Содержание к диссертации
Список условных сокращений 6
Введение 8
Обзор литературы
1. Цитокинины
1.1 Химическая структура цитокининов И
1.2 Функциональная активность цитокининов 15
1.3 Действие цитокининов на ткани и органы растения • 16
1.4 Действие цитокининов на клеточном уровне 22
2. Метаболизм цитокининов
2.1 Изопентенилтрансферазы 25
2.2 Синтез трсшс-зеатина 31
2.3 Активация цитокининов 32
2.4 Инактивация цитокининов. Образование конъюгатов 33
2.5 Катаболизм цитокининов. Цитокининоксидазы
3. Транспорт цитокининов 38
4. Передача цитокининового сигнала
4.1 Двухкомпонентные системы передачи сигнала 40
4.2 Рецепторы цитокининов 44
4.3 Трансдукция сигнала
4.3.1 Факторы-фосфотрансмиттеры. 55
4.3.2 Регуляторы ответа В-типа 57
4.3.3 Транскрипционные факторы CRF 61
4.4 Гены первичного ответа на цитокинин
4.4.1 Регуляторы ответа А-типа 61
4.4.2 Другие гены первичного ответа на цитокинин 65
4.5 Возможное участие эукариотических компонентов в передаче сигнала цитокинина
4.5.1 Фосфолипазы С и D 66
4.5.2 Участие кальция в передаче сигнала 67
4.5.3 Участие N0 в передаче сигнала 68
5. Теоретические основы изучения гормон-рецепторного взаимодействия
5.1 Теоретические основы определения аффинности и концентрации рецепторов
5.2 Радиолигандный метод 73
5.3 Взаимодействие нескольких лигандов с одним сайтом. Конкурентное связывание 76
5.4 Более сложные варианты взаимодействия гормона с рецепторами 82
Материалы и методы
1. Реактивы 86
2. Модельные системы
2.1 Модельные системы на основе Е. coli 86
2.2 Модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса 88
2.3 Модельная система на основе амаранта 90
2.4 Модельная система на основе кукурузы 91
3. Радиолигандный метод
3.1 Метод анализа связывания гормона с живыми клетками 91
3.2 Метод анализа связывания гормона с мембранами растительных клеток
4. Анализ состава цитокининов методом тонкослойной хроматографии 93
5. Анализ активности репортерных генов
5.1 Анализ активности (3-глюкуронидазы (GUS) флюориметрическим способом 94
5.2 Анализ активности галактозидазы (LacZ) флюориметрическим способом 94
5.3 Анализ активности галактозидазы (LacZ) в колониях трансгенных бактерий после индукции цитокининами 95
6. Выделение мембран растительных клеток
6.1 Выделение микросомальной фракции для анализа активности фосфолипаз D 95
6.2 Выделение мембран растительных клеток в водной двухфазной системе
6.3 Определение активности маркерных ферментов растительных мембран
6. 3.1 Определение активности ІҐ-А ТФазы плазмалеммы 97
6.3.2 Определение активности антимщин А-нечувствительной NAD(P)H-зависимой цитохром с редуктазы (маркер эндоплазматического ретикулума) 97
6.3.3 Определение активности пирофосфатазы (маркера вакуоли) 7. Вестерн-блотинг 98
8. Нозерн-блотинг 99
9. Выделение ДНК из растений
9.1 Метод Dellaporta et al., 1983 100
9.2 СТАВ-метод 101
10. Выделение РНК из растений
10.1 Выделение РНК с TRIzol-ом Ю2
11. Анализ инсерционных мутантов с помощью PCR Ю2
12. Биотест по влиянию цитокининов на рост корней Ю4
13. Фармакологический анализ
13.1 Эксперименты с арабидопсисом Ю5
13.2 Эксперименты с амарантом Ю5
14. Анализ активности различных типов фосфолипаз D in vitro
14.1 Анализ активности PLD 106
14.2 Анализ активности PLDp1 и у 106
14.3 Анализ активности PLD6 Ю7
Результаты и обсуждение
1. Лиганд-связывающие свойства рецепторов цитокининов
1.1 Способность различных цитокининов активировать ген cpsv.LacZ в Е. соН, экспрессирующей рецепторы ZmHKl nZmHK2 108
1.2 Алгоритм исследований по изучению лиганд-связыващих свойств рецепторов 109
1.3 Лигандная специфичность рецепторов арабидопсиса AHK4/CRE1, АНКЗ, АНК2
1.3.1 Специфичность связывания транс-зеатииа рецепторами AHK4/CRE1 и
АНКЗ 114
1.3.2 Связывание цитокинина CHASE-доменами рецепторов АНК2, АНКЗ и
AHK4/CRE1 114
1.3.3 Константы диссоциации комплексов рецепторов AHK4/CRE1, АНКЗ и
CHASE-доменов АНК2 и AHK4/CRE1 с транс-зеатином 116
1.3.4 Лигандная специфичность связывания рецепторов AHK4/CRE1, АНКЗ и
CHASE-доменов АНК2 и AHK4/CREI с различным цитокининами,
кажущиеся константы связывания 128
1.3.5 Определение сайта связывания тидиазурона 123
1.4 Лиганд-связывающие свойства рецепторов кукурузы ZmHKl, ZmHK2, ZmHK3a
1.4.1 Константы диссоциации рецепторов ZmHKl, ZmHK2, ZmHK3a для транс-зеатина 123
1.4.2 Лигандная специфичность связывания рецепторов ZmHKl, ZmHK2, ZmHK3a, кажущиеся константы связывания
1 1.5 Оценка возможности меболических превращений цитокининов в ходе 128
1.6 Влияние некоторых физико-химических факторов на лиганд-связывающие свойства рецепторов цитокининов
1.6.1 Влияние температуры на связывание транс-зеатина рецепторами AHK4/CRE1 и АНКЗ 130
1.6.2 Влияние солей одновалентных и двухвалентных катионов на связывание 131
1.6.3 Влияние рН среды инкубации на связывание меченого транс-зеатнна и
лигандную специфичность связывания 135
1.7 Способность различных цитокининов активировать экспрессию гена первичного ответа ARR5 в проростках двойных мутантов арабидопсиса по рецепторам цитокининов 137
2. Субклеточная локализация рецепторов цитокининов
2.1 Анализ связывания меченого цитокинина с различными мембранными фракциями мутанта арабидопсиса ahk2-5 crel-2 140
2.2 рН-зависимость связывания меченого цитокинина мембранными фракциями кукурузы 142
2.3 Лигандная специфичность связывания цитокининов с различными t мембранными фракциями кукурузы 145
3. Исследование влияния некоторых компонентов различных сигнальных путей на ранние эффекты цитокининов
3.1 Возможное участие оксида азота 148
3.2 Возможное участие фосфолипаз D и С
3.2.1 Действие ингибиторов фосфолипазы D, первичных спиртов и LPE/LPI 151
3.2.2 Влияние цитокинина на активность различных типов фосфолипаз D (PLD) 153
3.2.3 Мутанты по фосфолипазам D 155
3.2.4 Возможное участие фосфолипазы С 156
4. Общее обсуждение 157
Выводы 169
Список цитируемой литературы 171
Благодарности 196
Введение к работе
Анализ механизмов рецепции и трансдукции гормональных сигналов является важным и актуальным направлением исследований гормональной регуляции высших организмов, в том числе растений. Среди фитогормонов особое значение имеют цитокинины, которые регулируют метаболизм и деление клеток, а также рост, морфогенез и старение растений. Цитокинины представлены in vivo рядом соединений близкой структуры, но с разной биологической активностью. Для этого класса фитогормонов в последние годы идентифицированы мембранные рецепторы, гены первичного ответа, основные элементы сигнальной трансдукции и ферменты биосинтеза (обзоры см. Романов, 2002; Heyl & Schmulling, 2003; Sakakibara, 2006). Однако многие аспекты молекулярного механизма действия цитокининов еще. малоизучены и продолжают активно исследоваться.
Основными повсеместно распространенными цитокининами являются производные аденина: транс-зеатин, изопентениладенин, дигидрозеатин и их дериваты (Мок & Мок, 2001). Общепризнано, что основным местом их образования является корень, но они могут также синтезироваться и в других частях растения, в основном в зонах деления клеток. При этом транс-зеагин синтезируется в основном в корне (Takei et al., 20046), а изопентениладенин - большей частью в побеге (Miyawaki et al., 2004; Takei et al., 2004a). Также цитокинины по-разному транспортируются по растению: транс-зеатиновые в основном перемещаются по ксилеме, а изопентенильные - по флоэме (Hirose et al., 2008). Таким образом, в различных органах растения присутствуют различные типы (наборы) цитокининов. Это позволяет думать, что отдельные формы цитокининов выполняют неравнозначные физиологические функции в растении. В связи с этим остро встаёт вопрос о лигандной специфичности и других свойствах рецепторов цитокининов.
У всех изученных растений рецепторы цитокининов представляют собой семейство близкородственных белков - мембранных гистидинкиназ, подобных сенсорным гистидинкиназам одноклеточных организмов. Показано, что эти рецепторы могут иметь различное физиологическое значение in planta (Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004; Riefler et al., 2006).
До начала наших исследований лигандную специфичность рецепторов изучали полуколичественными методами, по индукции репортерного гена (Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2001; Spichal et al., 2004 и др.). При этом прямых количественных исследований с помощью радиолигандного метода практически не было, видимо, по причине сложности и трудоемкости получения очищенных мембран, сохраняющих функционально-активные рецепторы. До сих пор был исследован только один рецептор цитокининов арабидопсиса AHK4/CRE1, при этом с очень ограниченным набором цитокининов (Yamada et al., 2001). Таким образом, к началу наших исследований лиганд-связывающие свойства рецепторов цитокининов были изучены явно недостаточно.
Также важным фактором реализации действия рецепторов в растении является-их субклеточная локализация. Однако эти аспекты системы восприятия цитокининового сигнала клеткой оставались до последнего времени были также практически не изучены. Что касается других гормонов растений, то для них такие данные были получены в самые последние годы. Было показано, что рецепторы ауксинов и гиббереллинов являются растворимыми белками и находятся, по всей видимости, в ядре (Kepinski et al., 2005; Dharmasiri et al., 2005; Ueguchianaka et al., 2005; Nakajima et al., 2006; Griffiths et al., 2007), рецепторы этилена локализуются і на мембранах эндоплазматическом ретикулума (Chen et al., 2002; Ma et al., 2006), а рецепторы брассиностероидов - как на плазмалемме, так и на эндосомах (Geldner et al., 2007). Что касается абсцизовой кислоты, то она обладает как растворимыми внутриклеточными рецепторами (Razem et al., 2006; Shen et al., 2006), так и рецептором-трансмембранным белком, находящимся на плазмалемме (Liu. et al., 2007). Информация о локализации цитокининовых рецепторов» скудна и основана либо на биоинформатических оценках (Inoue et al., 2001), либо на единичных косвенных данных (Kim et al., 2006). При этом предполагалось, что цитокининовые рецепторы локализуются на плазмалемме. Однако, исходя из вышеприведенных данных для других рецепторов фитогормонов, нельзя было исключить, что рецепторы цитокининов локализуются на различных типах мембран клеток растений.
Ещё одной важной проблемой механизма действия цитокинина является внутриклеточное поведение гормонального сигнала до первичных молекулярных мишеней. В настоящее время общепринято, что основным путём передачи сигнала являются белки так называемой двухкомпонентной системы бактериального типа (Kakimoto, 2003). Однако имеются данные о том, что в передаче цитокининового сигнала участвуют также оксид азота (Scherer et al., 2000) и фосфолипаза D (Romanov et al., 2002; 2003). Поэтому вопрос об участии элементов истинно эукариотического сигналинга во внутриклеточной трансдукции сигнала цитокининов является актуальным.
Главной целью данной работы было изучить лиганд-связывающие свойства индивидуальных рецепторов цитокининов у разных видов растений и субклеточную локализацию рецепторных белков.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- изучить лиганд-связывающие свойства индивидуальных цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы, клонированных в Е. coli, с помощью радиолигандного метода;
- выяснить, как установленные свойства рецепторов проявляются при передаче цитокининового сигнала на гены первичного ответа in planta;
- исследовать субклеточную локализацию рецепторов в органах растений.
Дополнительно была проверена возможность участия оксида азота и фосфолипаз во внутриклеточной трансдукции цитокининового сигнала до генов первичного ответа.
