Введение к работе
Актуальность темы. Исследования молекулярной подоплеки вязкоэластичных свойств клейковины пшеницы проводятся давно и во многих лабораториях мира. Было установлено, что различия сортов пшеницы по признаку “качество клейковины“ связаны в основном с нерастворимой фракцией глютенина, образующейся путем полимеризации субъединиц глютенина в процессе созревания зерновки (Payne et al., 1987, Shewry and Halford, 2002). Ключевыми взаимодействиями, стабилизирующими трехмерную структуру глютениновых полимеров, являются межмолекулярные дисульфидные связи.
Вместе с тем известно, что вариабельность качества клейковины в большей степени зависит от физиологических факторов, связанных с нестабильностью условий среды во время созревания зерновки, нежели от вариабельности количества высокомолекулярных субъединиц глютенина (Lemelin et al., 2005).
Решающая роль межмолекулярных дисульфидных связей в формировании структуры клейковины предполагает, что процесс полимеризации глютениновых полипептидов при созревании зерна может регулироваться различными клеточными редокс агентами. Однако роль редокс окружения в формировании реологических свойств клейковины остается слабо изученной и спорной (Li et al., 2004; Every et al., 2006).
В связи с этим изучение в зерновке пшеницы активности ферментных систем, катализирующих тиол-дисульфидный метаболизм белков, их роли в процессах полимеризации запасных белков при созревании зерновки и в формировании технологического качества клейковины является актуальным как в теоретическом, так и в практическом аспектах.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение роли ферментативного регулирования полимеризации запасных белков в формировании надмолекулярных белковых структур зерна пшеницы и установление механизмов высокой вариабельности качества клейковины в разных условиях среды.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: 1) изучить в созревающей зерновке пшеницы сопряженность баланса SS/SH и активностей ферментов тиол-дисульфидного метаболизма; 2) изучить вариабельность содержания и физических свойств клейковины у различных генотипов мягкой пшеницы в разных условиях выращивания; 3) выявить взаимосвязь параметров качества клейковины с активностью ферментов тиол-дисульфидного метаболизма; 4) провести очистку и изучить биохимические характеристики тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из зерна пшеницы; 5) изучить влияние экзогенной дисульфидредуктазы из зерновки пшеницы на физические свойства клейковины; 6) картировать локусы количественных признаков, ассоциированные с активностью дисульфидредуктазы; 7) изучить соотношение фракций по Осборну в белковом комплексе семян реликтового злака перловник Турчанинова (Poaceae) из различных ценопопуляций Восточного Забайкалья.
Положения, выносимые на защиту
1. Полимеризация субъединиц глютенина в процессе созревания зерна регулируется эндогенными оксидоредуктазами, катализирующими реакции тиол-дисульфидного метаболизма в запасных белках.
2. Высокая вариабельность качества клейковины в разных условиях среды обусловлена вариабельностью активности ферментов, катализирующих SS/SH редокс превращения в запасных белках созревающей зерновки.
3. В созревающей зерновке пшеницы функционирует высокомолекулярный глутаредоксин подобный белок с тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазной активностью (КФ 1.8.4.2), катализирующий редукцию межмолекулярных дисульфидных связей полимерных белков эндосперма пшеницы, что приводит к ослаблению белковой решетки клейковины.
Научная новизна. Впервые установлено, что в созревающей зерновке пшеницы присутствуют активности тиол:кислород оксидоредуктазы (ТО, КФ 1.8.3.2) и GSH-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы (ТПДО, КФ 1.8.4.2), катализирующие соответственно образование и восстановление дисульфидных связей в запасных белках. GSH-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза зерна пшеницы была выделена, очищена до электрофоретической гомогенности и охарактеризована. Фермент имеет молекулярную массу около 167 кДа и состоит из двух субъединиц, около 73 и 77 кДа. Установлено, что дисульфидредуктаза зерна пшеницы по энзиматическим характеристикам имеет сходство с ферментами из животных тканей, принадлежащими к суперсемейству тиоловых оксидоредуктаз. Влияние дисульфидредуктазы на физические свойства клейковины указывает на специфичность фермента к межмолекулярным SS связям глютенина, что отличает его от известного в зерновке тиоредоксина h.
Динамика активности ферментов тиол-дисульфидного метаболизма в созревающей зерновке, синхронность изменения соотношения SS/SH и баланса ферментативных активностей свидетельствуют, что ферменты вовлечены в процесс полимеризации глютениновых субъединиц на первом (при образовании разветвленного глютенина) и втором (образование нерастворимых полимеров клейковины) уровнях агрегации белков. Впервые показана взаимосвязь между балансом ферментативных активностей, регулирующих SS/SH статус запасных белков, и физическими свойствами клейковины.
Впервые на хромосомах мягкой пшеницы картированы локусы количественных признаков, ассоциированные с активностью дисульфидредуктазы, положение которых совпало с положением локусов, ассоциированных с параметрами физических свойств клейковины.
Высокая активность дисульфидредуктазы, обнаруженная в прорастающей зерновке, свидетельствует об участии фермента в подготовке протеолитической деградации глютениновых агрегатов при прорастании. Предполагается, что редуцирующие системы, подобные системе ТПДО, играют важную роль в прорастании семян злаков из филогенетически древних таксонов, так как среди запасных белков в семенах реликтовых злаков преобладают труднорастворимые полимерные глютелины.
Научная и практическая значимость работы. Установлено, что
ферменты тиол-дисульфидного метаболизма, присутствующие в созревающей зерновке пшеницы, вовлечены в процесс полимеризации запасных белков и формирование физических свойств клейковины, вариабельность качества зерна связана с функционированием этих ферментных систем. Изучение GSH-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы зерновки пшеницы позволило оценить роль редуцирующей системы глутаредоксина в созревающем и прорастающем зерне. Результаты картирования локусов количественных признаков для активности дисульфидредуктазы могут служить основой для выявления кандидатных генов, контролирующих процесс полимеризации запасных белков и качество клейковины пшеницы. Полученные результаты вносят значительный вклад в познание процессов формирования надмолекулярных белковых структур в созревающей зерновке, расширяют и углубляют понимание природы высокой вариабельности качества клейковины в меняющихся условиях среды и могут быть использованы в селекции пшеницы на конечное использование. Разработан и защищен патентом способ получения тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из растительного сырья.
Публикации и апробация работы. Основное содержание и защищаемые положения диссертации отражены в 40 работах, в том числе 15 из них опубликованы в изданиях из перечня ВАК. Результаты исследований по теме диссертации были доложены и обсуждены на 3 Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988); на 2-ом (Минск, 1990), 3-ем (Санкт-Петербург, 1993) и 4-ом (Москва, 1999) съездах Всероссийского общества физиологов растений; на ежегодном симпозиуме ВОФР (Пенза, 1996), на 2-ом съезде ВОГИС России (Санкт-Петербург, 1999), на международной конференции “Биотехнология на рубеже двух тысячелетий“ (Саранск, 2001); на 11-ой (Новосибирск, 2000), 12-ой (Норидж, Англия, 2002), 13-ой (Прага, Чехия, 2006) и 14-ой (Стамбул, Турция, 2007) международных конференциях EWAC (Европейского общества по анеуплоидии пшеницы); на 10-ом (Paestum, Италия, 2003) и 11-ом (Brisbane, Австралия, 2008) международных симпозиумах по генетике пшеницы, на 4-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), а также на научных сессиях Сибирского института физиологии и биохимии растений (Иркутск, 1994, 1996, 1998, 2000, 2002, 2004, 2006).
Декларация личного участия автора. В диссертационной работе использованы экспериментальные материалы, полученные лично автором, а также совместно с коллегами лабораторий технической биохимии и физико-химических методов исследования СИФИБР СО РАН, сотрудниками ИЦИГ СО РАН (Новосибирск), КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко (Краснодар), Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK) (Gatersleben, Germany)
и Читинской государственной медицинской академии. Автору принадлежит разработка планов исследований, организация и ведение экспериментов, анализ опытного материала и обобщение результатов. Суммарное личное участие автора ~ 85%. В диссертацию включены некоторые данные из кандидатской диссертации А.В.Пермякова “Протеин-дисульфид редуктаза и липоксигеназа пшеницы в ферментативной регуляции SS/SH-обмена в запасных белках зерновки: физиолого-биохимические аспекты“ (2004), в планировании, получении и обсуждении которых автор диссертации принимала личное участие.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 265 страницах, содержит 42 рисунка и 31 таблицу, состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (456 источников). Приложение содержит 2 таблицы.
