метаболизм ДОН у крыс 68
2.2.4.2. Влияние дефицита селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс 74
2.2.5. Влияние обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН у крыс 80
2.2.6. Влияние пробиотиков на метаболизм ДОН у крыс 86
2.2.7. Изучение комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН у крыс 93
3. Заключение 100
4. Выводы 105
5. Список литературы 106
- Токсическое действие трихотеценовых микотоксинов
- Биотрансформация дезоксиниваленола
- Изучение распределения экскретируемых метаболитов ДОН в моче и кале крыс Вистар
- Влияние дефицита селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы
К природным контаминантам продовольственного сырья и пищевых продуктов, представляющих реальную опасность для здоровья человека, относятся микотоксины, что связано с их высокой токсичностью, наличием у большинства из них иммуноде-прессивных свойств и у многих — мутагенных, канцерогенных или коканцерогенных свойств [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993; Miller J.D., 1998]. Микотоксины являются продуктами жизнедеятельности повсеместно распространенных микроскопических (плесневых) грибов, способных поражать продовольствие на всех этапах его производства, переработки и хранения. Полагают, что не менее 25% всех продовольственных ресурсов подвержены загрязнению микотоксинами или повреждающему действию плесневых грибов [Pohland А.Е., 1998].
Исследования, проведенные как за рубежом, так и в нашей стране, показали, что наиболее часто обнаруживаемыми микотоксинами являются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium — трихотеценовые микотоксины (ТТМТ), зеарале-нон и фумонизины [Саркисов А.Х., 1954; Scott P.M., 1990; Miller J.D., 1995 a; BhatR., 1999]. В отличие от других микотоксинов, накопление которых в пищевых продуктах является, главным образом, результатом нарушений условий хранения или технологических условий производства продукта, фузариотоксины накапливаются в зерне в процессе его созревания, и интенсивность их синтеза в клетках мицелия зависит в значительной степени от климатических и погодных условий. Необходимо отметить, что проблема загрязнения продовольствия фузариотоксинами имеет выраженную тенденцию к нарастанию по степени риска для здоровья человека. Это определяется отсутствием устойчивости зерновых культур к поражению грибами рода Fusarium, отсутствием перспектив создания сортов, устойчивых к этим видам грибов и отсутствием в настоящее время достаточно эффективных в отношении грибов Fusarium фунгицидов [Львова Л.С. и др., 1992, 1994; Riley R.T., Norred W.R., 1999; Edwards S.G. et al., 2001].
Среди фузариотоксинов широкой распространенностью выделяются дезокси-ниваленол (вомитоксин) и зеараленон, а своими выраженными токсическими свойствами — Т-2 токсин [Тутельян В. А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993]. Дезоксинива-ленол (ДОН) в настоящее время, несомненно, является наиболее часто обнаруживаемым в мире микотоксином. ДОН выявляют в качестве контаминанта зерновых культур и, в первую очередь, пшеницы в большинстве регионов мира. Частота обнаруже-
ния ДОН в пшенице в разные годы в Канаде, США, в большинстве стран Европы и ряде стран Азии, Африки и Южной Америки достигает 50-100% [Ueno Y., Tanaka Т., 1987; Scott P.M., 1989, 1990, 1997; Tutelyan V.A. et al., 1990]. Результаты наших предыдущих исследований [Соболев B.C. и др., 1990; Захарова Л.П. и др., 1994, 1995; Кравченко Л.В. и др., 1998; Tutelyan V. А., 1998] показали, что в период 1986-1999 гг. в некоторых регионах России, относящихся к основным производителям зерна, ежегодная частота контаминации ДОН заготавливаемого зерна пшеницы варьирует от 60 до 100%. Имеются сообщения о высокой частоте (до 41-50 случаев) обнаружения Т-2 токсина в отдельные годы в зерне пшеницы, ячменя и овса в европейских странах — Польше, Германии, Финляндии [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; MiillerH.M., SchwadoreК., 1993; MiillerH.M. etal., 1998; Grabarkiewicz-Szczesna J. etal., 2001].
Результаты эпидемиологических наблюдений свидетельствуют, что алиментарные микотоксикозы и, в первую очередь, фузариотоксикозы как у людей, так и у сельскохозяйственных животных, являются обычно следствием поступления с пищей (кормом) нескольких микотоксинов, среди которых один или два являются доминирующими. Так, в описанных в последние годы случаях массовых отравлений в Индии [BhatR.V. et al., 1989] в пшеничной муке были обнаружены наряду с ДОН еще три трихотеценовых микотоксина — Т-2 токсин, ниваленол и ацетил-ДОН. В Китае, в 35 случаях массовых отравлений, связанных с контаминацией зерна пшеницы и кукурузы микотоксинами, в качестве загрязнителей были обнаружены ДОН и зеараленон [Luo X.Y., 1988]. Практически во всех странах Европы, в Северной и Южной Америке, в ряде стран Азии неоднократно выявляли ДОН вместе с зеараленоном в пшенице, ячмене, овсе [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Yoshizawa Т., JinY.Z., 1995; MiillerH.M. et al., 1998]. Результаты исследований, проведенных в НИИ питания РАМН, показали возможность накопления двух фузариотоксинов — ДОН и зеарале-нона — в зерне из ареала фузариоза (Краснодарский край) [Львова Л.С. и др., 1994; Кравченко Л.В. и др., 1998].
В связи с тем, что практически невозможно полностью предотвратить заражение сельскохозяйственной продукции микроскопическими грибами и загрязнение их микотоксинами, основной мерой защиты организма от неблагоприятного воздействия этих токсинов является гигиеническое регламентирование их содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Как показали результаты наших предыдущих исследований, даже при наличии в достаточной степени налаженной системы
контроля за безопасностью продовольственного зерна и пищевых продуктов, сохраняется вероятность постоянного поступления с пищей микотоксинов (главным образом ДОН) в количествах, которые в настоящее время нельзя считать абсолютно безопасными для здоровья человека [Захарова Л.П., 1994, 1995; Кравченко Л.В. и др., 1998]. В связи с этим, наряду с мероприятиями, направленными на предотвращение попадания микотоксинов в организм, важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности поступивших в организм токсинов. К числу наиболее перспективных направлений относится использование пищи и ее компонентов как мощного фактора регуляции процессов токсикокинетики чужеродных соединений, включая этапы всасывания, печеночно-кишечной циркуляции, биотрансформации и детоксикации [Ту-тельян В.А. и др., 1987; GalvanoF. et al., 2001]. Особое внимание привлекают биологически активные компоненты пищи, которые находят широкое применение не только для коррекции структуры питания населения, но и в профилактических целях, для повышения резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Большинство ферментов, занимающих ключевое место в процессах биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков и в том числе ТТМТ, являются компонентами мембран, и их активность определяется в значительной степени функциональным состоянием мембран. Кроме того, в единичных исследованиях in vitro показана возможность восстановления эпоксидного кольца трихотеценовых микотоксинов ферментами микрофлоры желудочно-кишечного тракта. В связи с этим особый интерес представляют компоненты пищи, способные оказывать стабилизирующее влияние на мембраны (антиоксиданты) и улучшающие микробиологический баланс кишечника (пробиотики, пищевые волокна).
Цель работы состояла в изучении влияния на основные пути биотрансформации и детоксикации ДОН у крыс алиментарных факторов — биологически активных компонентов пищи.
Были поставлены следующие задачи:
изучить распределение свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов ДОН;
изучить роль микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз в детоксикации ДОН;
изучить влияние различных уровней селена в рационе на метаболизм ДОН;
изучить влияние обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН;
изучить влияние пробиотиков на метаболизм ДОН;
- изучить метаболизм ДОН при одновременном поступлении с кормом двух фуза
риотоксинов — ДОН и зеараленона.
Научная новизна
Получены новые данные, подтверждающие, что основными путями детоксикации ДОН у крыс является образование его деэпоксида — ДОМ-1 и конъюгатов ДОН и ДОМ-1.
Впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъюгатов ДОН и ДОМ-1.
Впервые получены данные об участии в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1Аи2В.
Показано, что как дефицит селена в рационе, так и обогащение рациона селеном приводит к усилению образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН, которое сопровождается возрастанием активности микросомальной UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени крыс.
Показано, что обогащение рациона крыс пектином усиливает не только экскрецию ДОН, но и образование и выведение его глюкуроновых конъюгатов, что коррелирует с возрастанием в печени крыс активности UDP-глюкуронозилтрансферазы.
Впервые показано, что in vivo пробиотики могут влиять на токсикокинетику ксенобиотиков.
Установлено, что длительное поступление с кормом двух фузариотоксинов — ДОН и зеараленона — в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает какого-либо влияния на метаболизм ДОН.
Практическая значимость
Данные об отсутствии изменения метаболизма ДОН у крыс при длительном поступлении с кормом двух фузариотоксинов — зеараленона и ДОН — в дозах, близких к недействующим для крыс, свидетельствуют, что одновременное присутствие в пище двух фузариотоксинов в пределах установленных регламентов не представляет дополнительную опасность для здоровья человека и не требует изменения гигиенических регламентов.
Получены новые данные по научному обоснованию использования биологически активных добавок к пище (БАД), содержащих микронутриенты, пробиотики и
пищевые волокна, для повышения неспецифической резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности таких приоритетных загрязнителей пищевых продуктов как микотоксины.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на Первом международном научном конгрессе «Традиционная медицина и питание: Теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994), 1 -м съезде токсикологов России (Москва, 1998), Международной конференции «Региональные проблемы профилактической медицины» (Великий Новгород, 1999).
Публикации
По результатам выполненных исследований опубликовано 6 печатных работ в научных журналах и сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, двух глав экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 14 рисунков. Список литературы включает 294 источника, из которых 239 — иностранных авторов.
Токсическое действие трихотеценовых микотоксинов
Токсическое действие дезоксиниваленола, Т-2 токсина, ниваленола, как и большинства других ТТМТ, характеризуется поражением желудочно-кишечного тракта, кроветворных и иммунокомпетентных органов. Общим симптомом острого отравления являются рвота и понос, отказ от корма; при длительном воздействии ТТМТ развивается лейкопения. Т-2 токсин обладает дерматотоксическими свойствами. ТТМТ являются сильными иммунодепрессантами.
Алиментарные микотоксикозы, вызванные пищевыми продуктами и кормами, пораженными микроскопическими грибами продуцентами ТТМТ, относятся к наиболее рано описанным микотоксикозам человека и сельскохозяйственных животных. Алиментарная токсическая алейкия (АТА) — заболевание, наблюдавшееся в отдельные годы, вплоть до 1955 г., на территории СССР и связанное с употреблением в пищу продуктов переработки перезимовавшего под снегом зерна проса, пшеницы, ячменя [Рубинштейн Ю.И., Лясс Л.С, 1948; Joffe A.Z., 1983]. Заболевание характеризовалось локализацией в сельской местности, выраженной очаговостью, сезонностью, неравномерностью вспышек в разные годы и бесспорным доказательством связи с употреблением в пищу зерна, пораженного микроскопическими грибами F. sporotrichiella [Саркисов А.Х., Квашнина Е.С., 1948; БилайВ.И., 1977], в последствии идентифицированных как продуценты ТТМТ, главным образом Т-2 токсина [БилайВ.И. и др., 1983; ТутельянВ.А., Кравченко Л.В., 1985]. В легких случаях заболевание протекало по типу гингивита, стоматита, глоссита, реже — по типу гастроэнтерита, с тошнотой, рвотой, головной болью, головокружением и длилось 3-5 дней. При длительном потреблении загрязненных продуктов доминирующим симптомам становилась прогрессирующая лейкопения, переходящая в особо тяжелых случаях в алей-кию и сопровождающаяся геморрагическими диатезами, носовыми кровотечениями, кровотечениями из десен, некрозами зева и глотки (ангинозный синдром) [Саркисов А.Х., Квашнина Е.С., 1948; Билай В.И., Пидопличко Н.М., 1970].
Синдром «пьяного хлеба» — заболевание человека и животных, связанное с употреблением зерновых продуктов, пораженных грибами F. graminearum, известных в настоящее время как продуценты ДОН, ниваленола, зеараленона. Впервые это заболевание наблюдали на Дальнем Востоке в 1882 г. [Саркисов А.Х., 1954; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Случаи отравления отмечались также в Италии, Германии, Швеции, Финляндии и Франции [Matossian М.К., 1989]. У людей симптомы отравления появлялись вскоре после приема в пищу продуктов (главным образом хлеба) из пораженного («пьяного») зерна: через 30-60мин появлялась рвота, боли в области живота, понос, возникало чувство слабости, тяжести в конечностях, скованность походки. Через день наступало состояние, похожее на состояние после тяжелого опьянения: сильные головные боли, головокружение. При длительном потреблении «пьяного хлеба» у людей наблюдалось истощение, потеря зрения, явления нарушения психики. У заболевших домашних животных характерными симптомами явились отказ от корма и рвота [Саркисов А.Х., 1985].
Известны случаи массовых отравлений в Китае [Luo X.Y., 1988] и Индии [BhatR.V. et al., 1989] заплесневелой пшеницей и кукурузой с высоким содержанием ДОН. Симптомы отравления — тошнота, рвота, боли в животе, понос, головокружение и головная боль, появлялись через 5-30 мин после приема пищи. В случаях присутствия наряду с ДОН Т-2 токсина у большинства заболевших были жалобы на першение в горле.
Акакаби-токсикоз, или болезнь, вызванная пораженным красной плесенью зерном, начиная с 1890 г. периодически отмечается у людей и сельскохозяйственных животных в Японии и Корее. Вспышки заболевания наблюдаются в годы с обильными дождями в период цветения, созревания и сбора урожая зерновых и связаны с поражением зерна некоторыми штаммами F. gramineamm — продуцентами ДОН, ниваленола и фузаренона-Х. У людей заболевание протекает по типу пищевого отравления — вскоре после приема пищи появляются тошнота, рвота, боли в животе, реже — понос, головная боль, озноб [Kuiper-Goodman Т., 1994]. Нередко одновременно болеют домашние животные, у которых основными симптомами являются отказ от корма, рвота, понос [Ueno Y., 1986; KubenaL.F. et al., 1997; Hughes D.M. et al., 1999].
Основными органами-мишенями действия TTMT являются кроветворные и иммунокомпетентные органы. Внутрибрюшинное или per os введение ДОН или Т-2 токсина мышам вызывало дозозависимую атрофию тимуса и селезенки, связанную с гибелью клеток вследствие апоптоза [Ihara Т., et al., 1997; Islam Z. et al., 1998; Zhou H.-R. et al., 2000]. В экспериментах, проведенных в НИИ питания РАМН, также отмечалось дозозависимое снижение относительной массы тимуса при введении крысам Т-2 токсина или ДОН per os [Кравченко Л.В. и др., 2000]. Дегенеративные и некротические изменения иммунокомпетентных и кроветворных органов сопровождаются проявлением иммуносупрессорной активности ТТМТ [Борисов В.А., 1988 б; ParizaM.W.,1996; Bondy G.S., Pestka J.J., 2000] и гематологическими изменениями (лейкоцитопения, анемия, тромбоцитопения и др.) [Lutsky I., MorN, 1981; Rotter В. A. et al., 1994, 1996].
По своему механизму ТТМТ относятся к ингибиторам синтеза белка. Некоторые трихотецены (Т-2 токсин, НТ-2 токсин, неосоланиол, ниваленол, диацетоксискир-пенол, фузаренон-Х и др.) ингибируют процесс инициации трансляции, включаясь на этапе перед образованием комплекса между рибосомой, информационной РНК, ме-тионил-тРНК. Другие ТТМТ, такие как трихотецин, трихотеколон, веррукарол, дезок-синиваленол подавляют процесс элонгации и терминации, т.е. ингибируют процесс связывания тРНК с рибосомами, а также процессы транслокации, или препятствуют освобождению пептидов от рибосом. ТТМТ, подавляющие инициацию трансляции, обладают более выраженными токсическими свойствами, чем токсины, влияющие на более поздние стадии синтеза белка на рибосомах [Ueno Y., 1983; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Также получены данные, показывающие, что наряду с блокированием синтеза белка некоторые ТТМТ (Т-2 токсин, ниваленол, дезоксиниваленол, диацетоксискирпенол) обладают способностью ингибировать синтез ДНК [CundlifeE. etal., 1974; Тутельян B.A., 1985; Thompson W.L., Wannemacher R.W., 1990; Atroshi F. et al., 1995].
Важным компонентом биологической активности ТТМТ является их повреждающее воздействие на мембраны субклеточных структур [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Одним из механизмов токсичности ТТМТ может являться индукция процесса образования свободных радикалов и инициация реакции перекисного окисления липидов. Показано, что Т-2 токсин индуцирует перекисное окисление липидов в печени и в тканях других органов [Khachatourians G.G., 1990; Mezes М. et al., 1999]. Однократное введение крысам per os ДОН и Т-2 токсина приводило к усилению процессов перекисного окисления липидов на 21 и 268% соответственно [Rizzo A.F. et al., 1994]. Во многих случаях продукция свободных радикалов может служить дополнительным механизмом токсичности, более существенным, чем прямое повреждение клеток [Atroshi F. et al., 2000].
Биотрансформация дезоксиниваленола
Для ДОН выделен только один структурный метаболит, впервые описанный в 1983 г. [Yoshizawa Т., et al., 1983] (рис. 3). При введении ДОН внутрижелудочно крысам в моче, кале и в небольшом количестве в плазме крови и тканях печени было обнаружено его производное, в котором эпоксидное кольцо превращалось в винильную связь. Новый метаболит, За,7а,15-тригидрокситрихотец-9,12-диен-8-он, был назван ДОМ-1. Деэпоксидирование осуществляется, по-видимому, за счет ферментных систем микрофлоры желудочно-кишечного тракта. При инкубировании ДОН с содержимым рубца in vitro в реакционной смеси обнаруживался ДОМ-1 [King R.R., et al., 1984; Hedman R., Pettersson H., 1997]. Поскольку эпоксигруппа в эпокситрихотеценовых микотоксинах является одним из главных факторов их токсичности, очень вероятно, что такая реакция прямо связана с детоксикацией этих ксенобиотиков [King R.R., et al, 1984; Ueno Y., 1986].
Кроме того, в экскретах и тканях лабораторных животных, получивших ДОН, обнаруживали глюкуроновые конъюгаты как ДОН (рис. 4), так и ДОМ-1. Предполагается, что основным местом образования глюкуронидов является печень; ферментом, катализирующим процесс конъюгации с остатком глюкуроновой кислоты, является UDP-глюкуронозилтрансфераза, представляющая собой группу изоформ [Kasper Ch., Henton D., 1980; Голиков CH. и др., 1986; Radominska-Pandya A. et al., 1999; Strass-burg C.P. et al., 1999].
Изучение метаболизма ДОН у крыс показало, что через 96 ч. после введения однократной оральной дозы ДОН с радиоактивной меткой ( С) 25% радиоактивности было экскретировано с мочой и 64% с калом. За 24 ч. с мочой выводилось 6,2% введенного токсина в виде свободного ДОН и 2,5-3,2% в виде свободного ДОМ-1; количество токсина, выводимого с калом за 24-48 ч. в виде свободных ДОН и ДОМ-1 было около 3%) и 6,4-8,3%) соответственно [Lake B.C., et al., 1987]. По другим данным у крыс за 72 ч. с мочой выводилось в виде свободного ДОН 4,5% орально введенной дозы и в виде свободного ДОМ-1 — 4,4%; с калом экскретировалось 0,3% в виде свободного ДОН и 5,6%) в виде свободного ДОМ-1 [Yoshizawa Т., et al., 1983]. Важно отметить, что при введении ДОН per os крысам, предварительно получавшим антибиотики, по- давляющие их кишечную микрофлору, наблюдалось значительное снижение образования и экскреции ДОМ-1 как с калом, так и с мочой. В то же время инкубирование ДОН с анаэробным препаратом кишечного содержимого крыс приводило к образованию ДОМ-1, а при инкубировании ДОН с гомогенатом печени образования ДОМ-1 не наблюдали. Из этого можно заключить, что деэпоксидирование ДОН происходит под влиянием ферментных систем микроорганизмов желудочно-кишечного тракта [Worrell N.R. et al., 1989].
При введении ДОН свиньям per os в моче и кале наряду с неизмененным токсином обнаруживали его глюкуронид и деэпоксид [Bauer J., 1995]. Присутствие ДОН выявляли в плазме крови и спинномозговой жидкости [Prelusky D.B., et al., 1990]. Внутривенно введенный токсин исчезал из крови через 11-17 ч., а в моче переставал обнаруживаться через 20-30 ч. после введения. За 24 ч. с мочой выделялось от 28,1 до 57,2% дезоксиниваленола. [Coppock R.W., et al., 1985].
При введении ДОН овцам per os экскреция с мочой достигала максимума через 6-9 ч. и завершалась через 28-30 ч. после введения. Кроме исходного токсина (2,1% от введенной дозы) с мочой экскретировался конъюгированный ДОН (3,6%), ДОМ-1 (0,06%) и конъюгированный ДОМ-1 (1,2%). Еще 0,11% введенного ДОН выводилось с желчью, преимущественно в виде конъюгированного ДОМ-1, а также 54-75% экскре-тировалось с калом [Prelusky D.B., et al., 1986]. Токсин обнаруживался также в плазме крови. Причем лишь 14-37% от общего ДОН, выявленного в плазме, соответствовали свободному ДОН, 60-84% приходилось на глюкуроновый конъюгат ДОН и еще 1,8-2,8% — на ДОМ-1 [Prelusky D.B., et al., 1985].
При внутривенном введении ДОН овцам в крови обнаруживался глюкуроновый конъюгат ДОН в количестве 15-23% общего количества ДОН, выявленного в плазме. Доля ДОМ-1 составила 1,4-1,7%) от общего ДОН в плазме [Prelusky D.B., et al., 1985]. С мочой выводилось 63% всего введенного ДОН в виде свободного ДОН (24,1%), глюкуронового конъюгата ДОН (21,2%), ДОМ-1 (0,5%) и глюкуронового конъюгата ДОМ-1 (17,2%). Кроме того, 3,5% введенного ДОН выделялось с желчью, почти полностью в виде глюкуронида ДОМ-1. Однако значительная часть введенного ДОН (33,5%) остается неучтенной, возможно, превращаясь в неидентифицированные метаболиты. [Prelusky D.B., et al., 1986]. Изучение метаболизма внутривенно введенного овцам ДОН с радиоактивной меткой ( С) показало, что 91% введенного токсина выводился с мочой, а 6% обнаруживалось в желчи; 67% всего экскретированного токсина выходило в виде глюкуронидов ДОН (54%) и ДОМ-1 (13%), доля неизмененного токсина составила 11% от введенной дозы; оставшаяся часть (18%) состояла из ДОМ-1 (6%), сульфатных конъюгатов ДОН (2%) и трех неидентифицированных метаболитов, содержащих радиоактивную метку (10%) [Prelusky D.B. et al., 1987].
У коров, получавших ДОН с кормом в течение 5 дней, приблизительно 20% потребленного токсина было выведено с мочой и калом в несвязанных формах, таких как ДОН (4%) и ДОМ-1 (96%). При инкубировании образца мочи с [3-глюкуронидазой концентрация ДОН увеличивалась в 1,6-3,0 раза, а ДОМ-1 — в 7-16 раз, т.е. основная часть токсинов выводится в виде глюкуроновых конъюгатов [Cote L.-M., et al., 1986а].
Таким образом, основными путями биотрансформации ДОН в организме являются его конъюгация с глюкуроновой кислотой и образование его деэпоксипроизводно-го, значительная часть которого также выводится в виде глюкуронида. Глюкуроновая конъюгация происходит при участии UDP-глюкуронозилтрансферазы, локализованной главным образом в печени, в то время как образование деэпоксипроизводного связано, по-видимому, с ферментными системами микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
Изучение распределения экскретируемых метаболитов ДОН в моче и кале крыс Вистар
Пищевые волокна представляют собой комплекс биополимеров, включающий полисахариды (целлюлозу, гемицеллюлозы, пектиновые вещества), а также лигнин (высокомолекулярное соединение ароматической природы) и связанные с ними белковые вещества. Пищевые волокна формируют стенки растительных клеток и отличаются резистентностью к действию пищеварительных ферментов [Тутельян В.А. и др., 1987; ДудкинМ.С, Щелкунов Л.Ф., 1998 в]. Пищевые волокна можно разделить на однородные, т.е. сформированные из биополимеров одного вида (целлюлоза, лигнин, пектин и др.) и неоднородные, включающие биополимеры нескольких видов (холо-целлюлоза, целлолигнин, белково-полисахаридные комплексы и др). Одним из основных свойств пищевых волокон, определяющих их поведение в желудочно-кишечном тракте, является их растворимость в воде. К водорастворимым пищевым волокнам относятся пектин, альгиновые кислоты, камеди, слизи и др. Малорастворимые или нерастворимые — это целлюлоза, лигнин, некоторые виды гемицеллюлоз [Дуд-кин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 б].
Роль пищевых волокон в питании многообразна. Главными их функциями являются регуляция функциональной активности кишечника, адсорбция токсичных веществ, а также влияние на активность ферментов кишечной микрофлоры [Златки-на А.Р., 1994; Prosky L., 2001].
Недостаток пищевых волокон в питании может способствовать развитию ряда заболеваний, таких как атеросклероз, гипертоническая болезнь, диабет и др. [Kritchevsky D., 1986]. Многие исследователи в качестве одного из факторов, способствующих развитию рака толстой кишки и некоторых других онкологических заболеваний, называют недостаточное потребление пищевых волокон [Higginson J., 1984; OhtaM., 1987].
Экспериментально было показано, что обогащение рациона пищевыми волокнами снижало токсическое действие полихлорированных бифенилов, нитрозами-нов, полиэтиленгликоля, тяжелых металлов, некоторых микотоксинов и ряда других токсических и канцерогенных соединений экзогенного и эндогенного происхождения [Debethizy J.D., et al.,1985; Kritchevsky D., 1985; Тутельян B.A. и др., 1987; Southgate D. A.T., et al.,1990; ДудкинМ.С, Щелкунов Л.Ф., 1998 a]. Важно отметить защитное действие пищевых волокон при неблагоприятном влиянии на организм три-хотеценовых микотоксинов. Эксперименты показали, что введение в рацион крыс лигносорба (препарат пищевых волокон типа лигнина, выделенный из подсолнечника) снижало токсическое действие Т-2 токсина [Тутельян В.А. и др., 1994].
Неоднократно показано, что введение пищевых волокон в пищу или корм лабораторных животных оказывало профилактический и лечебный эффект при различных патологических состояниях человека и животных.
Пищевые волокна оказывали благоприятное влияние на клинические проявления желчнокаменной болезни [ДудкинМ.С, Щелкунов Л.Ф., 1998 а], снижали уровень холестерина в крови, липопротеинов высокой плотности и триглицеридов [Hazan A., MadarZ., 1993; Groudeva J. et al., 1997; BobekP. et al., 2000], способствовали профилактике и лечению атеросклероза [Оганов Р., Киселева Н., 1998] и сахарного диабета [Голубев В.Н., Шелухина Н.П., 1995; ДудкинМ.С, Щелкунов Л.Ф., 1998 а]. Отмечаются антиканцерогенные [Ohkami Н. et al., 1995; ReddyB.S., 1999; BobekP. et al., 2000; Jenab M., Thompson L.U., 2000], радиопротекторные [ДудкинМ.С, Щелкунов Л.Ф., 1998 а] свойства пищевых волокон, а также их способность восстанавливать нормальное состояние кишечника после химически индуцированного энтероколита [Мао Y. et al., 1996; Deng G.-Y. et al., 1999, 2000].
Действие пищевых волокон на процессы токсикокинетики ксенобиотиков реализуется посредством нескольких механизмов. Первый и самый очевидный из них заключается в усилении перистальтики кишечника, что вызывает ускорение прохождения содержимого кишечника и тем самым сокращает время контакта ксенобиотика со слизистой оболочкой кишечника [Конышев В.А. и др., 1984].
Другой механизм влияния пищевых волокон на токсикокинетику ксенобиотиков связан с их адсорбционными и катионообменными свойствами. Связывание токсинов переводит их в неабсорбируемую форму, снижает действующую концентрацию и ускоряет выведение с калом. В частности, предполагается, что противораковая активность пищевых волокон основана на их свойствах адсорбировать канцерогены [Ferguson L.R., Harris P.J., 1996], а также эстрогены, повышенный уровень которых является основной причиной рака некоторых органов эндокринной системы [Rao J.N., 1996]. Адсорбционная способность пищевых волокон зависит от их источника. Так на примере 1,2-диметилгидразина экспериментально показано, что наиболее эффективным адсорбентом являются пшеничные отруби, а пектин цитрусовых обладает минимальной связывающей способностью [Smith-Barbaro P., et al., 1981]. При связывании фенола лигнин и целлолигнин из жмыха виноградных семян значительно превосходят целлюлозу. По способности связывать ионы свинца целлюлоза значительно уступает другим биополимерам жмыха виноградных семян [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а].
Третий важный механизм состоит во влиянии пищевых волокон на ферментные системы как собственно организма, так и кишечной микрофлоры, которые принимают участие в биотрансформации ксенобиотиков.
Была показана способность пищевых волокон изменять активность отдельных изоформ цитохрома Р-450 в печени, причем как снижать, так и повышать их активность. Добавление 20% пшеничных отрубей в корм крыс значительно повышало активность изоформы CYP3A2 цитохрома Р-450, но несколько снижало активность изоформ CYP1A1 и CYP1A2 [HelsbyN.A. et al., 2000]. Пищевые волокна из какао-бобов существенно увеличивали количество изоформ CYP1A2, CYP2B1 и CYP2B2 цитохрома Р-450 и снижало образование изоформы CYP2C11 в печени крыс [Nugon-Baudon L. et al., 1996]. Было отмечено снижение активности глутатионтрансферазы и UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени крыс при введении в их корм большого количества пшеничных отрубей [HelsbyN.A. et al., 2000]. По другим данным, введение пищевых волокон из какао-бобов в рацион крыс не влияло на активность печеночной глутатионтрансферазы и способствовало возрастанию активности UDP-глюкуронозил-трансферазы в печени [Nugon-Baudon L. et al., 1996]. Введение в рацион целлюлозы или волокон столовой свеклы индуцировало активность печеночных глутатионпероксида-зы и глутатионтрансферазы [BobekP. et al., 2000]. Показано, что введение пищевых волокон в рацион крыс снижало степень индукции цитохрома Р-450 и UDP-глюкуроно-зилтрансферазы в печени, вызванной глюкозинолатами [Roland N. et al., 1996]. Обнаружено, что обогащение рациона крыс лигносорбом приводило к возрастанию активности в слизистой тонкой кишки микросомальной карбоксилэстеразы — одного из ключевых ферментов биотрансформации микотоксина Т-2 токсина [ТутельянВА. и др., 1994].
В ряде сообщений отмечают, что влияние пищевых волокон на ферменты метаболизма ксенобиотиков в кишечнике отличалось от такового в печени лабораторных животных. Пшеничные отруби значительно увеличивали активность глутатионтрансферазы в толстом кишечнике крыс, одновременно снижая активность этого фермента в печени [Helsby N.A. et al., 2000]. Введение пищевых волокон в рацион крыс не влияло на активность UDP-глюкуронозилтрансферазы и глутатионтрансферазы в кишечнике, при том, что в печени активность UDP-глюкуронозилтрансферазы возрастала [Nugon-Baudon L. et al., 1996]. Отмечалось, что пшеничные отруби снижали уровень индукции цитохрома Р-450 CYP1A1 в слизистой толстой кишки, вызванной 3-метилхолантреном [Kawata S. et al., 1992]. Пищевые волокна повышали индуцирующее влияние глюкозинолатов на активность глутатионтрансферазы в печени и толстом кишечнике, но не влияли на уровень индукции этого фермента в тонком кишечнике, а также не влияли на вызванное глюкозинолатами снижение активности цитохрома Р-450 и UDP-глюкуронозилтрансферазы в тонком кишечнике [Roland N. et al., 1996].
Влияние дефицита селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс
Некоторые типы пищевых волокон, такие как пектин и гемицеллюлоза, являются субстратами для кишечной микрофлоры, в результате чего включение их в рацион может сопровождаться значительными изменениями характера кишечной микрофлоры и ее функциональной активности. Следствием этого может явиться изменение токсичности соединений, в метаболизме которых участвуют ферментные системы микрофлоры кишечника.
Принимая во внимание предположение о том, что одним из основных путей биотрансформации и детоксикации ДОН — его деэпоксидирование — происходит при влиянии ферментных систем микрофлоры желудочно-кишечного тракта, целью настоящего раздела явилось изучение влияния пектина на метаболизм ДОН у крыс.
Эксперименты проводили на 2 группах растущих крыс-самцов Вистар по 12 животных в каждой. Масса тела крыс варьировала от 190 до 205 г. Контрольная группа крыс получала полусинтетический рацион без дополнительного включения пектина; опытная группа получала такой же рацион, содержащий цитрусовый пектин ("Kopenhagen pektin fabrik", Дания) в концентрации 5%. Продолжительность эксперимента составила 2 недели. По истечении этого времени по 5 крыс из каждой группы были помещены в индивидуальные металлические обменные клетки с сетчатым дном. Всем животным был введен однократно внутрижелудочно ДОН в виде водного раствора в дозе 10 мг/кг массы тела. Моча и кал животных собирались раздельно в течение 48 часов с момента введения ДОН. До проведения анализа образцы мочи и кала хранились при температуре -18С.
Результаты проведенных исследований показали, что у крыс, получавших рацион с пектином, существенно (в 1,5 раза) возрастало общее количество экскретируе-мых метаболитов ДОН, главным образом их конъюгатов — более чем в 1,5 раза. При этом отмечается преимущественное усиление выведения неизмененного ДОН (в 1,8 раз) в первую очередь за счет возрастания образования и выведения его конъюгатов (почти вдвое), а также усиление выведения свободного ДОН в 1,5 раза. Не обнаружено какого-либо влияния пектина на суммарное образование и выведение ДОМ-1 как в свободной, так и конъюгированной форме (табл. 23).
Как видно из таблицы 24 и рисунка 10А, обогащение рациона крыс пектином приводило к усилению экскреции метаболитов ДОН с мочой как за счет возрастания выведения свободных, так и конъюгированных форм. Выведение неизмененного ДОН с мочой усиливалось в 1,8 раз, прежде всего за счет статистически достоверного возрастания в 2 раза образования и выведения конъюгатов ДОН. В меньшей степени пектин влиял на образование и экскрецию ДОМ-1: выведение с мочой свободной формы ДОМ-1 возрастало в 1,4 раза.
В кале, как и в моче, обнаружено достоверное возрастание суммарного количества экскретируемых метаболитов (в 1,5 раза). При этом количество конъюгатов увеличивалось более чем в 1,8 раза. Обнаруженные изменения определялись, прежде всего, усилением выведения неизмененного ДОН — в 1,7 раза, как в свободной форме, так и в виде конъюгатов (табл. 25, рис. 10Б). Обращает на себя внимание двукратное увеличение образования и экскреции с калом конъюгатов ДОМ-1 при одновременном уменьшении доли экскретируемого в свободной форме ДОМ-1.
Таким образом, обогащение рациона пектином приводит к существенному усилению метаболизма ДОН, что проявлялось как в увеличении количества выводимого неизмененного токсина, так и в усилении образования и выведения его конъюгатов. Эти результаты коррелируют с полученными в этом же эксперименте данными о значительном возрастании (почти в 2 раза) в печени крыс, получавших рацион с пектином, активности микросомальной UDP-глюкуронозилтрансферазы [Кравченко Л.В. и др., 1994]. Интересно отметить сообщение Ohkami Н. et al. (1995) о способности пектинов подавлять активность Р-глюкуронидазы — фермента, осуществляющего гидролитическое расщепление глюкуронидов различных токсикантов в кишечнике и способствующего их печеночно-кишечной рециркуляции. Нельзя исключать, что подавление пектином кишечной и бактериальной Р-глюкуронидазы может вносить свой вклад в обнаруженное возрастание количества конъюгированных метаболитов ДОН.
К возможным механизмам влияния рациона, содержащего пектин, на активность микросомальных ферментов можно отнести, во-первых, наличие в препарате пектина соединений, индуцирующих ферменты (например, биологически активные компоненты) [ДудкинМ.С, Щелкунов Л.Ф., 1998 а; ReddyB.S., 1999], во-вторых, возможные изменения обмена холестерина [Groudeva J. et al., 1997; Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а], который в значительной мере определяет степень жидкост-ности мембран и может модулировать функциональное состояние мембраносвязанных ферментов.
Установлено, что наряду с реакциями конъюгации, деэпоксидирование трихо-теценовых микотоксинов является одним из важных путей их детоксикации в организме. Существует гипотеза, практически не подтвержденная экспериментальными доказательствами, согласно которой деэпоксидирование трихотеценовых микотоксинов происходит при участии редуктаз анаэробных микроорганизмов желудочно-кишечного тракта.
В связи с этим проведено сравнительное изучение возможного влияния на метаболизм ДОН терапевтических доз пробиотиков.
Эксперименты проводили на 2 группах крыс-самцов Вистар по 10 животных в каждой группе. Животные содержались на общевиварном рационе. Крысам опытной группы в течение 8 дней вводили внутрь суспензию живых культур Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus и Streptococcus thermophilus в количестве 5 х 108 клеток. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду. Спустя 24 часа после последнего введения, 6-ти животным из каждой группы вводили однократно внут-рижелудочно водный раствор ДОН в дозе 8 мг/кг массы тела и помещали в индивидуальные металлические обменные клетки с сетчатым дном. В течение 48 часов у крыс собирали раздельно мочу и кал и хранили образцы при -18С до проведения анализа.
