Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Применение клеточных технологий для повышения эффективности остеопластических материалов 11
1.1 Остеопластические материалы на основе коллагена и кальций-фосфатных соединений, используемые для оптимизации репаративного остеогенеза 11
1.2 Исследование свойств остеопластических материалов на модели длительных культур костного мозга 21
1.3 Использование мезенхимальных стволовых клеток совместно с остеопластическими материалами для клеточной терапии 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Методы исследования свойств материалов на модели длительных культур костного мозга 42
2.2. Методика заселения и изучения свойств мезенхимальных стромальных клеток на остеопластических материалах 44
2.3. Методика изучения репаративной регенерации нижней челюсти кролика под влиянием материалов Гапкол и Индост с МСК 49
Глава 3. Репаративные процессы в ветви нижней челюсти кроликов при использовании модифицированных остеопластических материалов, заселенных мезенхимальными стволовыми клетками (Собственные исследования) 51
3.1. Исследование свойств остеопластических материалов на модели длительных культур костного мозга 51
3.2. Влияние остеопластического материала Гапкол в двух модификациях на цитотоксичность, пролиферацию и дифференцировку
фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток человека 57
3.2.1. Рельеф поверхности образцов исследуемых материалов 58
3.2.2. Характеристика CD-профиля выделенных МСК 59
3.2.3. Оценка цитотоксичности образцов с помощью МТТ- теста 59
3.2.4. Определение эффективности прикрепления клеток к поверхности образцов 62
3.2.5. Оценка влияния образцов на эффективность пролиферации МСК 65
3.3. Заживление костного дефекта челюсти при использовании Гапкола и Индоста с нанесенными на поверхность мезенхимальных стволовых клеток 70
3.3.1. Гапкол без вакуумной обработки и без НБК (1-я контрольная группа) 70
3.3.2. Применение Индоста без вакуумной обработки с НБК (2-я контрольная группа) 75
3.3.3 Применение Индоста с вакуумной обработкой и НБК (3-я контрольная группа) 82
3.3.4. Применение Индоста с вакуумной обработкой, НБК и нанесенной на поверхность культурой МСК (основная группа) 87
Глава 4. Обсуждение результатов и заключение 92
Заключение 100
Выводы 102
Практические рекомендации 104
Список литературы 105
- Остеопластические материалы на основе коллагена и кальций-фосфатных соединений, используемые для оптимизации репаративного остеогенеза
- Исследование свойств остеопластических материалов на модели длительных культур костного мозга
- Методы исследования свойств материалов на модели длительных культур костного мозга
- Исследование свойств остеопластических материалов на модели длительных культур костного мозга
Введение к работе
Актуальность
В настоящее время в практической медицине, а именно в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и травматологии, используются резорбируемые и биостабильные композиционные материалы для замещения костных дефектов после травмы, удаления опухолей, устранения врожденных и приобретенных дефектов (М.Ш.Мустафаев и соавт., 1998, 2000; С.Г.Курдюмов и соавт., 2000; А.М.Воложин, В.С.Агапов и соавт. 2000). Среди резорбируемых остеопластических материалов большое распространение получили композиты, образованные из коллагена и синтетического минерального компонента, гидроксиапатита и трикальцийфосфата. К ним относится серия материалов: Колапол, Гапкол, Коллапан, производимые фирмами «Полистом» и «Интермедапатит». Эти материалы обладают высокой степенью биосовместимости, технологичны при изготовлении, имеют по сравнению с импортными аналогами невысокую стоимость, но не уступают им в качестве и остеопластических свойствах. В механизме остеопластического действия этих материалов основная роль принадлежит их остеокондуктивным свойствам, что способствует хорошей интеграции с костной тканью. Недостатком материалов является низкая способность инициировать построение костной ткани из-за отсутствия специфических стимуляторов-остеоиндукторов (морфогенетических ' белков и др.). В связи с этим продолжительность реабилитации пациентов после оперативного вмешательства, у некоторых пациентов (особенно при наличии общесоматических заболеваний: сахарный диабет, другие эндокринопатии, гипертоническая болезнь и т.д.) отличается длительностью и, кроме того, повышается риск послеоперационных осложнений. С целью придания этим материалам свойств инициировать построение костной ткани в их состав вводят компоненты межклеточного
5 матрикса: гиалуроновую кислоту и хондроитинсульфат (В.В.Сарычев, 2005; И.С. Мальгинова, 2005). Важная позитивная роль может принадлежать также неколлагеновым костным белкам, которые выделены в чистом виде и испытаны в. эксперименте в составе составе остеопластического материала. Этот материал под названием «Пластины коллагеновые с гидроксиапатитом остеоиндуктивные "ИНДОСТ" ВФС 01032006/4599-06 от 22.12.2006» разрешены к клиническому применению в стоматологии.
Дальнейшее совершенствование свойств остеопластических материалов может быть осуществлено при использовании новой биотехнологии, позволяющей сформировать на поверхности биосовместимых резорбирующихся композитов слой костных клеток из* клеток — предшественников костного мозга. Костные клетки- сами являются источником специфических факторов костного морфогенеза. Использование этих технологий в дальнейшем может существенно снизить, риск осложнений и сократить период реабилитации, пациентов после оперативного устранения дефектов костей лица и челюстей, а также других костей скелета, особенно в случае' нарушенного заживления костной раны при иммунодефицитных состояниях и общесоматических заболеваниях. Исследований по применению биорезорбируемых композитных материалов заселенных остеопрогениторными клетками, полученными из мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, проведено не было, что послужило основанием для формулирования цели , и задач*данной работы.
Цель работы: в лабораторных условиях и экспериментально обосновать эффективность применения^ неколлагеновых белков кости в составе остеопластического материала Гапкол, модифицированного вакуумной обработкой и с культурой мезенхимальных стволовых клеток для оптимизации репаративной регенерации челюстной кости.
Задачи
Оценить в длительных культурах костного мозга декстеровского типа динамику кроветворения на поверхности образцов остеопластических материалов: Гапкол, Коллаген и Пародонкол.
Определить возможность применения образцов Гапкола, модифицированного вакуумной обработкой и содержащего неколлагеновые белки кости, для длительного культивирования в среде, содержащей мезенхимальные стволовые клетки.
Изучить влияние материала Гапкол на цитотоксичность, пролиферацию и дифференцировку фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток человека.
Определить влияние Гапкола без вакуумной обработки и не содержащего неколлагеновые белки кости, внесенного в костную рану ветви нижней челюсти кролика, на репаративную регенерацию. і
Оценить, как влияет Гапкол с вакуумной обработкой и содержащий неколлагеновые белки кости на построение костной ткани, ветви нижней челюсти кролика.
Определить особенности репаративного остеогенеза в ветви нижней челюсти кролика при внесении в костную рану Гапкола, содержащего неколлагеновые белки кости с мезенхимальными стволовыми клетками на поверхности.
Положения, выносимые на защиту
1. Формирование на образцах Гапкола преимущественно стромальных, чем кроветворных клеток при культивировании в длительной культуре костного мозга декстеровского типа. Образцы Гапкола и Индоста подвергнутые вакуумной обработке и содержащие НБК не могут быть культивированы более 3-х дней вследствие перехода клеток в суспензию, содержащую мезенхимальные стволовые
7 клетки. Малое количество клеток на поверхности Гапкола и Индоста дает ложное представление о токсичности материала, так как МСК быстро переходят в культуральную среду с разрушающегося материала. Быстрая деструкция материала в условиях культивирования не позволяет клеткам пролиферировать и подвергаться остеогенной дифференцировке. 3-. Внесение в костную рану ветви нижней челюсти кролика Гапкола без вакуумной обработки, не содержащего НБК, вызывает умеренные воспалительные и воспалительно-деструктивные процессы.Внесение в костную рану ветви нижней челюсти кролика Индоста с вакуумной обработкой и содержащего НБК вызывает усиление построения костной ткани. Нанесение МСК на поверхность Гапкола, содержащего неколлагеновые белки кости, вызывает более высокую активность остеогенетических процессов в челюсти и интенсификацию процессов созревания новообразованной костной ткани.
Научная новизна Впервые установлено, что. в декстеровской культуре костного мозга на образцах остеопластического материала Гапкол формируется значительно больше стромальных, чем кроветворных клеток. Научной новизной отличаются данные о том, что Индост, подвергнутый вакуумной обработке и содержащий неколлагеновые белки кости, не может быть длительно культивирован вследствие нестойкости материала и быстрого разрушения в жидкой среде. Деструкция образцов Гапкола и Индоста в условиях культивирования- не позволяет мезенхимальным стволовым клеткам пролиферировать. на материале и подвергаться остеогенной дифференциации. Введение в состав Индоста неколлагеновых белков кости повышает его остеогенетический потенциал при репаративной регенерации нижней челюсти только после удаления летучих соединений с помощью вакуумной обработки материала. Заселение МСК Индоста,
8 содержащего НБК, вызывает слабые проявления воспалительно-деструктивных реакций, повышает активность остеогенетических процессов и способствует созреванию новообразованной костной ткани.
Практическое значение
Оценка динамики кроветворения в длительных культурах костного мозга на поверхности Гапкола является важным этапом для оценки их биосовместимости. Преобладание на материалах Гапкол формирования стромальных клеток над кроветворными клетками характеризует его остеопластический потенциал. Вакуумная обработка материала Гапкол с целью удаления остатков уксусной кислоты и формальдегида является необходимым условием для проявления активности, введенного в состав материала неколлагеновых белков кости. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток на Индосте, модифицированном вакуумной обработкой и содержащим неколлагеновые белки кости, может продолжаться не более 3-х дней из-за нестойкости материала в жидкой среде и не позволяет проведение'остеогенной дифференциации. Заселение поверхности Гапкола, содержащего НБК, мезенхимальными стволовыми клетками уменьшает проявления воспалительно-деструктивных реакций, повышает активность остеогенетических процессов и усиливает процессы созревания новообразованной костной ткани.
Предложения по использованию результатов исследования
Полученные данные используются в учебном процессе и в дальнейшей научной работе на кафедре патофизиологии стоматологического факультета МГМСУ и на кафедре госпитальной терапевтической стоматологии.
9 Объем и структура диссертации
Диссертация написана на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, в том числе 74 российских автора и 102 иностранных. В диссертации представлено 7 таблиц и 30 рисунков.
Апробация работы*
Основные положения и результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на совместном совещании сотрудников кафедры патофизиологии стоматологического факультета, госпитальной терапевтической стоматологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава, 20 марта 2008 года.
Опубликованные работы
1. Мальгинов Н. Н., Фионова Э. В., Ожелевская С. А., Чапель А. А/
Клеточные технологии в оценке биосовместимости остеопластических
материалов. // Материалы третьей международной конференции «болезни
цивилизации в аспекте учения В. И. Вернадского. Москва, 10-12 октября
2005 год, М, 2005, С. 238-240.
2. Воложин А.И., Мальгинова И.С, Лебедев В.Г., Фионова Э.В., Воложин
Г.А., Чепель А.А. Оценка биосовместимости, остеопластических
материалов с использованием длительных культур костного мозга.
Российский стоматологический журнал // 2005, №3, С 17-19.
3. А.И.Воложин, М.О.Бондаренко, А.В.Фионова, С.А. Ожелевская.
Применение иммуномодулятора Полиоксидония совместно в
неколлагеновыми белками кости для ускорения регенерации челюсти при
иммунодефицитном состоянии в эксперименте. Патологическая
физиология и экспериментальная терапия. 2007, №1, С 27-28.
С. А. Ожелевская, А. С. Григорян, К. С. Десятиченко, В. Н. Матвеева, Р. А. Дружинина, Э. В. Фионова, А. Н. Гурин, К. Г. Караков Оптимизация регенерации челюсти с помощью неколлагеновых белков кости в составе материалов «Гапкол» в эксперименте // материалы 9-го ежегодного научного форума «Стоматология 2007», посвященного 45-летию ЦНИИС. С 291-292
Фионова Э. В., Десятниченко К. С, Докторов А. А., Воложин А. И., Репаративные процессы в нижней челюсти кроликов при использовании остеопластического материала ИНДОСТ пластины с мезенхимальными стромальными клетками. Cathedra. - 2008. - Т. 7 . - № . 1- С. 16-20.
Остеопластические материалы на основе коллагена и кальций-фосфатных соединений, используемые для оптимизации репаративного остеогенеза
Остеопластические материалы широко используются для оптимизации репаративного остеогенеза в травматологии, ортопедии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. В реконструктивной хирургии особенно большое распространение получили биогенные материалы на основе коллагена и минеральных наполнителей, главным образом, гидроксиапатита (ГА) и трикальцийфосфата (ТКФ), что обусловлено бурным развитием передовых технологий, разработкой новых материалов и совершенствованием методов их исследования. Синтетические материалы отличаются отсутствием токсичности и безопасностью с точки зрения возможности инфицирования пациента. В их состав можно вводить остеоиндуктивные и др. факторы, они легко стерилизуются и хорошо хранятся. Минеральные биосовместимые фосфорно-кальциевые соединения вводят в состав материалов животного происхождения, одним из наиболее популярных является коллаген.
Коллаген не токсичен, обладает слабой антигенной активностью, образует комплексы с лекарственными веществами и биостимуляторами, что позволяет его использовать для оптимизации регенерации тканей (Н.И. Бажанов, 1984; А.П. Безрукова, 1987; T.D. Taylor et al., 1988; D.R. Mehlisch et al., 1988). Отсутствие токсичности и высокая биосовместимость ГА (В.В. Паникаровский и др., 1992; А.С. Григорьян и др., 1992; О.А.Каширина, 1994), высокое сродство к костной ткани позволяет изготавливать из ГА пористую керамику, которая легко интегрируется с формирующимися костными структурами (М. Weinlander et al., 1987). Для практического применения ГА используют в виде порошка, гранул и блоков, в необожженном виде или в форме высокотемпературной керамики (А.С. Григорьян и др., 1992; R.E. Holmes, Н. Hegitr, 1987; Е.М. Deeb, М. Roszhoulski, 1988). Подсаженная в костные дефекты керамика ГА, выполняет роль механической опоры и кондуктивную функцию, благодаря которой на поверхности материала формируются костные структуры (В.Д. Пономарев, 1982; В. Kasemo, 1983). Керамика полностью интегрируется с костью, ее трабекулы врастают в поры имплантата, соединительно-тканные прослойки тонкие и быстро замещаются костной тканью (А.И. Воложин и др., 1996; Григорьян А.С. и др., 2000; O.R. Beirne, J.S. Greengpan, 1985; F.O. Tio et al., 1987). Керамические материалы без пор слабее интегрируется с костью (Е.М. Deeb, М. Roszhoulski, 1988).
Различные формы ГА использовали для замещения костных дефектов челюстей после удаления кист (М.Б. Бойматов и др., 1993; G.F. Parabita et al., 1985; J. Brinks et al., 1987; M. Weinlander et al., 1987; J. Hidding, A. Hemprich, 1988). Т.К. Хамраев (1994) в эксперименте и клинике обосновал эффективность применения гранулята ГА для замещения дефектов костной ткани челюсти человека. К.Т. Тулеулов (1989), J.W. Frame et al. (1987), М. Nagase et al. (1989). G.M. Kramer et al. (1989) предложили для заполнения костных дефектов и пластики альвеолярного отростка использовать ГА в комбинации с брефоостеопластом или тонкоизмельченной і аутокостью. При лечении пародонтита и реконструктивных операциях на альвеолярных гребнях, коррекции вертикальной дистопии глазницы использовался ГА в виде гранул (Т.Д. Чиркова, 1990; Е.Г. Сабанцева, 1993; Ю.М. Максимовский и др., 1993; Р. Mercier, 1988; I.M. Brook, D.S. Lamb, 1988).
ГА выпускается разными фирмами. Широко используется ГА, синтезируемый ЗАО НПО «Полистом» (фирменное название Гидроксиапол, сокращенно ГАП). Препараты на основе ГАП и коллагена прошли доклинические и клинические испытания и рекомендованы Фармкомитетом РФ для клинического применения, разрешены приказом Минздрава РФ для медицинской практики, они по качеству удовлетворяют требованиям международного стандарта (ISO) (С.Г. Курдюмов и др., 2000). ГАП используется для заполнения костных полостей после резекции верхушки корня зуба, цистэктомии; в качестве компонента паст для пломбирования каналов корней зубов; включены в состав комбинированных трансплантатов, а также гемостатических и ранозаживляющих препаратов (А.И. Воложин и др., 1993; 1996; 0.3. Топольницкий, 1994; И.А. Романов и др., 1996; А.С. Григорьян и др., 1996), вводится в состав искусственных заменителей костной ткани (А.И.Воложин и др., 1996; 1999 а, б).
Композиции ГАП с коллагеном имеют разный состав и выпускаются под общим названием «Колапол (КП, КП-2, КП-3 и др.», «Гапкол», «Пародонкол» (А.И. Воложин и др., 1994). Их используют для остановки кровотечения у больных, страдающих гемофилией и других болезнях системы крови, сопровождающихся кровоточивостью. Колапол удобен для применения в полости рта, при операциях в условиях поликлиники. Материал использован у больных с гемангиомами лица, шеи и органов полости рта, поликлинических вмешательствах на челюстных костях, а также в операциях на желудке (А.И. Воложин и др., 1993; В.К. Леонтьев, А.И. Воложин и др., 1995; Э.В. Луцевич, Ю.Н. Андреев и др., 1996; С.Г. Курдюмов и др., 2000). Ф.А. Алимерзоев (1998) разработал методику применения препарата Колапол при заполнении костных полостей после операции цистэктомии с резекцией верхушки корня. ГАП-содержащие коллагеновые препараты были применены для оптимизации репаративных процессов в костной ткани нижней челюсти у больных хроническим алкоголизмом (А.В. Лепилин и др., 1998).
Отечественные материалы, обладающие мембранными свойствами, объединяют в себе свойства ГАП-содержащих препаратов типа Колапол, Гапкол и медленно резорбируемой коллагеновой мембраны - Пародонкол, которая-выполняет барьерную функцию при регенерации тканей (Воложин А.И., Гемонов В.В., Рогинский В.В., 1998)
Исследование свойств остеопластических материалов на модели длительных культур костного мозга
Эффективное применение остеопластических материалов в медицине проводится путем изучения процессов взаимодействия композиционных материалов и костной ткани, их остеоиндуктивных свойств, взаимного влияния материалов и костномозгового кроветворения. Широкие возможности для этих исследований представляет использование методов in vitro, которые позволяют оценить клеточные и гуморальные механизмы биодеградации материалов, а также изучать механизмы индукции остеогенеза. Рассмотрим вопросы поведения композиционных материалов в биологических средах и их взаимодействие с окружающими клетками, данные о клеточной и гуморальной регуляции кроветворения, роли стромального микроокружения в формировании костномозговых клеток.
Кость состоит из органических и неорганических компонентов в соотношении 1: 3 по массе и 1: 2 по объему. Органическая фаза содержит коллаген I типа и небольшие количества неколлагеновых белков, кислых гликопротеинов, сывороточных белков и протеогликанов. Основной частью неорганической фазы кости являются гидроксиапатит и трикальцийфосфат. Кальцийфосфатные материалы (КФМ) имеют хорошие биосовместимые свойства по тестам цитотоксичности, гиперчувствительности и канцерогенности (J.E. Lemons, 1990). Имеются данные, что in vitro остеобласты из первичной костной культуры в течение 2 недель заселяют пористую гидроксиапатитную керамику и секретируют компоненты экстраклеточного матрикса (F.B. Bagambisa, U. Joos, 1990; I.M. Brook et al., 1991; CM. Serre et al., 1992).
Скорость резорбции КФМ зависит от физико-химических характеристик самого материала (химический состав, структура пористости, топография поверхности, соотношение аморфной и кристаллической фаз, размер частиц и кристаллов, из которых изготовлена керамика), а также рН среды, клеточного состава и структуры экстрацеллюлярного матрикса окружающей имплантат ткани (G. Daculci et al., 1990; R.Z. LeGeros et al., 1992). Биодеградация КФМ происходит с участием процессов химического растворения и клеточно-опосредованной резорбции (A.J. Tofe et al., 1993). В первые часы после имплантации материала развивается воспаление, различные клетки вторгаются в участок хирургического вмешательства и энергично фагоцитируют детрит погибшией ткани, а также атакуют поверхность КФМ. В этом процессе участвуют остеокласты, многоядерные остеокласто подобные клетки, нейтрофилы, макрофаги, остеобласты, фибробласты, синовиальные клетки (Eggli et al., 1988; J.E. Lemons, 1993).Активация указанных клеток может иметь отношение к природе остеолизиса при воспалительных процессах, протекающих на границе имплантата с костной тканью (N.A. Athanasou et al., 1992). В зоне микроокружения имплантата обнаруживается закисление среды за счет протекания анаэробных метаболических процессов во взаимодействующих клетках.
В зависимости от физических размеров материалов их биодеградация протекает экстраклеточно или внутриклеточно. Показано, что частицы гидроксиапатита размером от 5-6 мкм и меньше фагоцитируются нейтрофилами и эндотелиальными клетками с образованием активных форм кислорода (АФК) (P.M. Hyvonen, MJ. Kowolik, 1991; G.E. Falasca et al.,1993). Адгезия нейтрофилов на более крупных кристаллах керамики также приводит к активации продукции АФК (P. Leanderson, С. Tagesson, 1992). В результате активации фагоцитоза фрагментов материалов, макрофагами продуцируются различные регуляторные белкы (W.H. Alwan, 1989), в частности стимуляторы функциональной активности остеокластов (интрлейкин-1), а также ферментов (коллагеназа) (N. Al-Saffar, Р.А. Revell, 1993). Этот процесс может объяснять активацию резорбции костной - ткани (остеолизис) в пограничной с материалом зоне. Фагоцитоз частиц часто приводит к повреждению мембранного аппарата клеток и аутолизу. Образуемый в результате гибели клеток детрит повторно фагоцитируется макрофагальными клетками и способствует продукции ими цитокинов (М. Spector et al., 1989). Цитокины в свою очередь могут стимулировать рост фибробластов и секрецию ими белков экстраклеточного матрикса, которые являются необходимым компонентом для формирования фиброзной капсулы вокруг имплантата (И.А. Щепеткин, 1994).
Образование интерфазы между КФМ и костью тесно связано с процессами растворения материала. Одновременно с динамическими процессами растворения из костного ложа в поры керамики мигрируют остеобласты. Предполагается, что на рекрутирование остеогенных клеток положительное влияние оказывают процессы растворения КФМ (Р.
Ducheyne et al., 1990). Остеобласты секретируют гликозаминогликаны, протеогликаны, остеопонтин и другие компоненты экстраклеточного матрикса, которые адсорбируются на образованном ранее слое карбонат апатита и проникают в микропоры имплантата (J.D. De Bruijn et al., 1991). Эти молекулы, по-видимому, являются центрами нуклеции образующихся минеральных отложений, имеющих гранулярную структуру и формирующих на поверхности КФМ электронно-плотный слой толщиной 1 мкм. Впоследствии к этому слою прикрепляются волокна коллагена из матрикса кости. Особенно хорошо коллагеновые волокна связываются с остеопонтином (J.M. Sautier et al., 1992; J.D. De Bruijn, 1993).
Белки служат прекрасным субстратом для адгезии новых костных клеток (СМ. Serre et al., 1992). Остеобласты прикрепляются к поверхности гидроксиапатита за счет фокальных контактов плазматической мембраны (D.A. Puleo, R. Bizios, 1992). Молекулярный механизм адгезии остеобластов сходен с таковым, описываемым для остеокластов: интегриновые рецепторы клеток взаимодействуют с пептидной последовательностью Арг-Гли-Асп-Сер, содержащейся в адсорбированных на поверхности имплантата белках (R. Bizios, 1994). Дальнейшая преципитация кальцийфосфатных соединений приводит к минерализации коллагеновых волокон, проникающих как в кость, так и в пористую поверхность КФМ, к образованию прочной связи имплантата и кости (J. Ganeles et al., 1986; R.Z. LeGeros et al., 1992).
Методы исследования свойств материалов на модели длительных культур костного мозга
Эксперименты выполнены с использованием костного мозга мышей (С57В1/6 х СВА) F1 массой 18-24 г, поставляемых питомником РАМН «Столбовая». Длительные культуры костного мозга декстеровского типа вели, как описано ранее /Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я., 1977/. Костный мозг одной бедренной кости мышей без суспендирования помещали в 10 мл полной среды на основе среды Фишера, обогащенной L-глютамином, 14% лошадиной сыворотки, 6% эмбриональной телячьей сыворотки, 10" М гидрокортизона и антибиотиками. Культуры вели при температуре 33 С в пластиковых флаконах (площадь дна 25 см ) с еженедельной сменой половины культуральной среды.
Через 3 недели культивирования, когда на дне флакона образовывался нормально функционирующий стромальный подслой, проводили изучение процессов кроветворения на материалах, помещенных в длительные культуры костного мозга. Исследовано и проведено сравнение следующих видов материалов по группам: 1. Гапкол. 2. Коллаген сшитый (в виде пленки). 3. Мембрана «Пародонкол».
Образцы материалов были прямоугольной формы, площадью около 1,5-2 см . Материалы сначала помещали в чашки Петри диаметром 35 мм, на их поверхность наносили костный мозг в концентрации 1,5х106 клеток на мл среды. После этого инкубировали в течение 30 минут при температуре 37 С. Затем материалы переносили в культуральные флаконы, содержащие 3-недельные длительные культуры костного мозга, и помещали в термостат для дальнейшего культивирования. Через 7, 14, 21 и 28 суток культивирования из флаконов извлекали образцы и проводили исследование клеточного состава адгезирующего слоя. Было взято по 3 образца каждого материала на каждый срок исследования. Для снятия клеток с материалов использовали раствор трипсина в концентрации 0,02% в сочетании с 0,02 % раствором ЭДТА. Для изучения морфологического состава костного мозга, снятого с материалов, раствор с клетками центрифугировали 10 минут при скорости 1500 оборотов в минуту. Затем клетки промывали раствором Хенкса и повторно центрифугировали. После центрифугирования сливали надосадочную жидкость и из осажденных на дне пробирки клеток приготавливали мазки-отпечатки, которые окрашивали по методу Паппенгейма, и подсчитывали миелограммы.
С целью оценки интенсивности процессов кроветворения на различных по составу образцах материалов, перед приготовлением мазков для морфологических исследований,, под микроскопом в камере Горяева подсчитывали общее количество клеток костного мозга в суспензии. После снятия клеток измеряли размер каждого образца с точностью до 1 мм, вычисляли площадь поверхности, а затем результаты оценки количества клеток на образцах рассчитывали на 1 см" их поверхности. Абсолютные значения содержания стромальных и кроветворных клеток на исследуемых образцах получали расчетным путем, на основании значений общего количества клеток, снятых с 1 см поверхности материалов, и процентного содержания стромальных и кроветворных клеток, определенных при подсчете миелограмм.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Различие между группами считали достоверными при t 2 и р 0,05.
Исследование свойств остеопластических материалов на модели длительных культур костного мозга
В- таблице 1 представлены данные по изменению процентного содержания различных клеточных популяций, а в таблице 2 — данные по изменению числа клеток на материалах Гапкол, Коллаген и Пародонкол.
, Как видно из таблиц, на материале Гапкол с увеличением времени культивирования происходило постепенное увеличение количества клеток, в основном за счет стромальных клеток. Так, если через 7 суток культивирования общее число клеток на 1 см поверхности составляло 135,0 х 103, то через 28 суток культивирования оно возрастало до 415,0 х 103. Содержание кроветворных клеток оставалось на достаточно постоянном уровне. Число стромальных клеток увеличивалось с 28,4 х 10 до 327,8 х 103, а количество кроветворных клеток составляло, соответственно, 106,6 х 103 и 87,2 х 103.
При оценке морфологического состава клеток на Гапколе было установлено, что процентное содержание стромальных клеток через 21-28 суток, по сравнению с 7-ми сутками увеличивалось в основном за счет ретикулярных клеток и фибробластов (табл.1).
Материал «Коллаген» не набухал и не терял упругости, сохранял форму, структуру и не разрушался. Были получены четкие данные по изменению общего содержания клеток на материалах и определены изменения морфологического состава клеток на протяжении 4 недель культивирования.
Как видно из таблиц, в течение 28 суток с увеличением времени культивирования происходило постепенное увеличение количества клеток на материале, в основном за счет стромальных клеток. Содержание кроветворных клеток изменялось незначительно. Так, если через 7 суток культивирования общее число клеток на 1 см поверхности составляло 92,1 х 10 , то через 28 суток культивирования оно возрастало до 152,5 х 10 . Число стромальных клеток увеличивалось с 9,2 х 10 до 56,3 х 10 , а количество кроветворных клеток составляло, соответственно, 82,2 х 10 и 96,2x103.
При оценке морфологического состава клеток на материале «Коллаген» было установлено, что процентное содержание стромальных клеток через 21-28 суток, по сравнению с 7-ми сутками увеличивалось в основном за счет ретикулярных клеток и фибробластов.
При изучении образцов материала Пародонкол было установлено, что они в условиях культивирования в течение 28 суток не теряли упругости, сохраняли форму, структуру и не разрушались. Были получены четкие данные по изменению общего содержания клеток на мембранах и определены изменения морфологического состава клеток на протяжении 4 недель культивирования.
Как видно из таблиц 1 и 2, в течение 28 суток с увеличением времени культивирования происходило постепенное возрастание количества клеток на Пародонколе, в основном за счет стромальных клеток. Содержание кроветворных клеток изменялось незначительно. Так, если через 7 суток культивирования общее число клеток на 1 см поверхности составляло 128,0 х 103, то через 28 суток культивирования оно возрастало до 242,5 х 103. Число стромальных клеток увеличивалось с 24,3 х 103 до 150,4 х 103, а количество кроветворных клеток составляло, соответственно, 103,7 X 10 и 92,1x103.
При оценке морфологического состава клеток на материале Пародонкол было установлено, что процентное содержание стромальных клеток через 21-28 суток, по сравнению с 7-ми сутками увеличивалось в основном за счет ретикулярных клеток и фибробластов (табл.1). Вместе с тем, ранее было отмечено, что в механизме регенерации костной ткани в условиях применения метода направленной регенерации важная роль принадлежит клеточным взаимодействиям, в том числе, участию фибробластов тканей десны, которые мигрируют и покрывают барьерные материалы (Payne et al., 1996).
На рисунках 1, 2 и 3 результаты сравнительного изучения свойств материалов Гапкол, Коллаген и Пародонкол при оценке костномозгового кроветворения в длительных культурах представлены графически. Показано, что на материале Гапкол отмечалось значительно больше стромальных: клеток в период с 14 по 28 сутки культивирования, по сравнению с материалами Коллаген и Пародонкол. Возможно, это связано с наблюдавшимся частичным нарушением целостности мембран Гапкол.
Коллаген и Пародонкол более стабильно сохраняли структуру,, упругость и не разрушались, на них хорошо развивалось кроветворение.
Полученные данные о числе и.морфологическом составе клеток на материалах Гапкол, Коллаген и Пародонкол в течение 4 недель культивирования свидетельствуют о хорошем развитии на всех материалах кроветворных клеток, что отражает интенсивное развитие кроветворного микроокружения, которое может быть тесно связанного с остеогенной способностью І клеток-предшественников,. и играет важную роль в механизме регенерации костной ткани:
На основании проведенных экспериментов по изучению изменении числа стромальных и,кроветворных клеток, развивающихся;на мембранах, в. условиях культивирования в течение 4 недель, было установлено, что,; мембраны f не вызывали, отрицательных реакций и не оказывали ингибирующего влияния на рост клеток, костного мозга. Наблюдалось постепенное возрастание числа клеток, отмечалось нормальное кроветворение и образование молодых и зрелых гранулоцитов. Эти данные могут свидетельствовать о- хорошей биосовместимостйі исследованных материалов, что является важным фактором так как вне зависимости от состава и технологии приготовления, материалы для костной пластики должны, обладать.определенными свойствами, такими.как,безвредность и способность медленно резорбироваться с замещением на костную ткань. Образцы Пародонкола: хорошо сохраняли свою структуру и форму и вполне соответствуют, требованиям, предъявляемым к биомембранам для направленной регенерации костной ткани.
