Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Молекулярные основы стабильности и инактивации олигомерных ферментов 10
1. Особенности проявления функциональной активности олигомерных ферментов 10
2. Механизм инактивации олигомерных ферментов... 13
3. Молекулярные основы стабильности олигомерных ферментов из термофильных микроорганизмов 19
Глава II. Стабилизация олигомерных ферментов без применения носителей 22
1. Стабилизация ферментов путем одноточечной модификации поверхностных функциональных групп ... 22
2. Стабилизация олигомерных ферментов эффекторами 27
3. Стабилизация олигомерных ферментов с помощью солевых мостиков 29
4. Стабилизация олигомерных ферментов с помощью внутримолекулярного сшивания бифункциональными реагентами 30
Глава III. Применение олигомерных ферментов в медицине 37
Материалы и методы 43
Материалы 43
Методы 4Ь
- Особенности проявления функциональной активности олигомерных ферментов
- Молекулярные основы стабильности олигомерных ферментов из термофильных микроорганизмов
- Стабилизация ферментов путем одноточечной модификации поверхностных функциональных групп
- Стабилизация олигомерных ферментов с помощью внутримолекулярного сшивания бифункциональными реагентами
Введение к работе
Биологическая наука на современном этапе своего развития немыслима без биотехнологии - широкомасштабного внедрения элементов живой природы в промышленное производство, медицину и другие области. Неотъемлемой частью биотехнологии является инженерная энзимология - наука, занимающаяся разработкой путей практического применения ферментных препаратов.
Ферменты, будучи уникальными биологическими катализаторами различных биохимических процессов, обладают набором свойств, делающими их чрезвычайно привлекательными для внедрения в практику. Речь идет о исключительно высокой каталитической эффективности /скорость некоторых реакций увеличивается на 10-12 порядков [i ]/ и о чрезвычайно высокой избирательности действия ферментов. К сожалению, на пути широкого внедрения биокатализа в практику стоят серьезные препятствия, связанные с малой стабильностью на-тивных ферментов, чувствительностью к изменениям рН и температуры, а также быстрым выведением из организма, если речь идет о применении фермента в клинике в качестве терапевтического агента
2,з] . Именно поэтому получение искуственно стабилизированных производных ферментов является одной из важнейших задач инженерной энзимологии.
В основе процессов инактивации ферментов могут лежать явления различной природы; для ряда причин /например, ингибирования ионами тяжелых металлов, окисления существенных функциональных групп белка и т.д./ разработаны эффективные методы их подавления
4,5J . Наибольшие осложнения вызывает инактивация фермента, обусловленная денатурирующим воздействием внешней среды, в про- цессе которого глобула фермента претерпевает ряд изменений, включая существеннейшее - разворачивание полипептидной цепи [ б J . Этот же фактор инактивации играет важную роль при использовании ферментов в качестве лекарственных средств.
Наиболее популярным и исторически первым методом преодоления названных препятствий является иммобилизация ферментов на нерастворимых и растворимых носителях различной природы. Ряд исследований последнего времени показал, что ферменты, иммобилизованные на различных полимерах, частично освобождены от нежелательных свойств, присущих нативным ферментам [7 J . Однако, в ряде случаев это не является полньм решением проблемы. Дело в том, что при практическом применении иммобилизованных ферментов, особенно в медицине, наличие объемной полимерной матрицы может серьезно сказаться на взаимодействии ферментов с высокомолекулярными субстратами и компонентами клеточных мембран, что ставит задачу стабилизации ферментов без применения носителей.
Ранее в нашей лаборатории были разработаны подходы к стабилизации ферментов без использования полимерных носителей на примере простейшего модельного фермента - химотрипсина |8,9| . Они заключались в одноточечной модификации определенных функциональных групп на поверхности белковой глобулы, а также в применении бифункциональных реагентов в качестве "скобок", скрепляющих отдельные части полипептидной цепи и фиксирующих таким образом активную конформацию глобулы. Но наряду с подобными химо-трипсину одноцепочечньми ферментами в природе существует множество более сложных по структурной организации белков, а именно субъединичных ферментов, состоящих из нескольких полипептидных цепей, соединенных в каталитически активный агрегат нековалент-ными связями [iOj . Как показали исследования последних лет, помимо обычных механизмов инактивации, этим ферментам присущ специфический способ потери активности - диссоциация на каталитически неактивные субъединицы. Очевидно, можно ожидать существенного повышения стабильности подобных систем, если попытаться каким-либо искусственным способом скрепить субъединицы олигомерного фермента между собой и таким образом предотвратить диссоциацию. Осуществить подобную идею можно было бы химической модификацией олигомерного фермента с помощью бифункциональных реагентов, отлично зарекомендовавших себя в случае стабилизации одно-цепочечных ферментов [8,9] при условии связывания между собой двух соседних субъединиц одной молекулой подобного реагента.
Хотелось бы отметить, что, помимо практического значения, проблема стабилизации сложных олигомерных ферментов важна еще и в теоретическом плане как особый подход к изучению структуры и функции биокатализаторов и, что особенно важно, механизмов их денатурации.
Для детального изучения процесса стабилизации олигомерных ферментов с помощью обработки бифункциональными реагентами была выбрана следующая общая схема работы. На первом этапе работы общие подходы и методики отрабатываются на модельном объекте /обычно выбирается хорошо изученный фермент/, для которого получаемые результаты можно было бы легко интерпретировать. Второй этап работы заключается в перенесении отработанных на модельном объекте подходах на другие объекты, имеющие непосредственное практическое применение.
В предлагаемой работе мы попытались выяснить, в какой степени результаты, полученные в процессе изучения стабилизации простых одноцепочечных ферментов можно перенести на более сложно организованные олигомерные белки. Более конкретно, задачами дан- ного исследования являются: а/ всестороннее изучение явления стабилизации олигомерных ферментов межсубъединичным сшиванием, включая выявление корректных способов измерения стабильности фермента и изучение влияния длины сшивающего реагента на эффект стабилизации, б/ исследование механизма стабилизации с применением различных методов /как прямых, так и косвенных/, и,наконец,-в/ перенос разработанных методов на конкретные олигомерные ферменты, применяющиеся в качестве терапевтических средств.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Прежде чем обсудить имеющиеся в литературе данные касающие ся особенностей инактивации и стабилизации олигомерных ферментов, необходимо отметить следующее. По вопросам, затронутым в нас тоящем обзоре, выполнено огромное количество работ, в которых исследователи имели дело с различными объектами. Нас, однако, в первую очередь, интересовали работы, выполненные с глицераль- дегид-3-фосфатдегидрогеназой и ь-аспарагиназой - т.е.;имен- но с теми ферментами, с которыми мы проводили наши эксперименты. Поэтому им и уделено первостепенное внимание в "Обзоре литературы" .
Особенности проявления функциональной активности олигомерных ферментов
Согласно определению, данному Клотцем с соавт. [ioj , олиго-мерными белками являются те белки, в которых отдельные полипептидные цепи соединены между собой нековалентньми взаимодействиями и которые способны к диссоциации под действием различных факторов. К олигомерным белкам относится подавляющее большинство внутриклеточных ферментов, в то время как секретируемые ферменты /такие, как хорошо изученные протеазы пищеварительного тракта/ представляют собой, в основном, одноцепочечные белки. Необходимо, однако, отметить, что при упоминании об одноцепочечных белках, имеется в виду не только одна полипептидная цепь, но и несколько, если они соединены ковалентными связями. Иммуноглобулин G -одно-цепочечный белок, хотя он состоит из четырех полипептидных цепей, соединенных в единое целое ковалентными s-s связями. Существует довольно много причин ассоциации отдельных субъединиц в нековалентно связанные агрегаты. Главные из них - это снижение внутриклеточного осмотического давления, сближени.:. ферментов метаболического пути в целях исключения потерь продуктов метаболизма и возможность создания нового уровня регуляции ферментативной активности II .
Уникальной особенностью олигомерных ферментов является их способность к диссоциации. Самые незначительные изменения во внешней среде фермента могут вызвать подобное явление. Необходимо отметить, что именно эта способность фермента и позволяет выйти на новый уровень регуляции ферментативной активности-/а значит и метаболизма в целом/, т.к. олигомерные ферменты диссоциируют в растворе, как правило, на неактивные или малоактивные субъединицы [12 J .
Одним из интересных вопросов, возникающих при рассмотрении проблем стабильности и функционирования олигомерных ферментов, является вопрос об активности отдельных субъединиц. Суть вопро-са; состоит в том, что ферментативную активность индивидуальных субъединиц довольно трудно измерить в растворе из-за их способности к быстрой реассоциации. В 1970 г. Чэн предложил оригинальный способ получения изолированных субъединиц в недиссоциирующих условиях [I3J . Он заключается в следующем: субъединичный фермент /в оригинальной работе это была альдолаза/ иммобилизовали на сефарозе бромциановым методом, подбирая концентрацию сшивающего агента таким образом, чтобы тетрамерная молекула фермента была связана с матрицей только через одну субъединицу. Затем иммобилизованный фермент подвергали диссоциации 8 М мочевиной, после чего отдельные субъединицы, ковалентно связанные с носителем, ренатурировали путем медленного диализа против буфера, не содержащего мочевину. Такие иммобилизованные субъединицы демонстрировали ферментативную активность в условиях, при которых активна тетрамерная альдолаза. Эта публикация вызвала большое количество исследований на эту же тему, но с другими объектами. В частности, подобные результаты были получены Н.К.Наградовой с соавт. для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [14] .
Наиболее полно свои взгляды на значение активности субъединиц Чэн выразил в обзоре [іб] , в котором он высказывает мысль о том, что четвертичная структура олигомерных ферментов, главной характеристикой которых он считает полное отсутствие проявления у них эффекта аллостерии, не нужна для функциональной активности, о чем свидетельствуют эксперименты с иммобилизованными мономерами. Следует отметить, что единственным примером, подтверждающим рассуждения автора, являются все те же эксперименты с альдолазой - ферментом, для которого рядом других авторов была продемонстрирована активность мономеров даже в растворе [і2,Іб] Заметим однако, что удельная ферментативная активность мономеров в экспериментах Чэна вьше /порядка 30% от удельной активности субъединиц в составе тетрамера/, чем для мономеров альдолазы в растворе /порядка 7% [іб] /. Автор. [l5J замечает, что ситуация в корне меняется в случае аллостерических ферментов, в которых межсубъединичные взаимодействия являются определяющими для поддержания каталитической активности агрегата субъединиц в целом.
Между тем,накопилось достаточное количество экспериментальных данных, свидетельствующих о полной инактивации олигомерных ферментов различных классов при их диссоциации в растворе: для митохондриальной малатдегидрогеназы [17,18] , люцеферазы светляков [l9,2o] , мышечной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [21,22,23] , бактериальной L -аспарагиназы [24] . В обзоре Гі2І автор обобщает данные по исследованию явления ассоциации-диссоциации для II ферментов различных классов и отмечает, что только в случае мышечной альдолазы удалось зарегистрировать частичную ферментативную активность мономеров в растворе. Он высказывает точку зрения, противоположную точке зрения Чэна:, диссоциация и инактивация - неразделимые процессы для олигомерных ферментов /как демонстрирующих аллостерические эффекты, так и не обладающие ими/.
Для ряда ферментов, включая митохондриальную малатдегидро-геназу и мышечную глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, была продемонстрирована как активность иммобилизованных субъединиц, так и полная инактивация при диссоциации в растворе. Кажущееся противоречие подобных данных, с нашей точки зрения, объясняется следующим образом. По всей видимости, ассоциированная форма олигомер-ного фермента в растворе гораздо стабильнее, чем отдельные мономеры, подвергшиеся диссоциации. В то же время, наличие полисаха-ридной матрицы, на которой иммобилизованы мономеры, может существенно снизить скорость их инактивации. Подобные явления широко известны в инженерной энзимологии [25,2б] . Таким образом, вопрос об активности мономеров в растворе и в иммобилизованном состоянии, по нашему мнению, сводится к вопросу о стабильности ассоциированной и диссоциированной форм фермента и о методах повышения или понижения этой стабильности. Этот вопрос ставили и другие исследователи, например Мюллер с соавт. [27J , которые также указывают на возможность стабилизирующего воздействия сефарозы как на причину стабильности иммобилизованных мономеров /в данном случае митохондриальной малатдегидрогеназы/.
Молекулярные основы стабильности олигомерных ферментов из термофильных микроорганизмов
Наибольшее количество фактологического материала накопилось в области исследования влияния на стабильность ферментов субстратов, коферментов и других эффекторов. Глицеральдегид-3-фосфатде-гидрогеназа,в этом аспекте,не является исключением. Многие авторы наблюдали защитное действие ее кофермента НАД по отношению к инактивации с помощью различных денатурирующих воздействий [бЗ-65J . Для простых одноцепочечных ферментов чаще всего этот факт объясняется "замораживанием" активной конформации, осуществляемым многоточечным взаимодействием эффектора и фермента.
Некоторые представления о механизме стабилизации этого типа для олигомерных ферментов высказаны в работе [бб] . В ней описана теоретическая модель диссоциирующего димерного фермента, который взаимодействует с лигандами, связывающимися в центрах, расположенных между субъединицами. Лиганд в процессе связывания контактирует с обоими субъединицами и служит им своеобразной "скрепкой". Этот факт подтверждается и некоторыми структурными исследованиями. Об активном центре, расположенном в области контакта субъединиц, сообщалось для тирозил-тРНКсинтетазы [б7J , фосфофруктокиназ глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы [69J . Соответствующие данные существуют и для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [70J . Все эти сведения получены на основании рентгеноструктурных исследований при довольно высоких степенях разрешения.
Для аллостерических ферментов получено довольно много данных, показывающих, что различные эффекторы влияют на степень ассоциации этих ферментов, причем аллостерические ингибиторы вызывают диссоциацию, а активаторы - ассоциацию фермента. Из результатов последнего времени можно привести пример с ферментом уридин-киназой. Методами высокоэффективной жидкостной хроматографии было показано [7IJ , что этот додекамерный фермент диссоциирует в присутствии его ингибитора - цитидинтрифосфата на неактивные мономеры. Существует также теоретическая модель, объясняющая явление аллостерии, основанная на ассоционно-диссоционном равновесии [72J . Что касается подобного механизма стабилизации НАДом глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, то в его пользу свидетельствует следуещее явление: присутствие кофермента сдвигает ас-соционно-диссоциативное равновесие в сторону образования тетра-мера [70 ] .
По механизму действия к рассматриваемым явлениям, очевидно, близка стабилизация специфическими антителами и их Fab-фрагмен-тами, отмеченная для дрожжевой глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-назы [73j . Было показано, что образование специфического комплекса антиген-антитело /антиген- Fab-фрагмент/ предохраняет фермент от диссоциативной инактивации под действием АТФ при 4С. Гель-фильтрация комплекса фермент- Fab-фрагмент показала, что последний смещает равновесие в системе тетрамер-димер в сторону более устойчивого тетрамера. По мнению авторов, в данном случае имеет место "замораживание" активной конформации фрагмента благодаря белок-белковому взаимодействию в области антигенных детерминант, которое может приводить к упрочению связи димер-димер9 и которое не позволяет инактивироваться димерной форме фермента в условиях, приводящих к инактивации нативного димера. Можно отметить также, что для бивалентных антител /для которых наряду с моновалентными Fab -фрагментами также наблюдается явление стабилизации/ возможна также стабилизация по типу бифункциональных реагентов /т.е., торможение диссоциации из-за скрепления в единое целое соседних мономеров одной молекулой антитела/.
Таким образом,и в случае применения специфических эффекторов в качестве стабилизаторов мы видим, что стабилизация обеспечивается, по-видимому, упрочением межсубъединичных связей.
Очень часто процесс стабилизации олигомерных ферментов обуславливается различными катионами и анионами. Механизм этого типа стабилизации сходен с явлениями, наблюдаемыми в олигомерах из термофильных микроорганизмов, с той лишь разницей, что связь между субъединицами образуется, вероятно, через экзогенный муль-тивалентный ион, контактирующий с заряженными группами на поверхности соседних субъединиц. Стабилизирующее действие оказывают, в основном, поливалентные катионы и анионы, хотя из этго правила существуют исключения [74J .
Фосфат - наиболее часто встречающийся анион, стабилизирующий большое количество белков различных классов. Что касается субъединичных ферментов, то его стабилизирующее действие было продемонстрировано на примере лактатдегидрогеназы [75J , причем, одновременно двумя методами - с помощью ультрацентрифугирования и фронтальной гель-хроматографии - было показано, что фосфат стабилизирует четвертичную структуру фермента и препятствует его диссоциации на отдельные субъединицы. Авторы работы [76J исследовали влияние фосфата на термостабильность 6-фосфоглюконатде-гидрогеназы. Наблюдавшуюся термостабилизацию объясняли наличием фосфатных солевых мостиков, скрепляющих между собой различные участки полипептидных цепей. Авторы отмечают, что подобным действием обладает и сульфат-анион.
Среди катионов наиболее широко изучено стабилизирующее действие на олигомерные ферменты кальция. С помощью этого катиона удалось повысить стабильность пероксидазы из хрена [77J , микробной аденозинтрифосфатазы [78] . Бактериальную транскарбок-силазу удалось застабилизировать с помощью ионов Со [79J , причем было показано, что добавление иона предотвращает диссоциацию на неактивные субъединицы. Добавление в той же концен-трации ионов мд, "мп, Fe, NI, са, cu не вызвало стабилизирующего действия. Слабый эффект стабилизации достигали при добавлении иона zn2+ . Этот факт свидетельствует, по-видимому, о том, что необходимо точное соответствие размеров иона специфическому месту связывания на ферментной глобуле. Как мы видим, и в случае стабилизации олигомерных ферментов солями реализуется усиление электростатического взаимодействия между отдельными субъединицами.
Стабилизация ферментов путем одноточечной модификации поверхностных функциональных групп
В другой работе, посвященной, в основном, исследованию влияния гуанидирования лизиновых остатков на термостабильность лактатде-гидрогеназы, было выяснено также влияние на термостабильность обработки фермента единственным бифункциональным реагентом - диметилсу-беримидатом [60J . Авторами показано, что фермент со сшитыми субъединицами обладает максимальной термостабильнстью, превышающей термостабильность препарата с введенными гуанидиновыми группами /моди-фицированно 15 лизиновых остатков на субъединицу/. Причем, согласно данным гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, тот же препарат содержит максимальное количество сшитой фракции /т.е. ковалентно сшитых димеров, тримеров и тетрамеров/. В этой работе не было выполнено исследование влияния длины сшивающего реагента на термостабильность фермента и эффективность сшивки субъединиц. Обработка фермента бифункциональным реагентом в рассматриваемой работе приводилась авторами только в качестве контрольного опыта, сравнения с эффектом гуанидирования фермента, приводящего,в данном случае,к уси- лению ионных межсубъединичных связей, и никаких выводов, посвященных введению ковалентных межсубъединичных сшивок авторы не делают.
Еще одна работа [74J была посвящена влиянию межсубъединичных сшивок на стабильность олигомерного фермента. В этом случае авторы выбрали для исследования специфический объект - бактериальную фор-милтетрагидрофолатсинтетазу - тетрамер, диссоциирующий на неактивные субъединицы в отсутствие одновалентных катионов. Удаление этих ионов в данном случае и служило тестом на стабильность фермента. В этой работе, как и в предыдущей, использовался только один сшивающий реагент диметилсуберимидат, и вопрос о том, является ли он оптимальной сшивкой для исследуемого фермента, не выяснялся. Реакцию сшивания авторы проводили по методу пионеров использования диимидо - 35 эфиров в качестве сшивающих реагентов Дэвиса и Старка [83j , при использовании которого не принимаются специальные меры для предотвращения межмолекулярных сшивок, в то время как доля межмолекулярных гатрегатов, судя по приведенным результатам гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия,довольно велика. Тем не менее, удельная активность формилтетрагидрофолат-синтетазы после диализа против буфера, не содержащего однова-летные катионы щелочных металлов, в 20 раз выше у препарата с поперечносшитыми субъединицами, чем у нативного фермента, что говорит о несомненной стабилизации четвертичной структуры, ответственной в данном случае за поддержание каталитической функции, ковалентными межсубъединицными сшивками.
Как можно судить из рассмотренных выше немногочисленных работ, посвященных стабилизации субъединичных ферментов бифункциональными реагентами,,эти исследования обладают следующими существенными недостатками: І/ в них часто отсутствуют исследования влияния длины реагента на стабильность фермента, 2/ часто отсутствуют необходимые контроли, в частности, обработка монофункциональным аналогом бифункционального реагента, 3/ во всех этих работах применялся только один тип сшивающих реагентов - диими-доэфиры, что отрезало авторам путь к регулированию степени инактивации ферментов в процессе химической модификации, 4/ авторы часто не применяют никаких мер,препятствующих межмолекулярной сшивке и образованию полимеров, что может влиять на механизм инактивации и вести к нежелательным эффектам, известным для иммобилизованных ферментов /см. "Введение"/ при их практическом применении, 5/ имеет место труднообъяснимая дестабилизация ферментов при обработке определенными бифункциональными реагентами, связанная.по-видимому, с методическими неточностями. Наличие этих недостатков свидетельствует о том, что объема ранее выполненных исследований явно недостаточно для того, чтобы сформулировать более общие принципы стабилизации олигомерных ферментов. Видна необходимость проведения специального систематического исследования, акцентирующего внимание на подборе оптимального сшивающего агента.
В "Обзоре литературы" мы не приводим многочисленных данных стабилизации олигомерных ферментов с помощью иммобилизации их на полимерных и неорганических носителях /для обзора см. [l,5j /. Необходимо отметить однако, что механизм стабилизации в этом случае, очевидно, часто аналогичен механизму стабильности бифункциональными реагентами: полимерный носитель также препятствует диссоциации олигомера на отдельные субъединицы.
Как показывает опыт изучения олигомерных ферментов из термофильных источников, чтобы увеличить стабильность подобных систем, природа пошла по пути упрочения межсубъединичных связей. С другой стороны, химическая модификация поверхностных аминокислотных остатков - также хорошо зарекомендовавший себя прием для решения проблем изменения различных свойств фермента, в том числе,и его стабильности. Однако, как можно заметить из рассмотренных литературных данных, в случае субъединичных ферментов, одноточечная химическая модификация может привести к дестабилизации фермента вместо его стабилизации. Обработка же бифункциональными реагентами, успешно примененная ранее для стабилизации одноцепочечных ферментов и приводящая к образованию межсубъединичных ковалентных связей, с нашей точки зрения, лучше может служить цели увеличения стабильности олигомерных ферментов.
Стабилизация олигомерных ферментов с помощью внутримолекулярного сшивания бифункциональными реагентами
ЭПР-спектроскопическое изучение препаратов нативной и модифицированной ГАФД.В наших исследованиях мы использовали новый ЭПР-спек-троскопический метод, связанный с рекомбинацией свободных радикалов. Этот метод основан на регистрации зависимости концентрации свободных радикалов, наведенных в результате непрямого (f-радиолиза молекул воды при температуре жидкого азота /77К/ в некоторых участках полипептидных цепей белка, от температуры при медленном разогреве системы. При соответствующей температуре возрастает молекулярная подвижность макрорадикалов, локализованных на полипептидных цепях белка, и они получают возможность рекомбинировать между собой. Интенсивность ЭПР-сигнала при этом снижается.
Препараты нативной и модифицированной ГАШД /растворы в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5/ помещали в ампулы из специального стекла СК-4В, СССР, не дающего ЭПР-сигнала после $-облучения. Кислород удаляли насыщением аргоном. Замораживание образцов осуществляли погружением ампулы /4 мм в диаметре/, содержавшей 300 Ал исследуемого расвора в жидкий азот на 20-30 сек. Предварительно было продемонстри-рованно, что незначительные отклонения от процедуры замораживания не влияют на форму кривой рекомбинации радикалов. Радиолиз образцов осуществляли облучением Y-квантами кобальтового источника /доза порядка 10 мрад/. Спектры ЭПР записывали на спектрометре ЭПР-2М, СССР. Концентрацию свободных радикалов определяли спомощью специальной номограммы. Изменения абсолютной концентрации радикалов /в.зависимости от изменения дозы облучения/ не влияли на форму кривой рекомбиныции".
Изучение термостабильности препаратов ЯЩЦ в зависимости от температуры при сравнении гомологичных ферментов из термофильных и мезо-фильных источников проводили в условиях, взятых из оригинальной работы [42 J . Раствор фермента в концентрации 0,5 мг/мл в буфере 0,02 М фосфата натрия, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ меркаптоэтанола, рН 7,0 нагревали при различных температурах в течение 20 мин в термостате, затем помещали в лед, охлаждали и измеряли остаточную активность в стандартных условиях.
Определение концентраций белка проводили двумя методами: спек-трофотометрически, по поглощению при 280 нм, принимая ?80 = № см /мг для холо ГАФД, 0,83 для апо-ГАФД [112J , а также с помощью метода Брэдфорд [II3J . Приготовление реактива для определения белка по последнему методу осуществляли следующим образом. 100 мг красителя Кумасси бриллиантового синего G-250 растворяли в 50 мл этанола, к этому раствору добавляли 100 мл концентрированной ортофос-форной кислоты. Полученный раствор разбавляли до литра деионизованной водой, а затем фильтровали через стеклянный фильтр № 3. Концентрацию белка измеряли, добавляя пробу /до 100 Мг белка/ в 3 мл раствора реагента и измеряя оптическую плотность /против соответствующего контроля/ при 595 нм. Для построения калибровочной кривой в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.
Дополнительную очистку ферментов и смену буфера производили с помощью гель-фильтрации на мини-колонках с сефадексом G-50 в центрифуге [lI4j . Преимущество этого метода перед обычным обессолива-нием на колонке с сефадексом состоит в том, что при правильно подобранном режиме центрифугирования проба белка не разбавляется. Для этой цели использовали два вида мини-колонок, изготовляемых из пластмассовых шприцов: размера 1,2 5,0 см для очистки пробы объемом I мл и 2,0 5,0 для пробы объемом 2 мл. Объем пробы подбирали для каждого вида колонок экспериментально. Мини-колонки помещали в стандартные центрифужные пробирки так, чтобы на дне пробирки оставалось место для элюата. Сефадекс уравновешивали требуемым буфером и подвергали первому центрифугированию /Змин, 2000д/ на центрифуге RC-3, Sorvaii, США, затем на частично обезвоженный сефадекс наносили пробу белка и подвергали повторному центрифугированию /10 мин, 500 д, и 3 мин 2000 д/. Пробу белка отбирали со дна центрифужной пробирки.
Основываясь на результатах анализа литературных данных, мы ожидали, что применение подхода, разработанного в нашей лаборатории ранее и заключающегося в наложении искусственных ковалентных сшивок на ферментную глобулу, будет особенно успешно в случае оли-гомерных ферментов. Если скрепить между собой субъединицы с помощью бифункциональных реагентов, то можно полагать, что этим удастся,;, затруднить их диссоциацию /а, следовательно, и диссоциативную инактивацию/ под действием различных денатурирующих условий и повысить таким образом стабильность фермента /см. схему 4/. Во всяком случае,это положение должно быть верно для ферментов, отдельные субъединицы которых не обладают каталитической активностью /обсуждение активности субъединиц олигомерных ферментов см. в главе I "Обзора литературы"/. Желательно, чтобы наложение сшивок происходило по простому механизму и не вызывало значительной инактивации фермента за счет химической модификации функциональных групп на поверхности белковой глобулы.
