Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Повреждающее действие солей 8
1.2 Влияние засоления на рост растений 11
1.3 Пути поступления натрия и хлорида в клетку 15
1.3.1 Са-зависимый путь поступления натрия 17
1.3.1.1. SOS-путь трансдукции сигнала, регулирующий Na+-, К+-гомеостаз 19
1.3.2 Са-независимый путь транспорта натрия 20
1.3.3 «Обходной» путь транспорта натрия 22
1.3.4 Белки плазматической мембраны, участвующие в транспорте хлорида 23
1.4 Роль натрия и хлорида в минеральном питании растений 25
1.5 Пути адаптации растений к условиям засоления 29
1.5.1 Клеточные механизмы адаптации 29
1.5.1.1 Механизмы ионного гомеостатировашш цитоплазмы 30
1.5.1.1.1 Системы экспорта ионов натрия из цитоплазмы 30
1.5.1.1.2 Вакуолярная компартментация ионов натрия 34
1.5.1.1.3 Системы экспорта хлорид-ионов, локализованные в плазматичес- 36 кой мембране и тонопласте
1.5.1.1.4 Методы оценки компартментации ионов 36
1.5.1.2 Синтез осмолитов и защитных соединений 39
1.5.2 Механизмы адаптации на уровне целого растения 43
Глава 2. Материалы и методы 49
2.1 Подготовка растительного материала к эксперименту 49
2.2 Выделение полимерного матрикса клеточных стенок 49
2.3 Микроскопическое исследование клеточной стенки 51
2.4 Определение качественного и количественного состава ионообменных групп полимерного матрикса клеточных стенок 51
2.4.1. Метод потенциометрического титрования
2.4.2 Определение содержания аминогрупп в полимерном матриксе клеточных стенок методом неводного титрования в уксусной кислоте 56
2.5 Определение ионообменной способности клеточных стенок при разной концентрации хлористого натрия в растворе 57
2.6 Определение содержания воды в интактных тканях растений и весового коэффициента набухания полимерного матрикса клеточных стенок в воде и растворах 57
2.7 Элементный анализ 58
2.8 Определение эндогенного содержания ионов в растительных тканях 58
2.8.1 Определение хлорида 58
2.8.2 Комплексометрический метод определение кальция и магния 59
2.8.2.1 Определение кальция 59
2.8.2.2 Определение магния 60
2.9 Определение содержания пролина 60
2.10 Количественное определение белковых фракций 61
2.10.1 Получение водорастворимой фракции белков 61
2.10.2 Получение фракции белков, растворимых в щелочи 62
2.10.3 Получение спирторастворимой фракции белков 62
2.11 Определение белка методом Лоури 62
Глава 3. Результаты 64
3.1 Эндогенное содержание ионов в органах растений галофита и гликофита в зависимости от уровня засоления 64
3.1.1 Влияние засоления на содержание ионов в тканях сведы 64
3.1.2 Содержание ионов в тканях шпината в зависимости от концентрации NaCl в среде
3.1.3 Содержание белка, пролина и общего азота в органах галофита 68
3.1.4 Содержание белка, пролина и общего азота в тканях гликофита 72
3.1.5 Оводненность тканей галофита и гликофита 72
3.2 Количественный и качественный состав ионогенных групп полимерного матрикса клеточных стенок галофита и гликофита 75
3.2.1 Ионообменная способность полимерного матрикса галофита 75
3.2.2 Зависимость ионообменной способности полимерного матрикса клеточных стенок сведы от ионной силы внешнего раствора 82
3.2.3 Ионообменная способность полимерного матрикса гликофита 85
3.2.4 Влияние ионной силы внешнего раствора на ионообменную способность полимерного матрикса клеточных стенок шпината 91
3.3 Набухание клеточных стенок в воде 93
3.3.1. Набухание в воде полимерного матрикса клеточных стенок галофита 93
3.3.2. Набухание полимерного матрикса клеточных стенок гликофита 95
3.3.3. Влияние рН и ионной силы внешнего раствора на набухание полимерного матрикса клеточных стенок галофита 95
3.3.4. Зависимость набухания полимерного матрикса клеточных стенок гликофита от рН и ионной силы внешнего раствора 95
Глава 4 Обсуждение результатов 102
4.1 Эндогенное содержание ионов в тканях и их распределение между органами растений в зависимости от концентрации NaCl в среде 102
4.2 Исследование ионообменных свойств полимерного матрикса клеточных стенок галофита и гликофита 116
4.2.1 Ионогенные группы в полимерной структуре клеточных стенок 116
4.2.2 Набухание полимерного матрикса клеточных стенок 122
4.2.3. Поведение клеточных стенок при разных уровнях засоления внешней среды 128
Заключение 133
Выводы 136
Список литературы 138
Приложение 146
- Белки плазматической мембраны, участвующие в транспорте хлорида
- Определение качественного и количественного состава ионообменных групп полимерного матрикса клеточных стенок
- Зависимость ионообменной способности полимерного матрикса клеточных стенок сведы от ионной силы внешнего раствора
- Ионогенные группы в полимерной структуре клеточных стенок
Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение механизмов адаптации растительных организмов к неблагоприятным факторам окружающей среды, в том числе к одному из главных абиотических стрессоров, засолению, — одно из основных направлений физиологии растений. На клеточном и молекулярном уровне интенсивно изучаются процессы, связанные с ответными реакциями растений на действие солевого стресса: изменения в экспрессии генов, метаболизме, физиологических функциях и гомеостазе.
Известно, что высокие концентрации NaCI в среде вызывают осмотический стресс и ионный дисбаланс, ограничивая рост и продуктивность растений. Водный дефицит, возникающий в условиях засоления, сказывается, прежде всего, на способности клеток к росту растяжением. Поддержание роста в этих условиях связано как с регуляцией водного и осмотического гомеостаза, так и с изменением свойств клеточных стенок растений (Cosgrove and Li, 1993). В последние годы значительный прогресс в изучении клеточных стенок на молекулярном уровне достигнут в результате исследования состава и свойств составляющих ее полисахаридов, структурных белков и ферментов. Однако на этом фоне существует мало работ, посвященных влиянию различных стрессоров на процессы, происходящие в этом внеклеточном компартменте. Наиболее изученными в этом отношении являются вопросы, связанные с взаимодействием клеточной стенки с патогенами. Показано, что внедрение патогена приводит к изменению активности ряда ферментов, сопровождается активацией синтеза структурных белков и лигнина, изменениями в соотношении фракций полисахаридов матрикса (Заботин и др., 1995, Горшкова, 1997). В то же время мало известно о том, какие изменения в клеточных стенках возникают под действием абиотических стрессоров, в частности, засоления. Сформулировано представление, что, клеточная стенка может являться источником сигналов для запуска ответных, защитных реакций растительного организма.
По современным представлениям, клеточная стенка - сложноорганизован-ная, многофункциональная система (Carpita and Gibeaut, 1993; Шарова, 2004).
5 Она представляет собой внешний компартмент растительной клетки, который первым контактирует с наружным раствором и модифицирует его состав за счет реакций обмена между ионообменными группами полимерного матрикса стенок и ионами среды, тем самым, регулируя поступление веществ внутрь клетки. Эффективность модификации внешнего раствора клеточными стенками определяется их ионообменными свойствами.
Исследованию особенностей функционирования клеточных стенок растений как природных ионообменников в условиях засоления посвящены немногочисленные публикации (Bigot and Binet, 1986). Практически нет работ, в которых ионообменная способность клеточных стенок оценивалась бы количественно. В литературе также отсутствуют сравнительные исследования такого плана, проведенные на.галофитах и гликофитах, что крайне важно для выявления роли клеточных стенок в механизмах солеустойчивости. В связи с этим цель данной диссертационной работы состояла в оценке ионного статуса растений и ионообменной способности полимерного матрикса клеточных стенок галофита Suaeda altissima (L.) Pall, и гликофита Spinacia oleracea L., и их возможного вклада в адаптацию растений к засолению.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Определить эндогенное содержание ионов (калия, натрия, хлорида) в тканях галофита и гликофита, выращенных на питательном растворе с разной концентрацией хлористого натрия.
Оценить влияние засоления на распределение ионов между органами (лист, корень) исследуемых растений.
Изучить качественный и количественный состав функциональных групп полимерного матрикса клеточных стенок галофита
Провести сравнительное исследование физико-химических свойств полимерного матрикса клеточных стенок S, altissima и S. oleracea: определить константы диссоциации функциональных групп, расположенных в полимерной структуре клеточных стенок и способных вступать в ионообменные реакции с внешней средой; определить коэффициенты набухания полимерного матрикса клеточных стенок при разных значениях рН и ионной силы внешнего раствора; оценить степень сшивки линейных цепей в полимерном матриксе клеточных стенок галофита и гликофита.
5. Установить возможный вклад ионообменного механизма связывания ионов полимерным матриксом клеточных стенок в их накопление в тканях, а также в адаптацию галофита и гликофита к засолению. Научная новизна работы. Впервые установлено, что в составе полимерного матрикса клеточных стенок галофита сведы и гликофита шпината содержатся четыре типа ионообменных групп, три из которых являются катионообменны-ми (карбоксильные группы полигалактуроновой и оксикоричных кислот, фе-нольные группы), и одна - анионообменной (аминогруппы). Впервые определены физико-химические параметры, количественно характеризующие ионообменные свойства и способность к набуханию полимерного матрикса клеточных стенок растений, различающихся по солеустойчивости. Определены интервалы рН, в которых функциональные группы матрикса ионизированы и способны вступать в обменные реакции с катионами и анионами внешней среды. На основании значений коэффициентов набухания клеточных стенок S. altissima и S. oleracea установлено, что степень сшивки полимеров клеточных стенок галофита значительно превышает этот показатель у гликофита. Впервые показано, что объем клеточных стенок S. altissima и S. oleracea не является постоянной величиной и зависит от ионных условий и рН внешнего раствора и апопласта.
Практическая значимость работы. Полученные в работе данные расширяют фундаментальные знания о роли клеточных стенок в адаптации растений к неблагоприятным факторам окружающей среды и могут быть включены в курсы лекций по минеральному питанию и стресс-устойчивости растений. По-
7 казано, что одной из ответных реакций галофита и гликофита на засоление являются изменения физико-химических свойств клеточных стенок. Полученные в работе физико-химические параметры (ASJ , рКаі,5ви,5'и Kcw) позволяют предсказывать изменения в ионном составе раствора у плазмалеммы на начальном этапе поглощения элементов минерального питания.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на II Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2001), на 13 конгрессе FESPP (Греция, 2002), V съезде общества физиологов растений и международной конференции «Физиология растений - основа биотехнологии» (Пенза, 2003), IV Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005), XV International Plant Nutrition Colloquium «Plant nutrition for food security, human health and environmental protection» (Beijing, 2005). Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 7 работ. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно с автором.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 154 стр. машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитированной литературы, включающего 95 наименования (из них 74 на иностранных языках), приложения. Работа содержит 14 таблиц и иллюстрирована 27 рисунками.
Белки плазматической мембраны, участвующие в транспорте хлорида
Поступление ионов СГ в клетки растений при высоких концентрациях NaCl в почвенном растворе происходит через анионные каналы ПМ по градиенту электрохимического потенциала. Когда наружная концентрация NaCl повышается, более быстрая диффузия Na+, чем СГ в клетки приводит к диссипации мембранного потенциала, а, следовательно, к пассивному входу хлорид-ионов в клетки корня (Niu et al., 1995).
Анионные каналы обнаружены во всех видах мембран, включая плазма-лемму, ЭПР, мембраны митохондрий и хлоропластов. Хлоридные каналы участвуют как в загрузке, так и выгрузке ионов из клетки. Доказано, что эти каналы более специфичны к N03\ чем к СГ (White and Broadley, 2001). Методом регистрации токов одиночных ионных каналов в ПМ и тонопласте растительных клеток было выявлено несколько типов каналов, обладающих различной избирательной способностью по отношению к анионам и различающихся по своим свойствам и кинетическим характеристикам. Анионные каналы обнаружены в различных типах растительных клеток: замыкающих клетках устьиц, клетках мезофилла, гипокотиля и колеоптиля, клетках корня. В плазма-лемме замыкающих клетках устьиц идентифицировано три типа хлоридных каналов: быстрые (R-типа или GCAC1), медленные (S-типа) анионные каналы и каналы, активирующиеся натяжением (Cosgrove and Hedrich, 1991). Первые два типа каналов (R- и S-типа) высокоселективны для анионов и активируются при деполяризации плазматической мембраны. В мембранах клеток колеоптиля и гипокотиля кроме анионных каналов R- и S-типа был обнаружен канал, активируемый синим светом .(White and Bfoadley, 2001). Кроме того, в клетках кси-лемной паренхимы корня помимо вышеописанных каналов R- и S-типа найдены каналы, активирующиеся в ответ на гиперполяризацию мембраны, а в мем бранах кортикальных клеток корней пшеницы также обнаружены анионные ка налы, активирующиеся при деполяризации мембраны и в ответ на повышение концентрации Са в цитоплазме и анионов в наружной среде (Skerrett and Tyerman, 1994). Эти каналы относятся к группе быстрых анионных каналов и обеспечивают только загрузку ионов хлорида в клетки. Предполагается, что именно через эти каналы СГ поступает в клетки корня при увеличении наружной концентрации NaCl, Однако до настоящего времени твердо не установлено, какой тип анионных каналов вовлечен в транспорт СГ в клетки при почвенном засолении.
Через некоторое время после возрастания наружной концентрации соли и входа Na+ и СГ в клетки обмен веществ и ионный гомеостаз клеток переходят в новое стационарное состояние. Некторые авторы полагают, что после достижения нового стационарного состояния и реполяризации мембраны ионы хлорида транспортируются в клетки против градиента электрохимического потенциала с помощью СГД-Ґ-симпортера, который использует Лцц+ как движущую силу для входа СГ в клетки (Niu et al., 1995).
В зависимости от способности к росту в присутствии ионов натрия, поглощения Na+ корнями и их дальнего транспорта к побегам растения можно охарактеризовать как натрофильные и натрофобные. Различия в поглощении Na+ корневыми системами связаны с разной активностью натрий-выводящих транспортных механизмов, проницаемостью плазматической мембраны корней для натрия и др. При рассмотрении роли ионов натрия в минеральном питании растений следует уделить внимание трем аспектам: 1) натрий - как необходимый элемент питания для определенных видов растений; 2) степень замещения натрием функций калия; 3) усиление роста растений в присутствии Na+ в среде (Marschner, 1995).
В соответствии с влиянием Na+ на характер роста растений и степенью замещения им функций К+, а также в зависимости от ответа на действие высоких концентраций СГ в среде растения разделяют на несколько групп (Marschner, 1995, White and Broadley, 2001); группа — большая часть К+ может замещаться Na+. У этой группы ионы натрия и хлорида стимулируют рост растений, который не может быть достигнут за счет увеличения содержания К+ в среде. К ней относятся экстремальные гало фиты семейства Chenopodlaceae (например, Suaeda maritima Atriplex пит-mularia и многие С4- травы); 2 группа — меньшее количество К может быть замещено на Na+ по сравнению с первой группой, а в присутствии ионов натрия и хлорида до 200 мМ происходит незначительное усиление роста. Растения этой группы выдерживают концентрации NaCl до 200 мМ {Atriplex hastata, Spartina spp., сахарная свекла, капуста, редис, горох, шпинат, лен, пшеница); 3 группа — замещение К+ на Na+ может происходить только в ограниченной степени, и последний не оказывает стимулирующего влияния на рост растений. К этой группе относятся галофиты и гликофиты, рост которых значительно по 26 давляется в присутствии 100 мМ NaCl. В этой группе можно выделить толерантные растения (Festuca rubris, Puccinella peisonis, хлопок, ячмень, рис, райграс), промежуточные (томаты) и чувствительные (кукуруза, соя, бобы, тимофеевка, рожь); 4 группа — замещение К+ на Na+ невозможно. К этой группе принадлежат гликофиты, крайне чувствительные к засолению (цитрусовые и древесные растения). В ходе изучения ответных реакций различных галофитов и гликофитов на присутствие Na в питательной среде было обнаружено сравнительно одинаковое поведение растений с С - и САМ-путями фотосинтеза. В отсутствии натрия у Сд-видов наблюдается угнетение роста и симптомы дефицита питательных элементов (хлорозы и некрозы, либо утрата способности формирования цветков). Добавление всего лишь 100 мкМ Na+ восстанавливает рост растений и удаляет симптомы повреждения. В настоящее время показано, что Na+ является растений, принадлежащих к семействам Chenopodiaceae, Amarantaceae и Сурег-асеае, а для Сз-видов растений его присутствие не является необходимым условием для роста (Johnston et al., 1988). У растений с С4— и САМ—путями фиксации углекислоты Na+ участвует в процессе регенерации фосфоенолпирувата, являющегося субстратом в реакции первичного карбоксилирования (Taiz and Zeiger, 1998). В условиях его дефицита у С4-растений происходит снижение активности фотосистемы II и значительно изменяется ультраструктура хлоропластов мезофилла листа, в то время как ни один из этих параметров не находится под влиянием недостатка ионов натрия в хлоропластах клеток обкладки.
Определение качественного и количественного состава ионообменных групп полимерного матрикса клеточных стенок
На примере большого числа сельскохозяйственных культур было показано, что более солеустойчивые виды обладают большей способностью исключать Na+ из клеток тканей листьев и поддерживать высокий уровень ЬС+ в них (Zhu et al., 2001). При засолении скорость роста листьев большинства злаковых культур коррелировала с концентрацией Na+ в клетках листьев. Однако, в отличие от однодольных, для двудольных видов растений не всегда была характерна подобная корреляция. Например, солеустойчивый дикий вид томата Lycopersi-соп peruvianum накапливал больше Na+ в тканях надземных органов по сравнению с культурным видом L. esculentum. Подобная корреляция не всегда характерна и для галофитов. Двудольные галофиты накапливают большое количество NaCl в вакуолях клеток тканей побегов и используют Na+ в качестве главного осмолита для создания необходимого осмотического потенциала (Flowers and Yeo, 1986). Так, например, у галофитов семейства Chenopodiaceae высокая солеустойчивость основывается на накоплении большого количества (1-1,5 М) солей в тканях надземных органов и использовании Na+ для поддержания тур-гора и замещения функций К+ (Marschner, 1995). Адаптация, основанная на такой стратегии использования ионов натрия и хлорида, подразумевает высокую толерантность тканей к этим ионам.
У солеустойчивых видов растений при высоком засолении значительно увеличивается способность вакуолей клеток мезофилла листьев к накоплению Na+ и СГ. Это происходит за счет увеличения размера клеток, особенно вакуоли, и, таким образом, происходит «разбавление» солей и предотвращение или, по крайней мере, замедление накопления ионов в апопласте и цитоплазме листьев. В условиях засоления у типичных представителей галофитов наблюдается усиление роста и увеличение эндогенного содержания СГ и особенно Na+ в тканях побега при увеличении концентрации NaCl в наружной среде.
Однодольные галофиты поглощают меньше Na+ по сравнению с двудольными и способны поддерживать высокую концентрацию К+ в тканях надземных органов. В этом случае необходимое осмотическое давление в клетках достигается за счет синтеза Сахаров. Однако, несмотря на то, что двудольные галофиты накапливают большое количество NaCl, это не означает, что они транспортируют натрий с более высокой скоростью, чем солечувствительные растения.
Другим адаптивным ответом факультативных галофитов на действие солевого стресса является переключение Сз-пути фотосинтеза на САМ. При этом значительно снижается транспирация и транспорт ионов в надземные органы. Ограничение поступления Na+ и СГ в молодые листья и генеративные ткани — еще одно важное свойство солетолерантных видов. У таких растений устойчивость определяется способностью поддерживать градиент этих ионов между старыми и молодыми листьями, при этом общее содержание солей Na+ в тканях не играет существенной роли. Высокое содержание К+ по сравнению с Na+ в молодых листьях и репродуктивных органах обеспечивается низким поступлением ионов в ксилему и значительной рециркуляцией К+ из флоэмы от зрелых листьев (Marschner, 1995).
Выведение Na+ и СГ из клеток тканей надземных органов - главное направление адаптации гликофитов. Однако определение гликофитов, как солевыво-дящих растений, относительно и подразумевает более низкие скорости поглощения и транспорта солей из корней в надземные органы по сравнению с соле-накапливающими видами. Было показано, что более высокая чувствительность гороха по сравнению со шпинатом вызвана не только усиленным контролем транспорта Na+ и СГ в надземные органы у шпината, но и поддержанием низких концентраций ионов в апопласте листьев. Рост гликофитов ингибируется при сильном засолении, несмотря на то, что содержание ионов натрия и хлорида в тканях надземных органов остается относительно низким (Marschner, 1995).
Многие солечувствительные виды способны эффективно исключать ионы натрия из поглощения, то есть ограничивать их транспорт к надземным органам, но не обладает такой способностью по отношению к хлорид-ионам. Поэтому даже при небольшом уровне засоления токсичность СГ является главной причиной снижения роста этих растений (Marschner, 1995) . Механизмы, ограничивающие транспорт Na+ и СГ к надземным органам, должны функционировать как на уровне корня, так и на пути от корней к побегам. Рециркуляция Na+ из надземной части растения к корням может обеспечивать его низкое содержание в тканях побегов как солеустойчивых, так и солечувствительных видов (Tester and Davenport, 2003). Адаптация с использованием стратегии выведения Na+ и СГ из тканей надземных органов требует наличия механизмов, обеспечи 46 вающих избежание водного дефицита. У гликофитов это достигается за счет повышения в клетках синтеза органических растворенных веществ (сахаров, аминокислот) или увеличения скорости поглощения К+, Са2+ или NCV.
Полагают, что принципиальное отличие между двумя группами растений заключается в способности галофитов выдерживать солевой шок. Это позволяет им быстрее, по сравнению с гликофитами, устанавливать новое метаболически устойчивое состояние для поддержания роста в условиях засоления (Hasegawa and Bressan, 2000). Однако ответ на солевой стресс и, по крайней мере, способность к установлению нового устойчивого состояния не являются уникальными для галофитов, поскольку на уровне клетки и целого растения гликофиты проявляют значительную толерантность при условии, что стресс действует постепенно (Amzallag et al., 1990). Возможно, главным преимуществом галофитов по сравнению с гликофитами является не более эффективное распределение натрия, а более эффективное регулирование потоков этого иона, скоординированное с процессами, контролирующими рост, как на клеточном уровне, так и на уровне целого растения (Hasegawa and Bressan, 2000).
Контроль процесса транспорта натрия может осуществляться на нескольких уровнях: поглощения и поступления в побеги, а также распределения между тканями надземных органов. Например, растения могут: І) уменьшить поглощение Na+; 2) увеличить его выход из клетки; 3) снизить поступление Na+ в ксилему или увеличить его отток из нее до того, как этот ион достигнет тканей надземных органов; 4) увеличить рециркуляцию Na+ из тканей побега во флоэму; 5) усилить внутриклеточную компартментацию NaCl или его распределение в определенные части побега (например, клетки сердцевины или старые листья); 6) секретировать соли на поверхность листьев (Tester and Davenport, 2003).
Зависимость ионообменной способности полимерного матрикса клеточных стенок сведы от ионной силы внешнего раствора
100-200 мг сухого растительного материала растирали в фарфоровой ступке и переносили в стеклянную пробирку, добавляли 5-10 мл дистиллированной воды. Пробирку закрывали пробкой и помещали на кипящую водяную баню. Экстракцию проводили в течение одного часа. Полученный водный экстракт фильтровали через бумажный фильтр и количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, многократно смывая образец водой. В стеклянную пробирку вносили I мл водного фильтрата, 2 мл ледяной уксусной кислоты и 1 мл нин-гидринового реактива. Контрольный раствор содержал I мл дистиллированной воды, 2 мл ледяной уксусной кислоты и 1 мл нингидринового реактива. Содержимое пробирок перемешивали, закрывали пробкой и кипятили на водяной бане в течение 1 часа. Затем раствор быстро охлаждали и проводили измерение оптической плотности на спектрофотометре (SmartSpec 3000, США) при 440 нм против контроля. Для определения концентрации пролина проводили построение калибровочной кривой, используя серию растворов пролина с известной концентрацией (5 10"5М—1,5 10 3М).
Приготовление нингидринового реактива: к 30 мл ледяной уксусной кислоты добавляли 20 мл 6М фосфорной кислоты и 1,25 г нингидрина. Полученный раствор тщательно перемешивали и кипятили на водяной бане в течение 30 минут. 200 мг сухого растительного материала растирали в фарфоровой ступке и переносили в стеклянную пробирку. В ступку добавляли 5-10 мл дистиллированной воды и помещали на кипящую водяную баню. Экстракцию проводили в течение одного часа. Полученный водный экстракт количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, многократно промывая образец водой и фильтруя через бумажный фильтр. Для определения количества белка в водной вытяжке использовали 15 мл полученного экстракта.
Осаждение белка. К каждым 5 мл водной вытяжки, помещенных в центрифужные пробирки, добавляли 2мл 50% ТХУ и выдерживали в течение 30-40 минут при постоянном перемешивании. Затем содержимое пробирок центрифугировали в течение 15 минут при 12000-15000 об/мин. Супернатант сливали, а осадок промывали последовательно 5% и 1% растворами ТХУ (для экстракта, полученного из листьев, после 1%-раствора ТХУ осадок белка дополнительно отмывали 80% ацетоном). После каждой стадии промывки проводили центрифугирование. Полученный осадок белка немного подсушивали на воздухе и растворяли в 1 мл 1%-ного раствора NaOH. Для полного растворения белка пробирки помещали в термостат на 12 часов при 40С. Полученный белковый гидролизат использовали для определения белка по методу Лоури.
После извлечения водорастворимых белков растительный материал подвергали экстракции 0,2%-ным раствором щелочи. Для этого к оставшемуся растительному материалу приливали 5-7 мл 0,2%-ного раствора щелочи, выдерживали в течение 20-30 минут при постоянном перемешивании и декантировали в мерную колбу на 25 мл. Извлечение раствором щелочи производили не менее 3-4 раз. Экстракцию щелочью заканчивали промыванием остатка растительного материала водой и фильтраты объединяли в мерную колбу (Ермаков, 1972).
Осаждение и промывание белка проводили так же, как и для водорастворимой фракции белка. Полученный белковый гидролизат использовали для определения белка по методу Лоури.
После извлечения белков водой и раствором щелочи к остатку растительного материала приливали порциями 3-5 мл 70% этанола и выдерживали в течение 30 минут при постоянном встряхивании (Ермаков, 1972). Жидкость сливали в бюкс и оставляли на воздухе для полного испарения спирта. Затем в бюкс добавляли 5 мл 1% раствора щелочи для растворения осадка. Осаждение и промывку белка проводили так же, как и для водорастворимой фракции белка. Полученный гидролизат использовали для определения белка по методу Лоури.
В - 0,5% CuS04 5 Н20 в 1% растворе цитрата натрия С - 50частей А : 1 часть В Д - 2 N раствор реактива Фолина К аликвоте белкового гидролизата, доведенного дистиллированной водой до 1 мл, приливали 2,2 мл реактива С, перемешивали и выдерживали 10 минут. Затем в пробирки добавляли 0,1 мл реактива Д, перемешивали и оставляли на 30 мин-1 час. Параллельно готовили контрольный раствор, содержащий вместо экстракта белка 1 мл воды. Пробы фотометрировали на спектрофотометре (SmartSpec 3000, США) при 750 нм против контроля (Ермохина и др., 1991). Построение калибровочной кривой проводили, используя серию растворов бычьего сывороточного альбумина с известной концентрацией.
Ионогенные группы в полимерной структуре клеточных стенок
Ионообменная способность клеточных стенок шпината также зависит от ионной силы раствора и условий выращивания растений. Увеличение концентрации соли в растворе приводит к соответствующему изменению ионообменной способности стенок, что обусловлено изменением степени ионизации карбоксильных групп ПГК. Также как у галофита, у гликофита с увеличением содержания соли в растворе уменьшается константа ионизации этих групп, и усиливаются их кислотные свойства. Независимо от условий выращивания количество карбоксильных групп ПГК и оксикоричных кислот приблизительно одно и то же в стенках корня и листьев верхнего яруса, а в клеточных оболочках листьев нижнего яруса (табл.5) содержание этих групп в 1,2-2 раза больше, чем в стенках других типов тканей. С увеличением уровня засоления в клеточных стенках корней и листьев шпината возрастает количество карбоксильных групп оксикоричных кислот, тогда как содержание аминогрупп в корнях уменьшается, а в листьях практически не изменяется. При этом с увеличением CNaCI от 0,5 до 250 мМ происходит снижение количества фенольных групп в полимерном матриксе клеточных стенок листьев, а в клеточных стенках корней изменяется незначительно (табл. 5).
Известно, что высокое содержание катионов, например калия, в молодых листьях и репродуктивных органах обеспечивается, в том числе, значительной рециркуляцией их от зрелых листьев (Marschner, 1995). В этой связи клеточные стенки тканей полностью сформировавшихся листьев можно рассматривать как запасной пул катионов, необходимых для поддержания ионного гомеостаза в развивающихся органах, так как клеточные стенки зрелых листьев могут накапливать больше катионов по сравнению с молодыми.
С увеличением засоления питательного раствора от 0,5 до 250 мМ NaCl в клеточных стенках листьев нижнего яруса содержание групп ПГК и оксико-ричных кислот увеличивается почти в 2 раза. Эти результаты подтверждают вышеприведенное предположение о том, что клеточные стенки зрелых листьев можно рассматривать как запасной пул катионов. В условиях засоления ограничение поступления натрия и хлорида в молодые листья за счет большего накопления этих ионов в клеточных стенках зрелых тканей, является, вероятно, важным адаптивным свойством растений шпината. Известно, что устойчивость определяется способностью поддерживать градиент натрия и хлорида между старыми и молодыми листьями, при этом общее содержание солей в тканях не играет существенной роли (Marschner, 1995).
Полученные результаты показывают (табл.7), что, как и у галофита, у гликофита при изменении ионной силы раствора от 10 до 250 мМ варьирует константа ионизации групп ПГК (от 4,79 до 3,77), в то время как рКа двух других групп мало зависят от осмотического давления внешнего раствора.
Также как у сведы, у шпината повышение концентрации NaCl в растворе приводит к увеличению катионообменной способности (S) полимерного матрикса клеточных стенок (рис. 15) и корней, и листьев. Независимо от уровня засоления среды значение S выше у листьев нижнего яруса по сравнению с этим параметром у листьев верхнего яруса и корней. Увеличение С в среде выращивания до 250 мМ приводит к возрастанию S (1,2-1,5 раза) в листьях нижнего яруса и уменьшению ионообменной способности клеточных стенок листьев верхнего яруса, В корнях шпината значение S мало зависит от концентрации соли в среде выращивания (рис. 15).
Известно, что клеточные стенки представляют собой слабосшитый ионо-обменник с карбоксильными группами. Поэтому одним из важных физико-химических показателей, которые характеризуют свойства полимеров клеточных стенок, как ионообменника, является набухание. Количественной характеристикой этого процесса является весовой коэффициент набухания, равный количеству воды в полимере, отнесенной к грамму сухой массы вещества. Причиной набухания ионообменных материалов в водном растворе является наличие гидрофильных групп, причиной нерастворимости - существование поперечных связей. Степень набухания ионообменного материала зависит от свойств ионита и состава внешнего раствора. Чем больший процент поперечных связей в структуре, тем плотнее и жестче полимерная сетка, тем меньше способность к набуханию. Известно, что способность к набуханию ионообменных материалов возрастает с уменьшением степени поперечной связанности, с увеличением количества фиксированных зарядов, с уменьшением концентрации раствора, с увеличением степени диссоциации функциональных групп и зависит от радиуса гидратированного иона, которым заполняется сорбент (Гельферих, 1962).
