Введение к работе
Актуальность проблемы. Белки пшеничного зерна, образующие клейковину, отличаются от запасных белков семян других злаков, прежде всего своими уникальными реологическими свойствами. В зависимости от сорта и условий выращивания пшеницы в зерне формируются белковые комплексы клейковины с очень разными физико-химическими и реологическими свойствами, совокупность которых принято обозначать технологическим термином "качество клейковины". В клейковине высокого качества содержание SS-связей на 22-31 % выше (Кретович, Вакар, 1974). Разнокачественность клейковины у сортов пшениц связана с содержанием и соотношением в ней SS-связей и SH-групп (Кретович, 1987, 1991; Труфанов и др., 1993). Существующая в зерновках пшеницы специфическая система ферментов тиол-дисульфидного метаболизма катализирует образование, распад и изомеризацию (перегруппировку) SS-связей в запасных белках, т.е. имеет прямое отношение к созданию SH/SS-статуса запасных белков и, следовательно, к формированию структуры белкового комплекса клейковины (Труфанов, 1994).
В этом отношении представляют интерес данные о функционировании в
зерновке пшенице системы НАДФН-зависимой тиоредоксинредуктазы
(Suske et al, 1979; Kobrehel ct al, 1992; Wong et al, 1996), НЛДФН-зависимой
протеиндисульфид оксидоредуктазы (Hatch et al, 1960; Горпинченко и др.,
1972, 1975), глутатион-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы
(Кузнецов, Труфанов, 1981; Труфанов, Кичатинова, 1989),
восстанавливающих SS-связи в запасных белках пшеницы, и НАДФН-зависимой глутатионредуктазы, восстанавливающей SS-связи окисленного глутатиона (Проскуряков, Зуева, 1963, 1964; Lascano et. al., 2001). НАДФН-зависимая протеин-дисульфид изомераза катализирует перегруппировку в белках термодинамически напряженных SS-связей (Grynberg et al., 1977; Shimonietal, 1995; Galili et al, 1996).
Имеются сведения об участии липоксигеназы в образовании SS-связей в запасных белках пшеницы путем опосредованного окисления SH-rpynn перекисями и гидроперекисями ненасыщенных жирных кислот (Кретович, 1991; Shiiba, 1991).
Ферментативное окисление сульфгидрильных групп запасных белков можег происходить с помощью кислород-зависимых тиолоксидаз (Труфанов и др., 1989), подобных тиолоксидазам животных клеток (Lash, Jones, 1984, 1986). Участие в тиол-дисульфидных реакциях в запасных белках пшеницы могут принимать также глутатионтрансфераза (Pascal et al, 1988) и глутатион-зависимая дегидроаскорбат оксидоредуктаза (Every, 1996; De Gara ct al, 2002).
Таким образом, в зерновке пшеницы одновременно функционирует сложная система специфических ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз и регулирующих SH/SS-статус белков в клетке. Катализируя образование, распад или перегруппировку термодинамически напряженных SS-связей и обеспечивая оптимальный уровень низкрмпдргучтявнвм ттг
' ОЭ »00
кофакторов (например, глутатионредуктаза), эти ферменты участвуют в регуляции процессов тиол-дисульфидного обмена в зерновках in vivo. .
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении физиолого-биохимических аспектов регуляции тиол-дисульфидного обмена в развивающейся зерновке пшеницы на примере трех ферментов: протеин-дисульфид редуктазы, глутатионредуктазы и липоксигеназы, участвующих в создании SH/SS-статуса запасных белков.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1. Изучить динамику протеин-дисульфид редуктазной активности и
содержание небелковых SH-групп в процессе созревания зерновки
пшеницы.
Выделить в гомогенном состоянии протеин-дисульфид редуктазу пшеницы с использованием методов солевого фракционирования, колоночной хроматографии и электрофореза в ПЛЛГ.
Изучить биохимические характеристики очищенного фермента.
Изучить компонентный состав ферментного экстракта методами нативного и денатурирующего электрофореза в пластинках ПААГ.
Изучить изоферментный состав исследуемых ферментов в созревающей зерновке пшеницы.
Изучить особенности проявления активности липоксигеназы у разнокачественных сортов и линий пшеницы с межсортовым замещением хромосом 4 и 5 гомеологических групп.
Научная новизна. Впервые из зерновок пшеницы (Triticum aestivum L.)
выделен в гомогенном состоянии фермент с тиол:протеиндисульфид
оксидоредуктазной активностью, подобный глутатион:инсулин
трансгидрогепазе из животных и микробиологических объектов. В результате были изучены некоторые биохимические характеристики и свойства протеин-дисульфид редуктазы пшеницы.
Показано изменение физических свойств пшеничного теста (на альвеографе) даже при слабом действии протеин-дисульфид редуктазы. Установлена важная роль глутатионредуктазы в регуляции протеин-дисульфид редуктазной функции фермента в процессе развития зерновок пшеницы, т.е. функциональная взаимосвязь этих ферментов в процессах создания и регуляции SH/SS-статуса запасных белков.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основе полученных результатов можно предположить, что в зерновках пшеницы {Triticum aestivum L.) одновременно с двумя системами ферментативного восстановления SS-связей в запасных белках пшеницы - НАДФН, НАДФН-зависимая тиоредоксинредуктаза, тиоредоксин и НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и глутаредоксин (Rouhier et al., 2002), существует третья система - НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и протеин-дисульфид редуктаза.
. -Установлено, что наибольшее влияние в зерновках пшеницы на
проявление удельной активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А. Однако, учитывая то, что регуляция активности данного фермента носит полигенный характер, возможно важную роль играют также гены-регуляторы, расположенные на других хромосомах. Это обстоятельство имеет важное значение при разработке теоретических основ для создания новых генотипов (сортов) пшеницы методами хромосомной инженерии.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 18 работ. Результаты исследований были представлены на II и III съезде ВОФР (Минск, 1990; Санкт-Петербург, 1993), на IV и V съезде физиологов растений (Москва, 1999, Пенза, 2003), на международном симпозиуме «Physical-chemical basis of plant physiology», на 11 и 12 международных конференциях EWAC (Новосибирск, 2000; Norwich, 2002), международной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячилетей» (Саранск, 2001), на 10 международном симпозиуме по генетике пшеницы (Paestum, 2003, сентябрь, 1-6).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной частей, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 32 рисунка и 8 таблиц. Список литературы состоит из 246 источников, в том числе 200 зарубежных авторов.
