Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Конформационная стабильность глобулярных ферментов
2.2. Термоинактивация ферментов с четвертичной структурой
2.3. Методы стабилизации ферментов
2.4. Физико-химические свойства р -галактозидазы
2.5. Применение Р -галактозидазы
3. Материалы и методы
3.1. Использованные реактивы и препараты
3.2. Использованная аппаратура
3.3. Методы проведения экспериментов
3.3.1. Определение активности р -галактозидазы
3.3.2. Определение термоинактивации р -галактозидазы
3.3.3. Микрокалориметрическое определение изменения энтальпии .
3.3.4. Иммобилизация р -галактозидазы на органических носителях
3.3.5. Иммобилизация р -галактозидазы включением в полиакриламидный гель
3.3.6. Определение концентрации белка
3.3.7. Математическая обработка экспериментальных данных
4. Результаты и обсуждения
4.1. Характеристика дрожжевой ft -галактозидазы .
4.1.1. Изучение зависимости активности дрожжевой ft -галактозидазы от температуры и рН
4.1.2. Зависимость удельной активности ft -галактозидазы от концентрации белка при разных температурах
4.1.3. Ингибирование дрожжевой ft -галактозидазы галактозой
4.2. Диссоциативная термоинактивация дрожжевой-галактозидазы
4.2.1. Изучение термоинактивации дрожжевой р -галактозидазы при различных концентрациях белка
4.2.2. Влияние Сахаров на термостабильность дрожжевой ft -галактозидазы
4.2.3. Влияние модификации дрожжевой ft -галактозидазы глиоксалем на диссоциативную термоинактивацию
4.2.4. Термоинактивация ft -галактозидазы в присутствии ft -меркаптоэтанола .
4.3. Разработка методов иммобилизации дрожжевой р-галактозидазы
4.3.1. Разработка методов иммобилизации дрожжевой Р -галактозидазы на органических
носителях
4.3.2. Разработка методов иммобилизации дрожжевой J3 -галактозидазы включением белка в полиакриламидный гель
4.3.3. Характеристика иммобилизованных препаратов дрожжевой р -галактозидазы
5. Выводы
6. Использованная литература
- Конформационная стабильность глобулярных ферментов
- Определение активности р -галактозидазы
- Зависимость удельной активности ft -галактозидазы от концентрации белка при разных температурах
- Влияние модификации дрожжевой ft -галактозидазы глиоксалем на диссоциативную термоинактивацию
Введение к работе
Расширение и углубление научных исследований в области биотехнологии является одной из важнейших задач советской науки. Одним из наиболее перспективных направлений биотехнологии следует считать инженерную энзимологию - технологический катализ с помощью иммобилизованных ферментов. Практическое применение ферментов, однако, до сих пор ограничивается сравнительно низкой стабильностью ферментных препаратов. Поэтому изучение механизмов инактивации ферментов составляет научную основу стабилизации ферментов и является одной из важнейших задач инженерной энзимологии. Особый интерес представляет изучение термостабильности ферментов с четвертичной структурой, так как процессы диссоциации-ассоциации влияют на стабильность изучаемых препаратов и их кинетические свойства в процессе термической инактивации.
Использованию ферментов в пищевой промышленности отводится важное место при реализации решений Продовольственной программы СССР. В связи с задачами, вытекающими из Постановления ЦК КПСС и Совета Министров СССР о мерах по улучшению использования обезжиренного молока, пахты и молочной сыворотки, актуальное значение приобретает изучение фермента fi -галактозидазы, катализирующей реакцию гидролиза J& -галактозидов, в том числе и молочного сахара - лактозы.
В настоящее время в молочной промышленности поставлена за дача резкого увеличения производства обезжиренного молока, пахты и молочной сыворотки. В Советском Союзе промышленность ежегодно получает 32-35 млн. т обезжиренного молока и пахты и 10 млн. т молочной сыворотки. К началу одиннадцатой пятилетки промышленная переработка сыворотки достигла 3,4 млн. т, т.е. перерабатывается только 30-40% ценного молочного сырья.
В текущей пятилетке предусмотрено резко увеличить производство сухой и сгущенной сыворотки, к которым проявляют большой интерес со стороны предприятий пищевой промышленности. Однако сгущенные концентраты из сыворотки имеют специфический недостаток - слишком высокое содержание лактозы. Кристаллизуясь, она выпадает при хранении в осадок, что снижает товарные качества продукта. Не сбраживаясь пекарскими дрожжами, лактоза может только ограниченно вноситься в хлебобулочные и кондитерские изделия и в корма для сельскохозяйственных животных.
Устранить отмеченные недостатки молочных концентратов можно путем полного или частичного гидролиза лактозы до моносахаридов - глюкозы и галактозы. Это повышает сладость продукта, его стойкость к кристаллизации и улучшает питательные свойства.
Концентраты гидролизованной сыворотки можно с успехом применять в хлебопечении для улучшения качества хлеба и экономии муки и сахара; в кондитерской промышленности; при производстве напитков; в мясной промышленности; в заменителях цельного молока для сельскохозяйственных животных и в производстве кормовых продуктов.
Применение уЗ -галактозидазы имеет особое значение для лечения людей с лактозной недостаточностью и при получении продуктов детского и диетического питания с более усваиваемым углеводным составом.
Для гидролиза лактозы на практике используют грибную, бактериальную и дрожжевую fi -галактозидазу. С практической точки зрения наиболее изученной является грибная /Ъ -галактозидаза, пригодная по своим энзиматическим свойствам для обработки лактозы в сыворотке молока, в частности, в творожной сыворотке. Учитывая значения рН-оптимума фермента для гидролиза лактозы в цельномолочных продуктах и обезжиренном молоке, а также в под-сырной сыворотке, более целесообразно применять jS -галактозидазу дрожжевого происхождения. Однако технологическое применение дрожжевой уЗ -галактозидазы до сих пор затруднено ее низкой стабильностью.
В связи с вышеуказанным, проблему изучения механизмов инактивации и термоинактивации дрожжевой JZ -галактозидазы следует считать весьма актуальной. Решение этого вопроса имеет большое практическое значение.
Целью настоящей работы явилось исследование кинетики термоинактивации уЗ -галактозидазы из дрожжей klujjVerDimyces fr&Qflts » выяснение механизма и причин инактивации фермента, изучение на этой основе возможностей стабилизации его активной четвертичной структуры и разработка методов получения стабильных препаратов дрожжевой ft -галактозидазы.
Постановка настоящей работы связана с выполнением целевой комплексной программы 0.74.05, задания 05: "Исследование возможностей целенаправленного изменения каталитических свойств ферментов путем их химической модификации, включая иммобилиза цию их разными методами".
Автор выражает глубокую благодарность проф. О.М.Полтораку и д.х.н. Е.С.Чухрай из Московского государственного университета за ценные советы при теоретическом анализе экспериментальных данных.
1.2. Аннотация
Актуальность. Избирательный гидролиз лактозы в побочных продуктах молочной промышленности с помощью уб -галактозидазы позволяет целесообразно использовать питательные вещества обезжиренного молока и молочной сыворотки и вырабатывать новые виды продуктов детского и диетического питания. Однако до настоящего времени остались недостаточно изученными механизмы инактивации и причины термоинактивации дрожжевой J5 -галактозидазы, не выяснены возможности иммобилизации этого технологически важного фермента. Поэтому изучение механизма термоинактивации и стабилизации дрожжевой р -галактозидазы относится к актуальным проблемам современной инженерной энзимологии.
Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование кинетики термоинактивации р -галактозидазы из дрожжей" Юиу-Yeromyces fragilis , выяснение кинетического механизма этого процесса и использование полученных данных для поиска путей стабилизации активной четвертичной структуры jS -галактозидазы и разработки методов получения стабильных иммобилизованных препаратов дрожжевой у5 -галактозидазы.
Научная новизна работы. На основании полученных в работе данных установлена двухстадийная кинетическая схема диссоциативной термоинактивации J3 -галактозидазы в растворе, выяснен механизм ее термоинактивации и определены все кинетические константы этого процесса.
Найдено и охарактеризовано стабилизирующее действие на фермент галактозы, глюкозы и лактозы, а также р -меркаптоэтанола. Показано, что их стабилизирующее действие связано с подавлением первой стадии диссоциативной термоинактивации дрожжевой уЗ -галактозидазы.
Установлено, что инактивация ft -галактозидазы в растворе связана с окислением 5Н -групп, ответственных за формирование активной четвертичной структуры фермента.
Практическое значение работы. Предложен способ иммобилизации дрожжевой у5 -галактозидазы на органоминеральных носителях и показана пригодность полученных нерастворимых препаратов для гидролиза лактозы при нейтральных значениях рН, наиболее подходящих для переработки продуктов из цельного молока.
Определены характерные значения кинетических параметров процесса термоинактивации дрожжевой ft -галактозидазы по диссоциативному механизму, необходимые при оптимизации технологического процесса с применением биокатализаторов.
Апробация работы. Результаты работы доложены на 1У-ой Республиканской конференции молодых ученых-химиков ЭССР (г. Таллин, 1981); 1У-ом Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (г. Киев, 1983).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научных статьи и тезисы двух докладов.
Содержание и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (163 ).
Работа представлена на 138 страницах машинописного текста, в т.ч. 39 рисунков и 17 таблиц.
Конформационная стабильность глобулярных ферментов
Конформационная потенциальная энергия белка в растворе определяется рядом факторов, связанных со структурными характеристиками молекулы, общими для всех нативных и денатурированных белков /54/: 1) дисперсионные взаимодействия, зависящие от ориентации фрагментов молекулы друг относительно друга. Дисперсионные силы обычно считают изотропными, энергия связи 21 кДж/моль; 2) электростатические взаимодействия. Общая свободная энергия, благоприятствующая образованию солевого мостика, составляет около 4 кДж/моль /131/; 3) водородные связи образуются между 90% всех внутримолекулярных полярных групп /70/ и играют особую роль в стабилизации белковых глобул /130/, энергия межпептидной водородной связи около 12,6 кДж/моль; 4) гидрофобное связывание боковых аминокислотных остатков, возникающее как результат взаимодействия белковой полимерной цепи с молекулами растворителя и приводящее к сближению и "сцеплению" неполярных остатков одной цепи, играет важную роль в стабилизации нативной конформации белков в водных растворах; 5) увеличение конформационной энергии на 2-6 энтропийных единиц или 8-25 Дж/мольтрад на один развернувшийся остаток /4/, при разворачивании белка дает существенную составляющую свободной энергии дестабилизации нативных белков; 6) стабилизирующее влияние на нативную конформацию белка оказывает образование внутримолекулярных дисульфидных связей; 7) специфические лиганды индуцируют формирование ферментов и стабилизируют нативную структуру белков /59/, изменение свободной энергии связано с явлением кооперативного действия и регуляции /72/. С такими же явлениями связана стабильность субъединичных ферментов /54/.
Таким образом, полная свободная энергия денатурации белка состоит из энергий различных взаимодействий, указанных выше. Трудно выделить тип взаимодействий, являющийся главным и определяющим стабильность нативной конформации всех белков. Возможно, что связь стабильности фермента с его конформацией и микроокружением индивидуальна для каждого фермента /159/. Существует множество теорий, где главную роль в образовании и поддержании нативной структуры белка отводили межпептидным водородным связям, образованным карбонильной и шинной группами аминокислотного остатка, гидрофобным воздействиям /108/ за счет отрицательного энтропийного эффекта, который для каждой алифатической боковой цепи, окруженной молекулами воды, составляет примерно 20 энтр. ед. или 83 кДж/мольтрад /22/. При количественной оценке конформационной стабильности следует считаться с ионными и дисперсионными силами /44, 115/. Таким образом, конформацион-ная стабильность и общие закономерности денатурации глобулярных белков определяются пространственной системой внутримолекулярных кооперативных взаимодействий, как видно и на рис. I. Бели учесть, что различия в свободной энергии между нативной и денатурированной конформациями глобулярных белков составляют только 20-65 кДж/моль, и что стабильность белковой структуры опреде ляется балансом между большими внутримолекулярными стабилизирующими силами, то становится ясным, что даже незначительное изменение этого баланса может привести к сильному изменению стабиль-ности белков /52/. процессе денатурации белка существуют две гипотезы: термодинамическая и кинетическая /28, 54/. В первом случае нативная структура белка отвечает локальному минимуму свободной энергии, т.е. метастабильному состоянию и при денатурации белка переходит в денатурированное состояние, которое соответствует более глубокому локальному или глобальному минимуму свободной энергии, т.е. кинетически стабильному состоянию белка. В случае кинетической денатурации нативная структура белка отвечает абсолютному минимуму свободной энергии. Таким образом, белок не в состоянии преодолеть высокий барьер л 6 , свободную энергию активации. Этот барьер включает в себя большую энтропийную составляющую, скомпенсированную энтальпией или свободной энергией растворителя, как это имеет место в нативной структуре. Поэтому барьер AS почти полностью определяет барьер д&" . В случае кинетической стабильности, нативная конформация белка может существовать длительное время. Часто кинетическая стабильность свойственна денатурированным белкам по отношению к процессу ренату-рации, что делает процессы денатурации практически необратимыми, хотя с точки зрения термодинамики процессы, не осложненные вторичными процессами, должны быть полностью обратимыми /59/.
Среди многих типов денатурации одним из распространенных является термоденатурация. С точки зрения термодинамики с повышением температуры возрастает деструктурирование воды и до 60С силы гидрофобных взаимодействий возрастает с увеличением температуры. Увеличение температуры делает возможным конформацию белка с большей свободной энергией, увеличивая конформационную энтропию и приводит к развертыванию макромолекулы. С увеличением температуры ослабляются также внутримолекулярные взаимодействия, стабилизирующие белок (см. рис. 2).
Авторы /24/ предлагают механизм необратимой термодинамической денатурации белков, сущность которого состоит в том, что при высоких температурах в ферменте нарушаются "правильные" не-ковалентные взаимодействия, которые поддерживают нативную структуру, существующую при обычных температурах, и образуются соответствующие высокой температуре "ненативные" нековалентные связи. При понижении температуры эти "неправильные" нековалентные взаимодействия, хотя они и становятся термодинамически неустойчивыми, могут сохраняться по чисто кинетическим причинам, поскольку молекулярная подвижность полипептидных цепей с понижением температуры должна падать.
Определение активности р -галактозидазы
Широкое применение ее до последнего времени было ограничено из-за относительно высокой цены нативного фермента и низкой стабильности некоторых ферментных препаратов в растворе. Стабилизация и иммобилизация /5 -галактозидазы позволяет увеличить выработку продукта на единицу фермента и создает возможности для расширенного использования /Ъ -галактозидазы.
Основным направлением применения уЗ -галактозидазы является лечение и питание людей с лактазной недостаточностью (интоле-рантностью к лактозе) /85, 121, 123, 144/. Эта непереносимость связана с генетически обусловленным дефицитом лактозы в кишечном тракте /121/. Лактоза в пищеварительном тракте таких людей не усваивается и вызывает метеоризм и диарей /144/. Доля таких людей особенно высока среди некоторых народностей Африки и Азии, среди взрослого населения европейских государств недостаточность лактозы встречается примерно у 10%, а явная непереносимость молока - у 1-2%. По данным Института усовершенствования врачей в СССР лакт зной недостаточностью страдает 24% населения, а полной непереносимостью - 1%. В ЭССР число людей, имеющих лактізную недостаточность охватывает более 13% населения /6/. На рис. 4 приведена статистическая характеристика населения и стран, страдающих лактазной недостаточностью.
В связи с этим Jb -талактозидазу в последние годы применяют как медицинский препарат в виде таблеток, капсул, специальных растворов и эликсиров /121/. Большое значение приобрело применение fi -галактозидазы для получения низколактозных молока и молочных продуктов, предназначенных для диетического питания людей, страдающих непереносимостью к лактозе. Создание низколактозных молочных продуктов приобретает особо важное значение для питания детей грудного возраста с лактазной недостаточностью /I/. Такие продукты имеют более усваиваемый углеводный состав, соответствующий физиологическим особенностям детей грудного возраста и снижающим бродильные процессы в кишечнике искусственного вскармливания детей /I, 37/. В настоящее время некоторые молочные продукты с гидролизованной лактозой для лечебных учреждений выпускаются в производственных масштабах. Для получения низколактозного молока в США применяют лактазу в виде ферментного препарата nM3Ci/dCt ", который представляет собой порошок лактазы, выделенной из дрожжей Sac&haro myces lacrtis /НО/. Для лактозоинтолерантных людей разработаны специальные соевосывороточные напитки с частичной (на 30-80%) гидролизован-ной лактозой. В Голландии выпускается сухое молоко под названием "Laotaloz ", в котором гидролизовано 99% лактозы, в Италии стерилизованное молоко "Z#/77//", в котором гидролиз овано 80% лактозы /66/.
В настоящее время применение уЗ -галактозидазы предусматривается также при гидролизе лактозы в побочных продуктах переработки молока, т.е. в обезжиренном молоке, пахте и особенно сыворотке, с целью полной и рациональной утилизации питательных веществ вторичного сырья /I, 5, 48, 57, 76, 89, 107, 112, 149, 158/. Молочная сыворотка, например, содержит около 6,5% сухих веществ (около 50% содержания их в молоке), в том числе: белка - 1,0%, лактозы - 4,5%, минеральных солей - 0,7%, жира - 0,4% и целого ряда витаминов группы В /36/. Из общего объема молочной сыворотки перерабатывают в мировом масштабе менее 50% /69/. В Советском Союзе в результате увеличения производства продукции из вторичного сырья промышленная переработка обезжиренного молока и пахты доведена в 1981 г. до 46,6% от ресурсов и молочной сыворотки до 38,6% против соответственно 23,9 и 8,6% в 1970 г. /29/. При хранении сыворотки в натуральном виде снижается ее питательная ценность при 35-40С в течение 12 часов на 25% /36/. Гидролиз лактозы в сыворотке увеличивает усваиваемость ее питательных веществ и позволяет вырабатывать новые виды продукции, как патоку /69, 76, 107/, сывороточные напитки /69, 158/ и сухую или сгущенную сыворотку с малым содержанием лактозы для различных отраслей пищевой промышленности /137/. Важнейшим из вышеназванных продуктов, особенно в связи с повышением цены на сахар на мировом рынке, следует считать, т.н. сывороточную патоку, которую получают из депротеинизированной и деминерализованной сыворотки, с помощью /3 -галактозидазы и состоящую в основном из глюкозы и галактозы /76, 103, 158/. В Великобритании разработан и освоен в промышленных условиях способ утилизации богатой белком и молочным сахаром подсырной сыворотки для получения глюкозно-галактозного сиропа. Полученный продукт можно использовать в производстве мороженого, хлебобулочных изделий, кексов, йогурта, молочных десертов, кондитерских изделий, безалкогольных напитков, салатных приправ, соусов, сухих смесей, бутербродных масс и в детском питании /107/.
В производстве кисломолочных продуктов /5 -галактозидаза является интенсификатором молочнокислого брожения, способствующим более быстрой утилизации лактозы бактериями и тем самым сокращению времени сквашивания. Йогурт с гидролизованной лактозой обладает хорошими органолептичними свойствами /92/.
Постановлением ЦК КПСС и Совета Министров СССР о мерах по улучшению использования обезжиренного молока, пахты и молочной сыворотки предусмотрено обеспечить в І98І-І985 гг. производство молочно-белковых концентратов и полуфабрикатов для выработки хлебобулочных и кондитерских изделий. В связи с этим испытаны образцы сгущенной гидролизованной сыворотки при выпечке хлеба /32/. Концентрат с гидролизованной до 50% лактозой вносили в количество до 10% (обычно сгущенной сыворотки, используемой в качестве улучшателя, добавляют 1-3). Исследовались также возможность замены до 30% сахарозы при выпечке батонов.
Зависимость удельной активности ft -галактозидазы от концентрации белка при разных температурах
При изучении свойств иммобилизованных ферментов необходимо учитывать условия их применения. Условия в случае применения иммобилизованной /3 -галактозидазы при гидролизе лактозы в цельномолочных продуктах во многом предопределены свойствами молока (состав, рН и т.п.). Единственным параметром, который можно варьировать в относительно широких диапазонах, является температура субстрата. Исходя из этого, важнейшей задачей при изучении препаратов иммобилизованной дрожжевой /3 -галактозидазы является влияние температуры на свойства препарата.
Значение кинетических параметров определяли при гидролизе 5% раствора лактозы в 0,1 М К-фосфатном буфере и при гидролизе синтетического субстрата, о-нитрофенил-уЗ - о#-галактопиранозида, опыты проводили в периодическом термостатированном реакторе с перемешиванием. Математическая обработка экспериментальных данных производилась с помощью программы "Симплекс".
Для обеспечения максимальной продуктивности ферментного реактора необходимо иметь высокую каталитическую активность фермента. Общеизвестен факт ускорения ферментной реакции при повышении температуры /3, 9/. Однако с повышением температуры увеличивается и скорость термоинактивации фермента. Зависимость кинетики ферментов от температуры характеризуется оптимальной температурой действия.
Исследование температурной зависимости активности иммобилизованной на органических носителях J5 -галактозидазы проводилось в температурном интервале от 30С до 65С при концентрации субстрата 0,002 М НШГ в 0,1 М К-фосфатном буферном растворе. Полученные результаты приведены на рис. 34.
Выяснилось (см. также табл. 4), что при иммобилизации дрожжевой Jb -галактозидазы не происходит значительных изменений в температурной зависимости активности фермента. Значение температурного оптимума как для нативной, так и для иммобилизованной уЗ-галактозидазы при гидролизе ШГ находится около температуры 50С, однако, при температурах 30-45С активность иммобилизованных препаратов уменьшается меньше по сравнению Топт, чем при на-тивном ферменте. Это явление можно объяснить влиянием иммобилизации на структуру белковой молекулы.
С целью выяснения характера рй зависимости активности J5 -галактозидазы иммобилизованной на органических носителях, проведены опыты при разных рН реакционной смеси от рН 5,0 до рН 7,3. Опыты проводились в реакторе с перемешиванием при 30С. Полученные результаты, приведенные в табл. 16, показывают, что значительных изменений в рН-зависимости активности /5 -галактозидазы вследствие иммобилизации фермента не происходит. Значение рН оптимума иммобилизованной J5 -галактозидазы при гидролизе НФГ находится при рН 6,5 как и в случае нативного препарата, также не изменяется форма кривой рН-зависимости. На рисунках 35-37 представлены соответствующие кинетические кривые в полулогарифмических координатах, а табл. 17 суммированы результаты их кинетической обработки. Для сравнительного анализа использовали эффективные величины к и kf , определенные как тангенс угла наклона соответствующей части кривой. Данные рис. 35 и 36 показывают, что кинетика термоинактивации дрожжевой ft -галактозидазы, иммобилизованной на ЯГ также является сложной. Асимптоты к начальному и следующему за ним прямолинейному участку кривых, представленных в полулогарифмических координатах пересекаются в точке излома ( ). Вид кривых аналогичен соответствующим кривым термоинактивации дрожжевой ft -галактозидазы в растворе. Исследование модификации иммобилизованных препаратов /$ -галактозидазы глиоксалем и термоинактивации этих препаратов показало, что модификация не меняет, характер термоинактивации дрожжевой ft -галактозидазы. Однако эффективная константа скорости диссоциации к4 «1,5«10, с, т.е. почти на порядок пре вышает соответствующую величину для фермента в растворе (см. рис. 20). Такие же изменения происходят и с константой денатурации. Она становится равной 3,3 10 , с для иммобилизованного модифицированного фермента вместо 3,6#10 , с" для 3 -галкто-зидазы в растворе. Можно сказать, что процесс температурной инактивации J2 -галактозидазы, иммобилизованной на -ЯГ при 50С ускоряется на порядок. Иммобилизация в этом случае дестабилизирует как субъединицы, так и активную четвертичную структуру. Модификация глиоксалем в этом случае не приводит, как и для фермента в растворе, к закреплению четвертичной структуры. Процесс остается двухстадийным при использовании для модификаци разных концентраций глиоксаля, а к I,5»I0 , с . Однако при этом наблюдается стабилизация субъединичной структуры и константа денатурации убывает и становится такой же как для модифицированного фермента в растворе. На рис. 38 показано влияние модификации различными концентрациями глиоксаля на термостабильность субъединичной структуры уЗ -галактозидазы в растворе и в иммобилизованном состоянии. В первом случае наблюдается дестабилизация, а во. втором - стабилизация и при концентрации глиоксаля выше 10 мг/мл термостабильность субъединицы обеих форм фермента одинакова. Следовательно, использование глиоксаля для иммобилизованной -галактозидазы не позволяет закрепить ее четвертичную структуру фермента, но дает возможность повлиять на к/ » стабилизируя ее субъединицы. Основным показателем оценки иммобилизованных ферментов является жх стабильность в рабочих условиях. Этот показатель обычно является основным критерием отбора препаратов иммобилизованных ферментов для их использования в качестве биокатализаторов в промышленности.
Стабильность уЗ -галактозидазы, иммобилизованной на модифицированном силикагеле, минерально-органическом носителе и в ПААГ-е исследовалась при температуре 40С. Опыты проводились в термостатируемых колонках при длительном гидролизе лактозы. Гидролиз лактозы проводился в Ъ% буферном растворе лактозы рй 6,5. Скорость протока 6,8 мл/мин. В реакционной смеси глюкоза опреде-лялась на автоматическом анализаторе "COhtjflo ".
Влияние модификации дрожжевой ft -галактозидазы глиоксалем на диссоциативную термоинактивацию
Исследование модификации иммобилизованных препаратов /$ -галактозидазы глиоксалем и термоинактивации этих препаратов показало, что модификация не меняет, характер термоинактивации дрожжевой ft -галактозидазы. Однако эффективная константа скорости диссоциации к4 «1,5«10, с, т.е. почти на порядок пре вышает соответствующую величину для фермента в растворе (см. рис. 20). Такие же изменения происходят и с константой денатурации. Она становится равной 3,3 10 , с для иммобилизованного модифицированного фермента вместо 3,6#10 , с" для 3 -галкто-зидазы в растворе. Можно сказать, что процесс температурной инактивации J2 -галактозидазы, иммобилизованной на -ЯГ при 50С ускоряется на порядок. Иммобилизация в этом случае дестабилизирует как субъединицы, так и активную четвертичную структуру. Модификация глиоксалем в этом случае не приводит, как и для фермента в растворе, к закреплению четвертичной структуры. Процесс остается двухстадийным при использовании для модификации разных концентраций глиоксаля, а к I,5»I0 , с . Однако при этом наблюдается стабилизация субъединичной структуры и константа денатурации убывает и становится такой же как для модифицированного фермента в растворе. На рис. 38 показано влияние модификации различными концентрациями глиоксаля на термостабильность субъединичной структуры уЗ -галактозидазы в растворе и в иммобилизованном состоянии. В первом случае наблюдается дестабилизация, а во. втором - стабилизация и при концентрации глиоксаля выше 10 мг/мл термостабильность субъединицы обеих форм фермента одинакова.
Следовательно, использование глиоксаля для иммобилизованной -галактозидазы не позволяет закрепить ее четвертичную структуру фермента, но дает возможность повлиять на к/ » стабилизируя ее субъединицы.
Основным показателем оценки иммобилизованных ферментов является жх стабильность в рабочих условиях. Этот показатель обычно является основным критерием отбора препаратов иммобилизованных ферментов для их использования в качестве биокатализаторов в промышленности.
Стабильность уЗ -галактозидазы, иммобилизованной на модифицированном силикагеле, минерально-органическом носителе и в ПААГ-е исследовалась при температуре 40С. Опыты проводились в термостатируемых колонках при длительном гидролизе лактозы. Гидролиз лактозы проводился в Ъ% буферном растворе лактозы рй 6,5. Скорость протока 6,8 мл/мин. В реакционной смеси глюкоза опреде-лялась на автоматическом анализаторе "COhtjflo ".
Как показывают опытные данные (рис. 39), существует значительная разница между стабильностью 6 -галактозидазы иммобилизованных в ПАА-гель или на поверхности модифицированного силикагеля.ft -галактозидаза, иммобилизованная в ПАА-гель (рис. 39 (2) претерпевает каталитические изменения по механизму, подчиняющемуся формально уравнению первого порядка с эффективной константой равной 2,1 10 , с . Эта величина соответствует эффективной константе скорости диссоциации ft -галактозидазы в растворе. Препарат потеряет 50% активности за 10 часов. На кинетических кривых инактивации ft -галактозидазы, иммобилизованной на поверхности органических носителей, модифицированных с активированным красителем ярко-голубым ЯГ-КХ под влиянием Ь% раствора лактозы в координатах //? А от времени t можно раздельно определить два режима диссоциативной термоинактивации и обозначить точку излома в месте пересечения асимптот к прямолинейным участкам на кинетической кривой. Вид кинетических кривых аналогичен кривым термоинактивации ft -галактозидазы в растворе, представленным на рис. 12 в 4.2.1. Следовательно, инактивация иммобилизованного препарата при 40С соответствует диссоциативной термоинактивации ft -галактозидазы по последовательному механизму согласно схеме 4.5 (в 4.2.1). Данные рис. 3901) показывают, что препараты в течение 20-22 часов практически не потеряют в активности, однако, после этого следует быстрая необратимая инактивация. При этом константа скорости диссоциации олигомерной формы на мономеры ( kf ) оказывается меньше соответствующей константы для J5 -галактозидазы в тех же условиях, a ki совпадает со значениями у5 -галактозидазы в растворе.
Следовательно, иммобилизация дрожжевой уЗ -галактозидазы на силикагеле, модифицированном активированным красителем ярко-голубым, не стабилизирует активную четвертичную структуру и уменьшение константы скорости диссоциации k j связано со стабилизирующим эффектом лактозы.
