Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Физиологические и молекулярные механизмы адаптации растений к низким температурам -11
1.2. Свойства биологических мембран и их зависимость от температуры -16
1.3. Типы десатураз жирных кислот -20
1-3-1. Типы десатураз в зависимости от переносчика субстрата...-20
1-3-2. Типы десатураз в зависимости от донора электронов -21
1-3-3. Типы десатураз в зависимости от построения электрон-транспортной цепи -22
1.4. Десатуразы про-и эукариотических организмов -24
1.4.1. Десатуразы цианобактерий -24
1.4.2. Десатуразы высших растений -28
1.5. Структура десатураз -30
1.6. Экспрессия генов десатураз цианобактерий -34
1.7. Экспрессия генов десатураз высших растений -39
1.8. Аклиматизация клеток к низким температурам: Роль десатураз жирных кислот - 41
1.9. Генетическая инженерия растений как инструмент для изучения физиологических и молекулярных основ защитных ответов, в частности, при устойчивости к низким температурам -47
1.10. Репортерные системы для изучения регуляции экспрессии генов в растениях -49
Глава II. Материалы и методы -58
Глава IIІ. Результаты и обсуждение
3.1. Анализ нуклеотидной последовательности генов desC и desk - 80
3.2. Конструирование прокариотических экспрессионных векторов - 87
3.3. Сравнительный анализ экспрессии нативных и гибридных генов desC и desA в клетках Е coli - 89
3.3.1. Молекулярный анализ бактериальных трансформантов, несущих плазмиды с нативными desC, и desk и гибридными desC-НсВМЗ и desA-ІісВМЗ генами -89
3.3.2. Изучение действия введенных генов ацил-липидных десатураз на состав жирных кислот в бактериальных трансформантах, несущих плазмиды с нативными desC и desk и гибридными desC-ІісВМЗ и desA-ІісВМЗ генами -95
3.3.3. Изучение действия введенного гена Д9-ацил-липидной десатуразы на рост бактериальных трансформантах, несущих плазмиды с нативньш desC и гибридным desC-ІісВМЗ генами -99
3.4. Получение трансформантов картофеля и молекулярно-биологический анализ полученных растений-регенерантов -102
3.5. Качественный и количественный состав ЖК липидов первичных трансформантов картофеля -107
3.6. Определение устойчивости к низким температурам контрольных и грансформангов растений но интенсивности перекисного окисления липидов -112
3.7. Определение устойчивости к низким температурам контрольных и трансформант ов растений по выходу электролитов -115
Заключение -119
Выводы -121
Список цитируемой литературы
- Свойства биологических мембран и их зависимость от температуры
- Десатуразы про-и эукариотических организмов
- Конструирование прокариотических экспрессионных векторов
- Изучение действия введенного гена Д9-ацил-липидной десатуразы на рост бактериальных трансформантах, несущих плазмиды с нативньш desC и гибридным desC-ІісВМЗ генами
Введение к работе
Температура - важнейший фактор окружающей среды, который определяет распространение и с шествование живых организмов на планете Исследование физиологических и молекулярных механизмов холодоустойчивости растений является одним из наиботее важных направлении современных физиолоіии и биохимии растений
Известно, что урожай сельскохозяйственных культур во мноіих районах ограничивается не средними климаїическими показателями, а короткими периодами воздействия неблаюприятных меіеорологических факторов, в частности высоких и низких тсмпераіур. Опасность температуры как фактора окружающей среды определяется, прежде всею, ее нестабильностью. В неблаюприятных природных условиях устойчивость и продуктивность растений определяются рядом признаков, и защитно-приспособигельными реакциями.
Растения не могут изменять внутреннюю іемпературу своею оріанизма, и в процессе эволюции у них сформировались механизмы, обеспечивающие их функционирование при низких темперагурах окружающей среды. Многие из этих механизмов основаны на синіезе и накоплении защитных соединений, изменении осмотического потенциала клетки и др.
В 1973 году была предложена гипотеза, согласно которой первичная роль в способносіи растений к перенесению холода отводилась мембранным липидам, в частности, их свойств) фазовых переходов в зависимости от температуры окружающей среды (Lyons. 1973; Raison, 1973). При воздействии низких температур мембраны изменяют свою текучесть, становятся неспособными поддерживать ионные градиенты и клеточный метаболизм, что, в конце концов, приводит к гибели клеток и всеї о организма. Способность растительных клеток к адаптации в таких условиях связываегся с их способностью к изменению тек чести мембран посредством изменения количества ненасыщенных жирных кислот (ЖК) в мембранных липидах. Такой способ сохранения текучею состояния мембраны был обнаружен бактерий, растений и животных (White and Somero, 1982; Hazel, 1984) Исходя из этой гипотезы, важнейшая роль в устойчивое і и растений к низким температурам о і водится десат) разам жирных кислот - ферментам, отвечающим за образование двойных связей, и, следовательно, за изменение физических свойств биолої ичееких мембран.
Принципиально новью возможное і и для выяснения роли десатураз в механизмах холодоустойчивости открывают іенно-инженернью подходы, в частности, получение трансіенных растений, экспрессирующих гены десатураз из гетеролої ичных оріанизмов. В работах группы Мурата показана принципиальная возможность изменения холодоустойчивое!и путем введения в геном растения іенов десатураз. (Murata et al., 1992, Cossins, 1994). Наибольший интерес в этом аспекте представляют гены ацил-лииидных десатураз, формирующие первую (А9) и вторую (Д12) двойные связи в молекулах жирных кислот. Из подобных десатураз наиболее изученными являются десатуразы цианобактерий desC (Д9-десатураза) и desk (Д12-десатураза). Ранее были получены и исследованы трансі енные растения табака, экспрессирующие ген desC Д9-десатуразы, было установлено, что экспрессия этого ієна приводит к повышению холодо стойчивосги растений (Orlova et al., 2003).
Использование современных подходов имеет не только фундаментальный интерес, но и значительною практическою ценность в области биотехнологии и сельского хозяйства, поскольку позволяет создавать новые сорта ценных сельскохозяйственных культ р, способные переносить ограничения той или иной климатической зоны Одной из перспективных с этой точки зрения объектов является картофель - важная пищевая и техническая культ) ра, которая является источником не только }1.чеводов, но и качественных белков, минералов и витаминов. Несмотря на то, что картофель устойчив к низким положительным температурам, он может значительно повреждаться весенними заморозками.
Принципиальным моментом при проведении іенно-ииженерньїх работ является выбор эффективной репоріерной системы для определения ) ровня экспрессии исследуемых іенов и локализации их продуктов. Ранее была предложена новая система, основанная на использовании ієна hcB, кодирующего термостабильную лихеназ) Clostridium thermocellum (Pirwian et al, 2002). Эта репортерная система имеет ряд преимуществ, прежде всего позволяет осуществлять быстрый отбор трансіенных организмов, определять уровни экспрессии шбридных генов и молекулярные массы белковых продуктов гибридных І енов.
Цель исследования: Изучение экспрессии і енов desk и desC в клетках про- и эукариот {Ecoli и картофеля, Solarium tuberosum), определение жирнокислогною состава их лииидов, проверка холодоустойчивости полученных растений-регенерантов, а также изучение возможности использования репортерной системы на основе іермостабильнои лихеназы (LicB) дія получения трансформации картофеля.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи: 1. Анализ нуклеотидной последовательности іенов desC и desk с целью оценки эффективности их экспрессии в клетках Е coli и Solanum tuberosum
2. Клонирование нативных и конструирование гибридных генов desC и desk.
3. Конструирование бактериальных эксирессионных векторов в двух системах pQE и рЕ Г
4. Изучение экспрессии генов десатураз в Ecoli и состава жирных кислот бактериальных трансформантов.
5. Констр ирование растительных эксирессионных векторов, несущих нативные и гибридные гены десат раз.
6. Получение трансформированных растений картофеля и их
молекулярный и физиолого-биохимическии анализ.
Научная новизна рабо і ы. Впервые для оценки экспрессии іенов desC и desk в клетках про- и эукариот использована репортсрная система на основе лихсназы (ЫсВМЗ). Установлено, что в составе іибридньїх белков как лихеназная, так и десагуразная активность сохраняеіся. Впервые получены трансформанты картофеля, экспрессирующие ген ацил-липидной А12-десатуразы. Показано, что экспрессия гетеролої ичных іенов десатураз в растениях приводит к повышению уровня ненасыщенности жирных кислот (ЖК) мембранных липидов.
Апробация рез)льтаіов работы. Рез льтаты работы были представлены
th
на Седьмой международной конференции по Геномике рас гений, Китай, 2006 (7 International Conference of Plant Genomics, Harbin, China, 2006); 15-м Международном конгрессе FSEPB, Франция, 2006 (International 15th Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology FSEPB, Lyon, France, 2006); 43-м Годичном съезде общества Криобиологов, Германия, 2006 (43th annual meeting of the Society for Cryobiology and Society ior Low temperature Biology, Hamburg, Germany,2006); 24-м Годичном собрании ESCPB, Бельгия, 2006 (24th Annual Meeting of ESCPB "Stress in S)stems Biology", Antwerp, Belgium, 2006); Международной конференции Тенеіико-физиологические основы регуляции роста и продуктивности растении, Лаівия, 2006 (International Scientific Conference "Genetic-Physiological fundamentals of Plant Growth and Productivity "Designed to the 100th anniversan, of Prof. Jonas DAGjs Vilnius, Lithuania, 2006); Годичном Собрании Общества Физиологов Растений России, Ростов-на-Дону„ 2006); Международной конференции "Генетика микрооріаничмов и биотехнология", посвященной 100-легию со дня рождения С. И Алиханяна, Пущино, Москва, 2006; Международной конференции "Генетика в России и мир", посвященной 40-летию Института общей іенетики им. П.И. Вавилова РАИ, Москва, 2006).
Свойства биологических мембран и их зависимость от температуры
Биолої ическиая мембрана состоит из бислоя липидных молекул, которые повернуты друг к др) тидрофобными концами. Молекулы жестко не закреплены и постоянно меняются местами в пределах одного монослоя или путем перестановки двух липидных молекул из разных монослоев (Чиркова, 1997). При нормальной температуре и оптимальной концентрации веществ в окружающей среде (осмотическом давлении) мембрана представляет собой жидко кристаллическую структуру, обладающую определенной степенью текучести.
Термин "іекучесть» (противоположный "вязкости") используется ДІЯ описания степени неупорядоченности и физической подвижности внутри липидної о бислоя мембран (Лось, 2001).
В жидком кристалле за счеі теплового движения возможны структурные переходы: «хвосты» молекулы и вгибаются, их параллельность друг другу в отдельных местах нарушается, особенно сильно в середине мембраны. В связи с этим толщина мембраны в і ель-фазе больше, чем в жидком кристалле. Однако при переходе из івердою в жидко-кристаллическое состояние, объем несколько увеличивается, так как значительно увеличивается площадь мембраны, приходящаяся на одну молекулу (о і 0.48 нм2 до 0.58 им2 - в примере на рисунке 1.1) (Антонов, 1996).
Хорошо известно, что как прокариоты, так и эукариоты могут нормально существовать лишь при жидкокристаллическом состоянии лииидных мембран. Адаптация бактерий (Cronan, 1975; Fulco, 1972), дрожжей (Watson), грибов (Miller and Barran), высших растений (Mazliak, 1979) при температуре ниже нормальной происходит в результате изменения качесівенною и количественного состава ЖК Температура фазовою перехода [ТфП] зависит от количества двойных связей в ЖК, длины уїлеводородньїх цепей ЖК, наличия и положения цис-лиленовой связи, введения боковых мегильных групп в углеводородные цепи липидных молекул (Шведова, 2004). В зависимости о г химическою состава липидных мембран іемпература фазового перехода і ель-жидкий кристалл может меняться от -20С (для мембран ненасыщенных липидов) до т60сС (дія насыщенных липидов) (Антонов, 1996) Существенно влияют на іемиературу фазовою перехода также различия в строении полярных
юловок. Особое вчияние на текучести мембраны оказывает жесткое четырехчленное кольцо стеринов мембран (у животных - холестерина, у растений - сито-, стигма- и кампестерина), пониженное в линидный бислой. У эукариогических клеток при температуре 37С стерины снижают степень тек чести мембраны, а при более низких температурах они, наоборот, способствуют поддержанию их іекучссіи, ирспяісгв}я слипанию уїлеводородньїх цепей (Kate, Pugh and Ferrante, 1975,1983; Комов и Шведова., 2004) (рис. 1.2).
При снижении температуры, молекулы жирных кислот приближаюіся друг к друг} . По с}ти, это означаег сжатие мембраны, то есть уменьшение её текучести или увеличение вязкости. При определенных условиях может наступить критический момент, когда большая часть липидов потеряет свою подвижность настолько, что произойдеї фазовый переход из жидкокристаллическою состояния в состояние іеля. Если клетка не способна адаптировать свои мембраны и поддерживать их на определенном уровне текучести, го фазовый переход приводит к емері и клеіки (рис. 1.1). Главными причинами легальною исхода являются уменьшение подвижности белков в липидном бислое, их неспособность к изменению конформации и, как следствие - полная потеря их функций перенос электронов и веществ, синтез АТФ, транспорт ионов. Однако организм способен регулировать физические свойства своих мембран посредством изменения количества двойных связей в цепях жирных кислот мембранных липидов (Russel, 1994). Введение двойных связей в молекулы ос} ществляют специальные ферменты - десатуразы.
Десатуразы про-и эукариотических организмов
Специфичность десатурации является принципиальным моментом работы фермента и может быть рассмотрена с двух позиций: 1. Специфичность к положению жирной кислоты на глицериновой молекуле ( и-положение). 2. Специфичность узнавания позиции десагурации в углеродной цепи жирной кислоты.
Другими словами, вопрос состоит в том, каким образом фермент «считает» уїлеродньїе атомы и узнаег уже имеющиеся двойные связи для того, чтобы произвести реакцию десагурации. К этой же проблеме относится и вопрос об узнавании "конца" углеродной молекулы жирной кислоты, поскольку положение двойной связи можно отсчитывать как от карбоксильного конца молекулы (Д-положение), гак и от меіильной группы-места прикрепления к глицериновому основанию (со-по.южение).
Глицеролигшды характеризуются наличием двух жирных кислот в положениях sn-1 и sn-2 на глицериновой молекуле. Полярная гр)ина связывается в sn-З положении. Различные виды цианобакгерий способны десатурировать жирные кислоты в разных положениях. Таблица 1.3 суммирует данные литературы о способах десатурации жирных кислот в различных группах цианобактерий.
Для группы 1 характерно наличие жирной кислоты в положении sn-1 ("верхнее" положение на їлицерииопой молекуле). В позиции sn-2 может находиться 16:Г 9 кис.юіа, но юлько в МГДГ (моногалакгозилдиацилілицеринах) и ДГДГ (диіалакіозилдиацилглицеринах) В СХДГ (сульфохиновозилдиациоглицеринах) и ФГ (фосфаіидилілицеринах) мононенасыщенные жирные кислоты в положении sn-2 не встречаются. В цианобактериях МГДГ составляет около 50% от всех глицеролипидов, ДГДГ, СХДГ и ФГ дают до 10-20%, а ГлДГ не превышает 1%.
Цианобактерий ipjini 2 и 3 харакіериз ются специфическим расположением жирных кислот: С18 кислоты находятся всегда в sn-1 положении, а С16 - в положении sn-2. Группы 3 и 4 не имеют ненасыщенных жирных кислот в положении чп-2. Цианобактерий способны только к ацил-липидной десатурации - образованию двойных связей в углеродных цепях жирных кислот, уже соединенных с глицериновой основой, т.е. эти десатуразы работают на уже сформированном липиде. В отличие от десатураз цианобактерий, аналої ичные ферменты высших растении вводят первую двойною связь (в потожении \9) в жирною кислот} , прикрепленную не к глицерину, а к ацил-переносящем) белку (А11Б). Дальнейшая десатурация и у высших растений ос}ществляется на жирных кислотах, находящихся в составе липидов. Общим свойством десатураз и высших растений, и цианобактерий является их высочайшая специфичность к положению углеродых атомов, между которыми ли ферменты образуют двойную связь.
Достаточно подробно изучен процесс десатурации у цианобактерий синехоцистис Synechocystib sp. РСС 6803, принадлежащий к 4-й группе (см. табл.1.3). В группе М рага (Wada and Murata, 1989; Higashi and Murata, 1993) изучали специфику образования двойной связей в жирных кислотах этою организма. Добавляя в среду роста іептановую кислоту (С7:0) либо гексановую кислоту (С6:0), исследователи прослеживали иуіи удлинения углеродной цепи жирных кислот и определяли положения, в которых образуются двойные связи. Было доказано, что добавление С6.0 не влияет на жирно-кислотный состав цианобактерий. Добавление С7:0 приводит к синтез} С15, С17 и С19 жирных кислот со всеми их производными: 15.0, 15:1s9, 17:0, 17:1s4, 17:2Л69, 17:2 s9 12 17:3 ад, 17:3 i9 12 14 и 17:4Л69 1214, а также 19:0, 19:ГЛ9, 19:2 д69, 19:2 д9 12, 19:3 л6 9,12, 17:3А9 12 16 и i9-4W9,12 16. Из этих работ следует, что четвёртая двойная связь образуется в (о-положении, i.e. отсчет положения десатурации происходит от места прикрепления ЖК к глицериновом) основанию - от метальної о конца молекулы. В связи с этим Д15-десат раза была переименована в о)3-десатуразу (Higashi, Murata, 1993).
По механизм) действия десат)разы высших растений подразделяются на ацил-АПБ- и ацил-липидные десат разы, отличающиеся между собой но структуре и свойствам.
Ацил-АПБ-десат)ранл присутствуют в пластидах растений и вводят первую двойную связь в жирные кислоты связанные с АПБ. Предполагается что каждая Ацил-АПБ-десатураза имеет 2 атома железа для формирования Fe-0-Fe активного комплекса. Показано, что в клсіках растений присутствует несколько форм Д9-десатуразы. Один из этих ферментов специфичен к стеариновой, а другой - к пальмитиновой кислоте, связанной с АПБ (рис. 1.5).
В результате десатурации сіеариновая кислота превращается в олеиновую кислоту, связанную с АПБ. Реакция катализируется стеароил-АПБ десагуразой (Д9 acyl-ACP desaturase) в сіромах хлоропластов (или друїих пластид). Принято считать, что образование олеиновой кислоты (18:1л9) происходит только в строме хлоропластов. Олеиновая кислота, связанная с АПБ, можег транспортироваться в мембраны как хлорои іастов, так и ЭР для последующей десатурации в липид-евязанной форме (рис. 1.5).
Конструирование прокариотических экспрессионных векторов
В качестве объекта исследования были выбраны іеньї desC и desA, которые кодируют Д9- и Д12-десатурап.і жирных кислот с молекулярной массой 37.2 и 40.5 кДа, соответственно.
Известно, что эффективность экспрессии іетеролоіичіндх генов в клетках-реципиентах зависиі or мноіих факторов и, прежде всею, от иуклеотидної о состава экспрессируемою гена. Необходимыми условиями успешной реализации гетеролої ичнои генетической информации являє гея соответствие частот использования кодонов экспрессируемою гена и гетеролої ичного организма, а также отсутствие в нуклеотидных последовательностях вводимою гена областей, которые могуг быть узнаны клеточными компонентами оріанизма-реципиенга как интроны, области полиаденилирования и другие (Патрушев, 2000). Известно, что во время элонгации растущих полипеитидных цепей в процессе трансляции не все участки мРНК транслируются с одинаковой скорое і ью. Прежде всего, рибосомы во время трансляции мРНК моїуг задерживаться на кодонах, сооїветствуюіцих минорным изоакцепторным тРНК, присутствующими в клетке. В эгом случае внутриклеїочная концентрация изоакцепторных тРНК лимитирует весь процесс трансляции. Кодоны, соответствующие изоакцепторным гРПК, А.С. Спирин предлаїает называть модулирующими, поскольку они могуг изменять скорость трансляции соответствующих мРНК. Чем больше модулирующих кодонов в мРНК, тем медленнее она транслируется.
Таким образом, первым лапом работы было проведение анализа нуклеотидных последовательностей іенов desC и desk. Подобный анализ позволяет установить, насколько кодоновыи состав последовательности гена desC и desA соответствует частотам использования кодонов у модельных организмов -прокариотическої о (. coli) и э}кариотическою (растения) происхождения. На основе полученных результаюв делается вывод, нуждается ли нуклеотидная последовательность іенов десагураз в модификациях для эффективной экспрессии в клеіках модельных оріанизмов.
Анализ н) клеотиднои последоваїельности іенов desC и desA проводили с использованием компьютерных программ и баз данных: GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html - поиск нитронов, поли А-сигналов); Database (hup ://w\vw. kazusa.or.jp/codon/ - поиск codon usage; http://gcua.schoedl.de/; http:/www.kazusa.or.jp/codon/countcodon - countcodon program). Для выравнивания нуклеотидных и аминокислошых последовательностей применяли программу Blastn Blastp (http://ww\\.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS l/).
Сравнительный анализ встречаемости кодонов у Е coli, Synechocystis, Solanum tuberosum и генов десатураз нианобакіерий позволил заключить, чго нуклеотидная последовательность ієна Д9-десагуразы содержит 0.4% редких кодонов относительно Е coli и Synechocystis, и не содержит редких кодонов относительно Solanum tuberosum (рис. 3.1, 3.2, 3.5 а). Ген Д12-десатуразы содержит 2.3% редких кодонов оіносигельно Е coli, и не содержит редких кодонов относительно Solanum tuberosum (рис. 3.3, 3.4, 3.5 б) Известно, что клетки живых организмов мог)т изменять )ффективность трансляции определенных мРНК путем адаптации вн греклеточных концентрации изоакцепюриых тРНК к числу модулирующих кодонов этих мРНК. потребностям белоксинтезир ющего аппарата клеток, осуществляющего трансляцию мРНК фиброина (Патр шев, 2000).
На основании проведенною анализа можно предположить, что і ЄРІ Д9-десатуразы должен эффективно экспрессироваться как в клетках Е coli, так и в Solatium tuberosum. В то же время, ієн Д12-десагуразы должен эффективно экспрессироваться в Solanum tuberosum, но можно предположить, чю уровень его экспрессии в бакіериях б деі ниже.
Помимо этою, анализ іранскрипюв генов десаі раз не выявил в их последовательности возможных обіасгей для альтернативною сплайсинга в эукариотических клеіках.
Поскольку большинство продуктов клонированных генов либо не имеют ферментативной акгивности, либо их ферментативную активность можно определить, исиольз)я сложные методы исследования, в работах Э.С.Пирузян (Piruzian et al., 2002) был предложен новый подход для экспрессии целевых іенов в модельных оріанизмах Как было отмечено в обзоре литературы, этот подход основан иа конструировании и экспрессии і ибридиых і енов, в которых целевой і єн имеет трансляционное слияние с последовательноеіью репортерною гена, кодирующеі о термостабильн) ю лихеназу.
Изучение действия введенного гена Д9-ацил-липидной десатуразы на рост бактериальных трансформантах, несущих плазмиды с нативньш desC и гибридным desC-ІісВМЗ генами
Известно, что увеличение количества ди- и триеновых ЖК является результатом активности Д12- и соЗ-десатураз картофеля, которые используют в качестве субстратов ацильные остатки моно- и диненасыщенных ЖК и вводят, соответственно, вторую и третью двойную связь в молекулу жирной кислоты. Поскольку введение второй двойной связи в цепь ЖК является необходимым условием ее дальнейшего десатурирования, то именно Д12-десатураза позволяет преодолеть один из лимитирующих этапов, который необходим для выживания клеток при низких температурах. В этой связи было интересно исследовать физиологические характеристики трансформированных растений-регенерантов, которые характеризуют устойчивость растений к стрессовым факторам.
Как известно, иерекисное окисление липидов (ПОЛ) приводит к частичному разрушению, прежде всего, полиненасыщенных ЖК, изменяя тем самым физико-химические свойства мембран (Tasaka Y., 1996). Одной из самых ранних неспецифических реакций клетки на неблагоприятные воздействия окружающей среды, в том числе на низкотемпературный стресс, является развитие окислительного стресса. Последний инициируется активными формами кислорода (АФК) и может приводить к интенсификации перекисного окисления ненасыщенных ЖК липидов мембран и к увеличению содержания в тканях одного из его конечных продуктов — малонового диальдеіида (МДА) (Барабой В.А., 1991; Scandalios J.G., 1993). Таким образом, содержание МДА служит показателем активности окислительных процессов, обусловленных АФК, которые взаимодействуют с ненасыщенными жирными кислотами, вызывая усиление иерекисною окисления липидов (ПОЛ) в илазмалемме и клеточных органеллах. Поэтому для оценки степени холодостойкости трансформированных растений картофеля был использован метод определения интенсивности ПОЛ по содержанию МДА.
Известно, что К)льт)рные сорта картофеля вида Solarium tuberosum L. относятся к холодостойким растениям и моїут переносить температуру до -4С (Seppanen et al., 1998). Поэтому для выявления различий в показателях холодостойкости межд конгрольными растениями и различными линиями трансформантов картофеля мы применили жесткий (-7"С), но кратковременный (30 мин) режим охлаждения. Мы основывались также на факте, что реакции ПОЛ протекают по цепному, свободнорадикальному механизму и их продукты можно обнаружить уже через 0.5 ч.
Из данных, приведенных на рисунке 3.14, видно, что в результаїе переохлаждения (выдерживания растений при температ ре -7"С в течение 30 мин) содержание МДА в іканях контрольных расіений возрастает, а сп сія 1 ч после возврата растений в условия с нормальной темнераіурой (22С) оно на 25% превышает таковое в контроле (неохлаждаемый вариант). В отношении исследуемых трансформантов картофеля следует отметить, что даже до охлаждения (22С) уровень МДА во всех случаях был почти в 1.5 раза ниже, чем в контрольных растениях. 22 С После 30 мин После 30 мин при -7С и охлаждения при -7С 60 мин при 22С
После искусственного переохлаждения в тканях трансформантов линий 1 и 2, в отличие от контрольных растений, увеличения содержания МДА не наблюдается, а у двух других линий (3 и 4) этот показатель даже уменьшается на 30 и 25%, соответственно (табл. 3.7). Последующий перенос растений-трансформантов в оптимальные условия выращивания (22С) и выдерживание их в течение 1 ч не приводит к изменению содержания МДА в их тканях, и оно остается на исходном уровне.
Таким образом, определение интенсивности ПОЛ в тканях полученных трансформантов картофеля выявило их повышенную по сравнению с контролем устойчивость к окислительному стрессу, вызванному переохлаждением. В то же время усиление накопления продуктов ПОЛ в тканях конгрольных растений картофеля при снижении температуры среды свидеіельствует о серьезных повреждениях их мембранных структур.
Известно, что понижение температуры окружающей среды, увеличивая проницаемость клеточных мембран, главным образом, плазмалеммы, вызывает интенсивный выход ионов из клеток, который легко регистрируется в виде резкого увеличения скорости течки растворенных веществ из тканей растений после их инфильтрации водой. Этот метод позволяет выявить нарушение структуры клеточных мембран при охлаждении. Показано, чго выход ионов зависит от температуры охлаждения и продолжительности ее действия (Wright, Simon, 1973).
Анализ полученных результатов показал, что при оптимальной температуре выращивания 22С (без охлаждения) контрольные и трансформированые растения, по индексу повреждения значительно отличались (рис. 3.15) Для всех трансформантов, за исключением линии 2, был отмечен более слабый выход электролитов из тканей. Индекс повреждения у линий 1, 3 и 4 был на 32.7%, 41.2% и 41.2 % ниже, чем в контроле. Линия 2 практически не отличалась по этому показателю от контроля при выращивании в оптимальной температуре. Эти результаты свидетельствуют об активности продукта ієна desk даже при оптимальной температуре.
Охлаждение увеличило проницаемое і ь мембран всех вариантов. Причем наибольшая степень повреждения наблюдалась у растений контрольного варианта: индекс повреждения оказался на 51.7% выше по сравнению с неохлаждаемым вариантом. Индекс повреждения в трансформированных линиях (линии 1, 2, 3 и 4, соответственно) уменьшался на 36.5%, 46.5%, 31% и 56%, по сравнению с контрольными охлажденными растениями (табл. 3 8).
