Введение к работе
Актуальность темы. Изучение лиганд-рецепторных взаимодействий является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии и биофизики. Эти взаимодействия играют центральную роль во многих процессах, таких как гормональная регуляция, межклеточная сигнализация, транспорт биомолекул, передача нервного импульса и др.
Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) представляет собой лиганд-зависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов, и является одним из наиболее распространенных рецепторов центральной и периферической нервных систем млекопитающих. В зависимости от локализации рецепторы семейства нАХР подразделяются на два больших класса: мышечные и нейрональные. а-Нейротоксины яда змей известны как высокоспецифичные конкурентные ингибиторы нАХР. Эти белки имеют характерную «трех-петельную» Р-структуру, стабилизированную 4-5 дисульфидными связями. Небольшие размеры и жесткая структура делают а-нейротоксины удобными инструментами для исследования свойств нАХР. Со структурной точки зрения а-нейротоксины из яда змей можно подразделить на 3 класса: короткие, длинные и «необычные» нейротоксины (Рис.1). Короткие и длинные а-нейротоксины эффективно ингибируют нАХР мышечного типа, однако только длинные а-нейротоксины с пятой дисульфидной связью в центральной петле эффективно взаимодействуют с нАХР нейронального типа. Мишенями действия «необычных» токсинов с пятой дисульфидной связью, локализованной в N-концевой петле, выступают как мышечные нАХР, так и нейрональные нАХР, а также мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, относящиеся к семейству G-белок сопряженных рецепторов.
Изучение механизмов, лежащих в основе взаимодействия а-нейротоксин/нАХР, представляет интерес не только с фундаментальной точки зрения, но и необходимо для создания новых лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний нервной системы, связанных с дисфункциями нАХР.
Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось получение методами генной и белковой инженерии а-нейротоксинов длинного и «необычного» типов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов, а также выявление структурных детерминант, важных для взаимодействия этих токсинов с различными подтипами нАХР.
Основные задачи исследования.
Получить гены химерных длинных а-нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII) путем введения в последовательность NTII дополнительных аминокислотных остатков, и «слабого» токсина из яда Naja kaouthia (WTX, weak toxin), относящегося к классу «необычных» токсинов.
Разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантных а-нейротоксинов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов. Наработать рекомбинантные а-нейротоксины, их мутантные и изотопно-меченые варианты в необходимых для исследования количествах. Провести физико-химический анализ рекомбинантных белков.
Исследовать биологические свойства химерных длинных а-нейротоксинов. Изучить специфичность химерных длинных а-нейротоксинов по отношению к нейрональным нАХР а7 и аЗ|32 типов.
Исследовать биологическую активность рекомбинантного WTX и его мутантных вариантов по отношению к мышечному и нейрональному нАХР а7 типа. Идентифицировать аминокислотные остатки мутантных вариантов WTX, которые важны для взаимодействия с различными типами нАХР.
Исследовать влияние конформационной гетерогенности в молекуле WTX на функциональную активность.
Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые. 1. На примере химерных длинных а-нейротоксинов впервые исследовано влияние
точечной мутации Ala/Lys в центральной петле длинных а-нейротоксинов на
взаимодействие с нейрональным нАХР аЗ|32 типа.
Впервые разработана эффективная система продукции «слабого» токсина из яда Naja kaouthia. Впервые разработаны протоколы выделения и очистки рекомбинантного WTX.
Впервые получены мутантные формы WTX, выявлены аминокислотные остатки токсина, важные для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального типов.
Впервые получен N-меченный WTX и проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах токсина.
Впервые изучено влияние точечных мутаций WTX на конформационную гетерогенность молекулы токсина.
Данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, будут интересны не только с точки зрения фундаментальной науки, но, в перспективе, также могут быть применены для разработки лекарственных препаратов, имитирующих свойства лигандов нАХР.
Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: Симпозиуме "Нейрорецепторы: Структура, механизм действия и роль в патологиях." (Москва 2007); 37-й Ежегодной конференции общества нейробиологов, (Сан Диего, США 2007); 4-й Конференции, международном симпозиуме и летней школе "ЯМР в биологии," (Санкт-петербург 2007); 15-й Международной конференция "Новые информационные технологии в медицине, фармакологии, биологии и экологии" (Гурзуф, Украина 2007); 20-й Зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва 2008); 4-м Ежегодном саммите по инженерии белков (Бостон, США. 2008); 33-м Конгрессе европейских биохимических обществ "Биохимия клеточной регуляции" (Афины, Греция 2008); 4-й Конференции европейского общества нейробиологов "Успехи изучения молекулярных механизмов нейрологических заболеваний" (Лейпциг, Германия 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 3 статьи в реферируемых научных журналах, включенных в список ВАК и 9 тезисов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 5 таблиц и 24 рисунка. Список литературы содержит 173 наименования.
