Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Применение титановых сплавов, заселенных мезенхимальными стромальными клетками для костной пластики в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии 12
1.1. Стволовые клетки, их свойства и источники 12
1.2. Взаимоотношения между имплантированной стволовой клеткой и реципиентом 14
1.3. Применение МСК для повышения интегративных свойств имплантатов при восстановлении костных дефектов 15
1.4 Носители МСК для тканевой инженерии в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии 25
1.5. Создание контакта искусственного материала с костью методами тканевой инженерии 29
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Материалы и методы лабораторного исследования 39
2.2. Материалы и методы экспериментального исследования 48
2.3 Методика гистоморфометрического исследования 55
2.4. Статистическая обработка данных 56
Глава 3. Результаты собственных исследований репаративной регенерации ветви челюсти при применении мезенхимальных стволовых клеток на носителе из титана с разной структурой поверхности 58
3.1. Состояние поверхности пластин из титанового сплава с разной структурой поверхности и заселенных МСК 58
3.2. Экспериментально-морфологическое исследование остеостимулирующей эффективности мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, культивированных на поверхности пластин из титана 69
3.2.1. Результаты исследования на крысах 69
3.2.2 Результаты исследования на кроликах 90
3.3. Структурная организация регенерата в экспериментально воспроизведенных дефектах ветви нижней челюсти по данным гистоморфологического и гистоморфометрического изучения 100
Глава 4. CLASS Заключени CLASS е 129
Выводы 137
Практические рекомендации 139
Список литературы 140
- Применение МСК для повышения интегративных свойств имплантатов при восстановлении костных дефектов
- Материалы и методы экспериментального исследования
- Состояние поверхности пластин из титанового сплава с разной структурой поверхности и заселенных МСК
- Структурная организация регенерата в экспериментально воспроизведенных дефектах ветви нижней челюсти по данным гистоморфологического и гистоморфометрического изучения
Введение к работе
Актуальность проблемы
Развитие биомагериалов для стоматологии и челюетно-лицевой хирургии осуществляется параллельно с развитием тканевой инженерии. Среди этих материалов большое разнообразие полимеров, которые исследованы in vitro и in vivo с целью развития технологий для получения носителей мезенхимальпых стромальпых клеток (МСК), они должны обладать достаточными механическими свойствами, пористостью, биологической стабильностью или разлагаться при введении в организм (Yoshikavva and Myoui, 2005). Среди природных материалов - биоактивных носителей: агароза, альгинаг, гиалуроновая кислота, желатин, фибрнновый клей, коллаген. Недостаток этих конструкций - механическая нестойкость, серьезно оіраничивающая их клиническую ценность. Хотя эти материалы используются, но считается, что они хуже синтетических и гибридных материалов. Синтетические биоматериалы могут быть синтезированы по мерс их использования и изготовлены с более или менее стандартными свойствами и чистотой. Например, полигликолевая кислота - давний, хорошо исследованный носитель стволовых клеток, но она деградирует с большей скоростью, чем образуется новая костная ткань (Martin I. ct al., 2001; Noth U. al., 2002; Tuli R. et al.2()()4). Сополимер этиленгликоля был использован в качестве носителя МСК (Li W.J. et al.,2005), по он также быстро резорбируется, поэтому не приемлем в качестве носителя для костной ткани. Эта уникальная форма имела сходную микроструктуру с природным коллагеновым фибриллярным матрнксом. Но в некоторых ситуациях, например, при заполнении костных и хрящевых дефектов jth носители и их модификации могут быть использованы.
Большое распространение получили гибридные носители из синтетических и
природных полимеров, как было показано, они являются эффективным
средством для переноса стволовых клеток. Один из примеров гибридного
носителя - полилактнд/альгинат, который поддержнваст\
хондроиндуцирующис МСК человека in vitro (Caterson E.J. et al.,2001). Сополимеры полиэтиленгликоля (N-isopropylacrylamide) (PNI-PAAm) и водорастворимый хитозан являются хорошими носителями для хондрогенных MSCs (Cho J.H. et al.,2004). Предложено и множество других вариантов носителей стволовых клеток. Среди них нерезорбируемые полимеры (полиметилметакрнлат, полиамид, полиэтилен и др.), физико-механические свойства которых приближаются к свойствам костной ткани (А. И. Воложин и соавт., 2005; 2006; Денисов-Никольский Ю.И. и соавт., 2005; Татаренко-Козмина Т.Ю., 2007.). Их можно использовать в качестве имплантатов, которые в последующем не требуется удалять, например, для замещения больших дефектов челюстей и других костей лицевого скелета. Полимеры также не лишены недостатков. Они подвергаются физико-химическому «старению», нередко выделяют токсические вещества. Также известно, что прикрепление н развитие МСК на их поверхности хуже, чем при использовании других носителей - металлов, в первую очередь, титана (А.И. Воложин и соавт., 1998 - 2006). Титан остается наиболее распространенным материалом для изготовления многих изделий медицинского назначения, в первую очередь, в хирургической практике. Его высокая биосовместимость, способность инициировать построение костной ткани и интегрироваться с ней, легко заселяться МСК и другие свойства делают титан пока самым распространенным материалов в стоматологии, травматологии и тканевой инженерии (Воуап B.D.et al., 2002; De Giglio E. et al., 2001; Kudelska-Mazur D. et al., 2005; Feng B. et al., 2003) и его сплавы (Spriano S. et al., 2005; De Giglio E. et al., 2001; Zreiqat H. ct al., 2005; Advincula M.C. et al., 2006). К тому же дентальные имплантаты, все чаще используемые для восстановления целостности зубных рядов, как правило, изготавливаются из титановых сплавов. Опубликовано большое число работ, посвященных роли поверхности титана в проявлении их остеоинтегративных свойств. Модификация структуры поверхности самого титана, нанесение на него органических (аминокислот и др.) или неорганических субстанций
(шдроксиапатит, трикальцинфосфат) в значительной степени изменяет свойства поверхности, проявляющееся в способности к остеоинтеграции -интефальной характеристики материала, имплантируемого в кость (Dekker RJ. et al., 2005). Особенно большое значение это имеет в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, где изделия из титана широко используются. Однако до настоящего времени не было проведено исследования, в том числе, с использованием количественных критериев, но оценке влияния на заселение, прикрепление, размножение, остеогенную дифференцировку и способность оптимизировать заживление костной раны челюсти, титановых пластинок с различной структурой поверхности. Исследование этих вопросов имеет значение для развития реконструктивной хирургии в челюстно-лицевой области, устранения дефектов лицевого скелета, в дентальной имплантологин. В связи с теоретической и практической важностью разработки этой проблемы были сформулированы цель и задачи работы.
Цель работы Провести в эксперименте сравнительную оценку репаративной регенерации в челюсти под влиянием мезепхпмальпых стромальцых клеток костного мозга, сформированных на поверхности имплантатов из титанового сплава.
Задачи исследования
Определить цитотоксическис свойства имплантатов из титана, подвергнутых фрезерованию, пескоструйной обработке и плазменному напылению титановым порошком по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека, дать их морфологическую характеристику и уровень прикрепления к поверхности имплантатов.
Оценить по количественным критериям способность МСК к пролиферации на поверхности имплантатов из титана с разной структурой поверхности.
Изучить динамику репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы под влиянием титановых имплантатов без культуры МСК.
Изучить динамику репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы под влиянием титановых имплантатов с культурой инактивированных МСК.
Изучить динамику репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы под влиянием титановых имплантатов с культурой живых МСК.
Исследовать динамику репаративной регенерации костного дефекта ветви нижней челюсти кролика прн его закрытии титановым [імплантатом без клеток, с культурой инактивированных и живых МСК.
Провести морфометрический анализ с последующей статистической обработкой цифровых данных динамики репаративной регенерации костного дефекта ветви нижней челюсти кролика при его закрытии титановым имплантатом с культурой инактивированных и живых МСК.
Научная новизна Впервые установлено, что имплантаты из титана, подвергнутые фрезерованию, пескоструйной обработке и плазменному напылению титановым порошком не проявляют цитотоксичсских свойств по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека. Для всех образцов титана зафиксирован высокий уровень прикрепления клегок, все они стимулировали пролиферацию МСК, которые многочисленны и плотно упакованы. Научной новизной отличаются данные о том, что имплантаты из титана с фрезерной обработкой поверхности позволяют МСК активно пролиферировать, а с пескоструйной обработкой и плазменным напылением стимулируют пролиферацию МСК. Репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы в значительно большей степени способствует использование имплантатов с нанесенной на поверхность культурой живых, чем инактивированных МСК. По данным морфологического и морфометрического (планиметрического) исследования пластика дефектов челюстной кости кролика титановыми пластинами с инактивированными МСК не обеспечивает восстановления целостности
кости. Применение пластин с культурой живых МСК -значительно активируют процесс регенерации костной ткани, и приводит к 4-му месяцу к заполнению дефектов ветви челюстной кости костным регенератом. Костная компонент регенерата и его созревание на протяжении всего эксперимента преобладает над сосдинителыю-тканпой компонентой.
Практическая значимость Имплантаты из титанового сплава, подвергнутые пескоструйной обработке или плазменному напылению титановым порошком не проявляют цнтотоксических свойств по отношению к стволовым клеткам, способствуют прикреплению к их поверхности, пролиферации и остсогенной дифференциации. Поэтому данный сплав может быть использован вместе с клеточными технологиями для стимулирования заживления костных дефектов в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Для практического применения представляют ценность данные о том, что в результате применения МСК на носителе из титанового сплава значительно усиливается остеогенная направленность дифференциации прилежащих к имплантату тканевых структур и формирование зрелой костной ткани. С целью реализации современных клеточных технологий в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии необходимо проведение доклинических испытаний с применением количественного морфометрического анализа в динамике рспаративного процесса в костной ткани.
Апробация Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 3-ем Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (ЦИТО, Москва 2007), на IX ежегодном научном форуме «Стоматология 2007», посвященного 45-летию ЦНИИС (ЦНИИС, Москва 2007), 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии», Москва (февраль 2008 г.).
Основные положения, выносимые па защиту
Титановые ммппаитаты с разной структурой поверхности, вызванной фрезерованием, пескоструйной обработкой н плазменным напылением не проявляют цитотоксичеекпх свойств по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека. Для всех образцов титана зафиксирован высокий уровень прикрепления клеток. Имнлантаты из титана с фрезерной обработкой поверхности позволяют МСК активно иролиферировать, а с пескоструйной обработкой и плазменным напылением стимулируют пролиферацию МСК.
Введение в дефект диафиза бедренной кости крысы титановых имплантатов без МСК приводило через 15 суток к формированию грануляционной ткани, подвергающейся созреванию через 30 и 60 суток. В группе с инактивированными МСК вокруг имплантата происходило непродолжительное ускорение образования костных сіруктур и их превалирование над соединительнотканной компонентой регенерата. В группе с «живыми» МСК вокруг пмплантаїа наблюдалось вначале образование остсогенной соединительной ткани с выраженным ангиоматозом, который служил основой для последующего замещения соединительной ткани новообразованными костными структурами.
По данным патоморфологического и морфомстрического (планиметрического) исследования пластика дефектов челюстной кости кролика титановыми пластинами с ннактивированной культурой стволовых клеток не обеспечивает восстановления целостности кости, костные дефекты закрываются грубоволокнистой соединительной тканью. В опытах с имплантацией в область дефектов пластин с культурой живых стволовых клеток процесс регенерации костной ткани активируется и приводит за 4 месяца к заполнению дефекта ветви челюстной кости костным регенератом.
Личное участие
Автором лично изучены свойства поверхности титановых образцов, их цитотоксичность по отношению к фпбробластам и мезенхимальным стромальным клеткам, влияние на их прикрепление и пролиферацию. Цифровые данные автор обработал методами вариационной статистики. Соискателем лично проведены эксперименты на кроликах и изучены гистологические препараты с целью анализа репаратнвных процессов в челюсти под влиянием мсзенхимальных стромальных клеток. Внедрение результатов работы
Полученные данные используются в учебном процессе и в дальнейшей научной работе на кафедре патофизиологии стоматологического факультета и на кафедре госпитальной ортопедической стоматологии МГМСУ. Объем и структура диссертации
Диссертация написана на 158 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, в том числе 19 российских авторов и 127 иностранных. В диссертации представлено 10 таблиц и 84 рисунка.
Применение МСК для повышения интегративных свойств имплантатов при восстановлении костных дефектов
Установлено, что МСК, посаженные на пропитанный апатитом полилактогликолид (PLGA) носитель могут восстанавливать кость в черепных дефектах критических размеров у мышей. Остеогенная способность молодых МСК, выделенных из костного мозга и жировой ткани по данным гистологического и рентгеновского анализов была сходной. В этой работе была показана связь между молодыми остеобластами плотной мозговой оболочки и черепными остеобластами в ходе морфогенеза свода черепа, сращения шва черепа и его окостенения.
Многообещающей альтернативой аутологичных хондроцитов в тканевой инженерии является применение МСК из костного мозга или жировой ткани. Для этого ex vivo использованы ростовые факторы или генетические манипуляции, гипоксическое воздействие (Wang D.W. et al., 2005), изменение гидростатического давления (Angele P. et al., 2003).
Заживление любой костной раны требует определенного количества местных остеопрогениторных клеток. При их недостаточности имплантация остеокондуктивного материала даже с факторами роста может быть недостаточной для оптимального процесса репарации кости. Такая ситуация обычно возникает при лечении крупных костных дефектов, в случае разрастания рубцовой ткани после оперативных вмешательств, при инфицировании или облучении тканей, локальной патологии кости, местном нарушении кровообращения. Нарушение заживления костной раны происходит при сахарном диабете, метаболических заболеваний кости, под влиянием никотина, алкоголя, при использовании ряда фармацевтических препаратов: глюкокортикоидов, химиотерапевтических и др. средств, которые могут ограничивать количество и активность прогениторных клеток. Считается (Amit М., 2000), что даже в тех случаях, когда нет прямых показаний к введению остеогенных клеток, их использование может увеличить скорость формирования и количество образующейся кости.
В случае использования композиций из прогениторных клеток и остеокондуктивных материалов возникает ряд вопросов, требующих своего разрешения. Например, на каком этапе регенераторного процесса необходимо добавлять клетки, и в каком количестве. По мнению Amit М. (2000) целесообразным может быть добавление тромбоцитов, особенно, в начальных фазах формирования костной мозоли, а также моноцитов, Т-лимфоцитов и эндотелиоцитов. Как полагает Hardy М.Н. (1992), МСК модулируют активность роста и дифференцировки эндотелиальных клеток посредством секреции растворимых ангиогенных факторов.
Из потенциальных источников получения МСК только аспирация костного мозга из тазовых костей иглой не требует открытой хирургической процедуры. Однако в результате этой манипуляции из-за разведения периферической кровью концентрация МСК в 20-40 раз ниже, чем при их получении из аутогенной губчатой кости. Это разведение может быть минимизировано, например, центрифугированием (Phinney D.G. et al. 1999; Amit M., 2000), но не полностью исключено.
Другим источником костного мозга может являться губчатая кость. Ее получают методом чрезкожной биопсии, однако, объем ткани при этом, как правило, не превышает несколько кубических сантиметров, а риск кровопотери и хирургических осложнений возрастает (Drummond-Borbosa D., Spradling А., 2001). После выделения МСК их количество наращивают in vitro. За Юдней число клеток может быть увеличено более чем в 2000 раз (Bianco P., Robey P.G., 2001; McKinney-Freeman S.I. et al., 2003).
Использование собственных остеогенных клеток пациента для лечения теоретически может быть реализовано двумя способами. При первом конструкцию имплантируют сразу же после осаждения клеток на подходящий носитель. При втором осажденные на носитель клетки культивируют до формирования на носителе слоя костного матрикса (костного эквивалента) и лишь затем имплантируют. Сравнение этих способов с носителем из пористого гидроксиапатита (Ohta Н., Yomogida К., Dohmae К. et al., 2000) показало, что после имплантации конструкций образование кости de novo происходит раньше и количество ее больше в случае применения имплантатов с костным эквивалентом. В условиях культуры активность пролиферации стромальных клеток костного мозга, полученных от доноров в возрасте старше 50 лет, снижена по сравнению с субъектами моложе (Bjerknes М., Cheng Н., 1999). Кроме того, значительно уменьшается количество случаев, когда вообще наблюдалось костеобразование. Использование дексаметазона увеличивало формирование кости клетками. Но в том же исследовании при подкожной имплантации мышам клеток от доноров разных возрастных групп, осажденных на пористом носителе из фосфатов кальция, было показано, что все они обладают остеогенным потенциалом. Отсутствует отчетливая зависимость пролиферативной активности стромальных клеток костного мозга от возраста донора (Bjerknes М., Cheng Н., 1999).
Введение МСК в область костной раны для ускорения регенерации требует применения носителя, резорбируемого или нерезорбируемого. Образование каркаса для регенерирующей ткани и обеспечение временной механически компетентной основы, а также ускорение процесса репарации являются главными требованиями к носителям, входящим в состав имплантируемых конструкций (Bjomson C.R. et al., 1999; Meng X., 2000; Vallieres L., Sawchenko P.E., 2003). Носителями для доставки МСК в место повреждения могут служить обработанная аллогенная кость; матрикс из очищенного коллагена и/или гиалуроновой кислоты; синтетические полимеры; кальций-фосфатная керамика; биоактивное стекло (Amit М, 2000). Однако эти материалы не всегда обладают достаточно выраженными остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами. Для создания на их основе новых материалов требуются специфические химические модификации поверхности носителя (McKinney-Freeman S.L. et al., 2002), разработка специальных покрытий, добавление адгезивных молекул или факторов роста (Amit М., 2000; Vasioukhin V. et al., 2001; Kha H.T. et al., 2004). При трансплантации клеток в костное ложе необходимо учитывать плотность расположения МСК на носителе (Oshima Н. et al., 2001), а также его проницаемость для питательных веществ и кислорода, что определяется его размерами, структурой материала, количеством и диаметром пор (Amit М., 2000) .
В качестве одного из носителей предлагается аллогенная кость, в ее матриксе содержатся ростовые факторы (инсулиноподобный фактор роста II типа, трансформирующий фактор роста р, факторы роста тромбоцитов и фибробластов, небольшое количество костных морфогенетических белков), которые высвобождаются в процессе ее резорбции. Деминерализация увеличивает биодоступность факторов роста и увеличивает не только остеокондуктивные, но и остеоиндуктивные свойства (Amit М., 2000; Bianchi G. et al., 2003). Замораживание до -20С, а также лиофилизация также снижает ее иммуногенность, хотя и не устраняет ее полностью (Amit М., 2000; O DriscoU S.W. et al., 2001; Terada N. et al., 2002). Несмотря на низкую иммуногенность у многих реципиентов появляются антитела к антигенам донора, свидетельствующие об иммунизации (Amit М, 2000, Ringe J. et al., 2002).
Материалы и методы экспериментального исследования
В опыт было взято 54 крысы (самцы) Вистар весом 180 -220 грамм. Экспериментальные образцы имплантатов были заселены МСК и индуцированы к остеогенной дифференцировке в течение 2 недель. Заселение клеток происходило только на одной стороне имплантата, вторая сторона - контрольная, без клеток.
Имплантаты были изготовлены на Фирме Конмед из титана медицинского назначения, марки Grade 4 ASTM F-67-00. Поверхность имплантата обработана электрокорундом белым (А12Оз) №32 с размером зерна 355-300 мкм.Под гексеналовым наркозом в асептических условиях острыми глазными ножницами делали линейный разрез кожи по задней поверхности бедра, тупым путем раздвигали мышцы, обнажали бедренную кость, фиксировали ее пинцетом, с помощью фиссурного бора толщиной 2 мм делали линейное трепанационное отверстие длиной 5 мм (по размеру имплантата) вдоль середины диафиза (Рис.1) и вставляли в него имплантат так, чтобы он одним краем достигал внутренней поверхности диафиза со стороны костного мозга, а другим краем выступал над наружной поверхностью бедренной кости не более чем на 0,25 мм (рис.2, 3). Поверхность образцов с заселенными клетками была направлена в латеральную (наружную) сторону бедра. Контакт клеток с костью, таким образом, происходил в основном в области кортикального слоя в месте распила бедра. Одной крысе применяли один имплантат. Кожу и мышцы укладывали на место, накладывали швы из шелка. Животных разделили на 3 группы:
в 1-й использованы образцы титанового имплантата без клеток,
во 2-й — с мертвыми (инактивированными этиловым спиртом),
в 3-й - с живыми клетками.
Животных выводили из опыта через 15, 30 и 60 суток после операции. В каждом сроке опыта из одной подгруппы было взято 6 животных, то есть 18 на один срок исследования.
Следует заметить, что время от взятия имплантата из культуральной среды до введения в распил кости не превышало 5-10 сек.
Сроки эксперимента после имплантации 15,30 и 60 суток. Животных выводили из опыта под гексаналовым наркозом, извлекали бедренные кости и фиксировали их в 10% нейтральном формалине. После освобождения от мягких тканей каждую кость с имплантатом фотографировали на цифровом аппарате.
Тканевый материал, полученный из эксперимента, декальцинировали в Трилоне Б и заливали в парафин. Серийные срезы окрашивали гематоксилин-эозином.
Опыты на кроликах,
В эксперимент были взяты 28 половозрелых кролика весом около 3,5 кг, породы шиншилла. Под гексеналовым наркозом у кроликов выстригали шерсть в области края и ветви нижней челюсти справа. С соблюдением правил асептики делали разрез кожи, тупым путем обнажали угол и ветвь челюсти. В области угла челюсти с помощью фрезы, при малых оборотах с постоянным охлаждением физиологическим раствором, создавали круглый дефект диаметром около 8 мм, нижний край челюсти не повреждали (рис.4).
Дефект закрывали одним из имплантатов (рис.5), который фиксировали по краям к кости с помощью титановых шурупов через заранее приготовленные отверстия (рис.6). Имплантат перемещали из культуральной среды к дефекту челюсти в течение 5-10 сек
Мягкие ткани укладывали на место, кожу ушивали рассасывающимися швами. Для профилактики послеоперационных осложнений кроликам вводили антибиотики под кожу в течение трех дней. Рана заживала первичным натяжением.
Состояние поверхности пластин из титанового сплава с разной структурой поверхности и заселенных МСК
Методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что рельеф поверхности образцов из титана зависит от их обработки. После фрезерной обработки поверхность образована параллельными канавками (Рис.7А). После пескоструйной обработки рельеф образца неровный, изломанный (Рис.7Б). В результате напыления титановым порошком рельеф образца титана выглядит более сглаженным с мелкими гранулами в (Рис.7В).
Оценка цитотоксичности образцов с помощью МТТ- теста
Для оценки цитотоксичности образцов металлов фибробласты и стволовые клетки высевали в 24-луночные платы с плотностью 50 тыс. кл./лун. Через 24 часа, когда клетки распластывались, в лунки вносили образцы металлов.
Результаты трех независимых экспериментов представлены для фибробластов человека в таблице 2, в виде относительных оптических плотностей элюата для каждого образца. Результаты для МСК представлены в таблице 3. Контролем служили лунки с клетками без образцов. Показано, что для фибробластов кожи человека и мезенхимальных стволовых клеток человека были получены сходные результаты. Результаты исследования не проявили цитотоксических свойств образцов титана. Эффективность прикрепления клеток к поверхности образцов
В экспериментах по определению эффективности прикрепления клеток к поверхности образцов клетки высевали по 60 тысяч клеток на образец и культивировали в течение 3 дней. При высевании клеток в высокой плотности (60 тысяч/образец) и культивировании в течение короткого промежутка времени мы оценивали свойства образцов служить субстратом для клеток и определить количество живых клеток, удержанных на носителе. При помощи МТТ-теста определяли для каждого образца оптическую плотность элюата, которая прямо пропорциональна количеству клеток. В таблице 4 представлены результаты трех независимых экспериментов по оценке эффективности прикрепления клеток к поверхности образцов. Контролем служили лунки с клетками без образцов. Для сопоставления экспериментальных значений оптической плотности с количеством клеток на образцах была построена калибровочная кривая. Клетки в известном количестве высевали в лунки 24-х луночного планшета. На следующий день проводили МТТ-тест, на основании которого был построен график зависимости оптической плотности элюата от количества клеток. Количество клеток на образцах определяли также визуально путем окрашивания АО, FDA-EtBr, окрашивание флуоресцентными красителями позволило оценить морфологию клеток и плотность заселения клетками образцов. 2, 3 - титан-3 Для всех образцов титана зафиксирован высокий уровень прикрепления клеток, все они стимулируют пролиферацию МСК (за 3 дня культивирования произошло удвоение популяции клеток), и количество клеток на них превышало количество клеток в контроле. Из представленных материалов видно, что на поверхности всех трех образцов титана клетки многочисленны и расположены в виде параллельных или пересекающихся тяжей. На больших увеличениях видно, что МСК, как правило, имеют вытянутую форму. Они плотно упакованы и могут располагаться как параллельно друг другу, так и образовывать сетевидные переплетения различной плотности (Рис.8).
Влияние образцов титана на эффективность пролиферации МСК
В экспериментах по определению эффективности пролиферации МСК на исследуемых образцах клетки высевали по 20 тысяч клеток на образец и культивировали в течение 14 дней.
В результате исследования мы наблюдали общий прирост клеток в лунке и смогли оценить кондиционирующие (или цитотоксические) свойства образца. Количество клеток на образцах определяли также путем окрашивания АО, FDA-EtBr, окрашивание флуоресцентными красителями позволило оценить морфологию клеток и плотность заселения клетками образцов.
Структурная организация регенерата в экспериментально воспроизведенных дефектах ветви нижней челюсти по данным гистоморфологического и гистоморфометрического изучения
В данный раздел включены только результаты исследования репаративнои регенерации ветви нижней челюсти кроликов, полученные в двух группах: группе сравнения (титановые пластины с убитой культурой МСК в дальнейшем именуемой «Контроль») и в основной группе (титановые пластины с живой культурой МСК, в дальнейшем именуемой «Опыт»).
Вначале этого раздела приведем характеристики структурной организации регенерата и терминологию, которая используется в данном разделе.
Характеристика структурных детерминант регенерата
При гистоморфометрическом анализе производили определение площадей вышеприведенных структурных детерминант, полученные показатели отражали удельный вес их площадей относительно площади костного матрикса в целом, какие и служили критериями гистоморфометрической оценки костного регенерата.
Костный матрикс. Эта часть регенерата представлена его костным веществом. Костные лакуны и их содержимое из оценки величины площади костного матрикса исключены (Рис.54, 56).
Пластинчатый костный матрикс. Это дифференцированная часть костного матрикса, образованная костными пластинками, обычно собранными в гаверсовых системах вокруг сосудистых каналов, либо во вставочных системах между остеонами. Исследование пластинчатого костного матрикса даёт представление о выраженности процесса дифференцировки костного регенерата (Рис.56).
Фиброзный костный матрикс. Этот тип костного матрикса относится к более ранней фазе дифференциации костных структур. Костное вещество при этом характеризуется грубоволокнистым строением. На рисунке 57, где пластинчатый костный матрикс выделен более тёмной окраской, пространства между выделенными окраской участками заняты фиброзным костным матриксом.
Низкодифференцированный костный матрикс. Выделение этого типа костного вещества условное и использовано в настоящем исследовании с целью более упрощённой оценки удельного веса площади костного матрикса в участках, находящихся на более ранних стадиях его дифференциации. К этому типу костного матрикса отнесены остеидное вещество, а так же матрикс отдельных незрелых костных трабекул, ещё не организованных в трабекулярные системы (Рис.57).
Костные лакуны. Костные лакуны или костномозговые пространства обычно формируются при образовании в костной части регенерата губчатой костной формации. Их величина и характер соединительной ткани, которую они содержат, до некоторой степени может помочь характеристике интенсивности костеобразовательного процесса в дефекте кости на определённых стадиях развития регенерата.
Фиброзная соединительная ткань в составе костной части регенерата. При гистологическом исследовании гистопрепаратов в составе костного регенерата в некоторых случаях обнаруживаются ощутимые примеси фиброзной соединительной ткани. Обычно она сосредоточена в тяжах, покрывающих новообразованную костную ткань, их присутствие особенно ощутимо в краях костного регенерата, на границе с соединительнотканной частью регенерата. Иногда тяжи соединительной ткани обнаруживаются в костных лакунах, наряду с рыхлой соединительной тканью.
В процессе исследования мы сочли необходимым, учитывая особенности строения разделить костный регенерат на 3 части, центральную и периферические части или 2 края костного регенерата. Было установлено, что эти части костного регенерата имели особенности в своём развитии.
Техника выделения структурных детерминант регенерата
Выделение производили в фотошопе на изображениях с помощью lasso. Количество пикселей выводили по данным гистограмм. Всего в регенератах от 2 животных исследовали 20 изображений. Это давало возможность при оценке достоверности морфометрической оценки соотношения площадей отдельных видов структурных детерминант регенерата использовать в процессе статистической обработки материала выборку из 20 показателей. Выводили средний показатель и стандартное отклонение.
В динамике и при сопоставлении с показателями обеих групп наблюдений определяли достоверность различий (либо их отсутствие) по Т-тесту. Статистический анализ проводили на ПК в программе Ecxel.
Группа сравнения (Контроль) Гнстоморфология Один месяц наблюдений. Костный дефект закрывали титановой пластиной, несущей на поверхности «убитую» этанолом культуру стволовых клеток. В эти сроки наблюдений в костном дефекте обнаруживалась тонкая пластина соединительной ткани, частью имеющая клеточноволокнистое, частью фиброзное строение. Местами она была плотно инфильтрирована лимфомакрофагальными элементами. На значительном протяжении соединительнотканный регенерат приобретал отчётливый грубоволокнистый характер (Рис.58, 60). В центральных отделах регенерата кое-где имелись участки разрыхления и отёка соединительнотканной стромы, которые сопровождали ангиоматоз и диффузная лимфомакрофагальная инфильтрация (Рис.бО).В краях костного дефекта в соединительнотканной основе регенерата отмечалось отложение низкодифференцированного костного вещества, типа остеоида.
Два месяца наблюдений. Центральные участки регенерата были образованы новообразованной костной тканью, а на периферии регенерата - преимущественно, фиброзной соединительной тканью и новообразованной костью (Рис.61, 63). Местами в центральных участках новообразованная костная ткань приобретала вид тонкой пластинки. Костный матрикс здесь был частично представлен пластинчатой субстанцией, частично фиброзным костным веществом. Кое-где отмечалось формирование остеонных структур (Рис.63, 65). Грубоволокнистый тяж на периферии регенерата иногда имел значительную ширину (рис. 66)
Четыре месяца наблюдения. Регенерат в эти сроки эксперимента имел преимущественно костное строение, лишь по краям обнаруживались участки представленные грубоволокнистой соединительной тканью (Рис.66).
Центральная часть регенерата на значительном протяжении была построена из новообразованной костной ткани, которая имела вид преимущественно тонкой пластины с отдельными костными лакунами (Рис.67). Снаружи (со стороны имплантата) костная пластина была покрыта тонким слоем клеточноволокнистой соединительной ткани (Рис.68).
В костной пластине регенерата в центральных его отделах местами имелись перерывы, заполненные рыхлой и клеточноволокнистой соединительной тканью (Рис.69).
