Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Кальцийфосфатные материалы, используемые в костной пластике 9
1.1. Молекулярные механизмы перестройки и регенерации костной ткани .. 9
1.2. Применение композиций коллагена и кальцийфосфатной керамики в стоматологии для оптимизации репаративного остеогенеза 17
1.3 Применение декстеровской культуры костного мозга для оценки биосовместимости и остеоинтегративных свойств остеопластических материалов 23
Глава 2. Материалы и методы исследования 32
2.1. Методика оценки свойств остеопластического материала с помощью декстеровской культуры костного мозга 32
2.2. Материал и методы количественной оценки репаративной регенерации теменной кости под влиянием остеопластического материала Гапкол в разных модификациях 34
2.3. Материал и методы оценки репаративной регенерации челюстной кости под влиянием остеопластического материала Гапкол в разных модификациях 36
Глава 3. Свойства остеопластического материала Гапкол модифицированного введением НБК и вакуумной обработкой, на модели длительной культуры костного мозга 38
Глава 4. Сравнительная характеристика эффективности остеопластического материала Гапкол и его модификаций с неколлагеновыми белками кости 49
4.1 Количественная оценка репаративной регенерации костной ткани под влиянием остеопластического материала Гапкол в разных модификациях (на модели теменной кости крысы) 49
4.2. Репаративная регенерация челюстной кости под влиянием остеопластического материала Гапкол с НБК в разных модификациях (экспериментально-морфологическое исследование) 77
Глава 5. Обсуждение результатов исследования 96
Выводы 104
Практические рекомендации 106
Список литературы 107
- Молекулярные механизмы перестройки и регенерации костной ткани
- Методика оценки свойств остеопластического материала с помощью декстеровской культуры костного мозга
- Свойства остеопластического материала Гапкол модифицированного введением НБК и вакуумной обработкой, на модели длительной культуры костного мозга
- Количественная оценка репаративной регенерации костной ткани под влиянием остеопластического материала Гапкол в разных модификациях (на модели теменной кости крысы)
Введение к работе
Актуальность проблемы
С целью возмещения костных дефектов в стоматологической и травматологической практике широкое распространение получили материалы, содержащие гидроксиапатит, трикальцийфосфат и коллаген, которые обладают умеренными остеоиндуцирующими свойствами (Воупе PJ.,1999. Щепеткин И.А., 1999). Этот эффект обусловлен способностью фиксировать из крови факторы роста, которые стимулируют остеогенез. Свойствами факторов роста обладают также некоторые неколлагеновые белки костной ткани (НБК), которые фиксируются в ткани в процессе репаративного остеогенеза (Десятниченко К.С. 1999, 2000). Среди НБК имеются такие белки как трансформирующий фактор роста, факторы роста фибробластов, инсулиноподобные факторы роста и другие (Canalis Е., 1984; Fincelman R.D., 1992). К настоящему времени выделен в чистом виде ряд этих факторов, которые используются в практической медицине для стимулирования построения костной ткани. Каждый из этих факторов выполняет самостоятельную функцию, действуя на процессы хемотаксиса, пролиферации, адгезии, дифференцировки, экспрессию клетками тканеспецифических белков и т.д. (Мс Carthny T.L., Centrella М., 2000). Но их конечный эффект определяется совместным, кооперативным действием. Поэтому применение комплекса НБК может оказаться более эффективным, чем использование отдельных факторов. В настоящее время эти белки выделены, и они могут быть оценены с точки зрения эффективности для стимулирования регенерации костной ткани. При этом важным является условие введения этих белков в костную рану, так как их эффект зависит от сорбции на минеральных и органических компонентах костной ткани. Такие компоненты являются основой остеопластических материалов, выпускаемых ЗАО НПО «Полистом», к которым относятся такие материалы как Гапкол, Колапол, Гидроксиапол и другие. Поэтому актуальным является изучение
4 эффективности применения НБК, введенных в состав этих материалов, для усиления построения костной ткани. Введение в остеопластический материал белков, инициирующих репаративный потенциал кости в период регенерации ставит перед исследователями и производителями новые задачи. Важной задачей является количественная оценка способности нового материала, по сравнению с обычным Гапколом, усиливать репарацию кости. Следует также подчеркнуть, что коллаген и гидроксиапатит - содержащие остеопластические материалы обрабатывают формальдегидом для увеличения продолжительности их биорезорбции в тканях. Кроме того, с целью получения коллагена из тканей крупного рогатого скота используется уксусная кислота. Следовые количества формальдегида и уксусной кислоты, возможно, могут повлиять на активность НБК. Поэтому актуальным является изучение, в сравнительном аспекте, содержащего НБК остеопластического материала, который не обрабатывался формальдегидом, и подвергнут вакуумной экстракции для удаления летучих соединений, в первую очередь, уксусной кислоты. Качественная и количественная оценка свойств остеопластического материала Гапкол, содержащего НБК и подвергнутого вакуумной обработке является актуальной проблемой стоматологии и патофизиологии стоматологических заболеваний. Такой материал в перспективе может быть использован в пародонтологии и челюстно-лицевой хирургии, особенно у пациентов с системными заболеваниями, при которых нередко снижен репаративный потенциал костной ткани.
Цель: Применить в эксперименте неколлагеновые белки кости в составе остеопластического материала Гапкол, модифицированного вакуумной обработкой и без предварительного дубления коллагена формальдегидом для оптимизации репаративной регенерации челюстной кости.
5 Задачи
Провести исследование свойств различных вариантов модифицированного введением НБК и вакуумной обработкой остеопластического материала Гапкол с помощью декстеровской культуры костного мозга.
Применить количественный метод оценки репаративной способности модифицированного Гапкола с НБК на модели дефекта теменной кости крысы.
Оценить в эксперименте состояние тканевых структур в области костной травмы челюсти в динамике после повреждения, выраженность и длительность воспалительных реакций.
Определить темпы новообразования и дифференциации соединительно-тканного регенерата в костных дефектах.
Изучить динамику созревания соединительно-тканной компоненты регенерата и удельный вес не костной (хондроидной) компоненты регенерата при использовании модифицированного Гапкола.
Оценить роль НБК и вакуумной обработки остеопластического материала Гапкол в процессе регенерации челюстной кости.
Научная новизна
Впервые установлено, что в длительных культурах костного мозга на
остеопластическом материале Гапкол с введением НБК происходит развитие
стромальных и кроветворных клеток, и идут процессы формирования
кроветворного микроокружения, обеспечивающего нормальное
кроветворение. Материал Гапкол, содержащий НБК более эффективен для остеоиндукции по сравнению с «обычным» Гапколом. С помощью вакуумной обработки удаляются остатки уксусной кислоты из коллагена, которая снижает активность морфогенетических белков в составе НБК, участвующих в клеточных реакциях, необходимых для построения костной ткани. Все изученные модификации Гапкола оказывают положительное
действие на, заживление костной раны теменной кости, причем наиболее эффективным является материал, содержащий ЫБК и обработанный вакуумом для удаления уксусной кислоты. Таким образом, эффективность НБК в составе остеопластического-материала в большей степени проявляется при использовании очищенного коллагена.
Практическое значение
Результаты проведенного исследования показали, что создание круглого дефекта диаметром 8 мм на теменной кости крыс является адекватной моделью для количественного изучения эффективности остеопластических материалов, применяемых в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Ускорение репаративного остеогенеза в костных дефектах достигается введением в дефект материала Гапкол, содержащего НБК, не дубленного формальдегидом и обработанного с помощью вакуума. При этом наблюдается усиление, как темпов костеобразовательного процесса, так и ремоделирования и созревания новообразованной костной ткани. Дубление формальдегидом комплекса Гапкол + НБК, подлежащего введению в костные дефекты, приводит к утрате стимулирующего эффекта остеопластического материала на репаративный остеогенез. Необработанный посредством вакуумной экстракции «недубленый» Гапкол в комплексе с НБК оказывает несколько более слабое действие на репаративные процессы в костных дефектах, ' чем остеопластический материал, обработанный вакуумной экстракцией. Основные положения, выносимые на защиту
1. В длительных культурах костного мозга на остеопластических
материалах Гапкол с введением в его состав НБК происходит
развитие стромальных и кроветворных клеток, и идут процессы
формирования кроветворного микроокружения,
обеспечивающего нормальное кроветворение. Введение НБК в состав материала «Гапкол» повышает эффективность развития,
7 в первую очередь, стромальных клеток костного мозга по сравнению с «обычным» Гапколом.
Введение неколлагеновых белков кости в состав остеопластического материала Гапкол, с последующей вакуумной обработкой для освобождения от уксусной кислоты оказывает положительное действие на заживление костной раны плоских костей.
Эффективность применения Гапкола для стимулирования репаративной регенерации челюстной кости, с помощью введения в его состав неколлагеновых белков кости, повышается в случае использования остеопластического материала недубленого формальдегидом и при использовании метода вакуумной экстракции для удаления из коллагена остатков уксусной кислоты.
Личный вклад автора
Автором лично были выполнены все эксперименты на лабораторных крысах, которые распределены по группам в соответствии с планом работы. Лично автором была воспроизведена травма нижней челюсти крыс, и проводились биоклинические исследования в динамике опыта. Автор самостоятельно исследовал периферическую кровь животных в динамике эксперимента, провел патоморфологические исследования костной ткани тканей челюсти в процессе репаративного остеогенеза и осуществил анализ полученных результатов исследования. Статьи и текст диссертации составлен самостоятельно автором.
Внедрение результатов работ
Полученные данные внедрены в дальнейшую научную работу на кафедре терапевтической стоматологии Ставропольской государственной медицинской академии, а также в учебный процесс и научную работу
8 кафедры патологического физиологии стоматологического факультета ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава.
Основные положения диссертации опубликованы в работах:
1. А.И. Воложин, И.С. Мальгинова, В.Г. Лебедев, Э.В. Фионова,Г.А.
Воложин, С.А. Ожелевская, А.А.Чепель Оценка биосовместимости
остеопластических материалов с использованием длительных культур
костного мозга // Российский стоматологический журнал, 2005, № 3, С 17-
19.
2. С.А.Ожелевская Применение неколлагеновых белков кости и
хондроитинсульфата для усиления остеопластических свойств
остеопластического материала Гапкол // В кн.'.Актуальные проблемы
стоматологии Материалы всероссийской научно-практической конференции,
посвященной 105-летию со дня рождения профессора Е.Е.Платонова. М.,
2006, С 123-125.
3. Воложин А.И., Бондаренко М.О., Фионова Э. В., Ожелевская С.А.
Применение иммуномодулятора Полиоксидония совместно в
неколлагеновыми белками кости для ускорения регенерации челюсти при
иммунодефицитном состоянии в эксперименте. Патологическая физиология
и экспериментальная терапия, 2007, №1, С 27-28.
Апробация работы.
Основные положения и результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на: Третьем Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием (Москва, 2004), совместном совещании сотрудников кафедр госпитальной терапевтической стоматологии, госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, кафедры патологической физиологии стоматологического факультета и лаборатории биотехнологии минерализованных тканей НИМСИ ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава от 25 октября 2006 года, а также на кафедре терапевтической
9 стоматологии Ставропольской государственной медицинской академии 15 января 2007 года.
Объем и структура диссертации
Диссертация написана на 130 странице машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, в том числе 130 российских авторов и 66 иностранных. В диссертации представлено 4 таблицы и 63 рисунка.
\
Молекулярные механизмы перестройки и регенерации костной ткани
Органическую основу костной ткани составляют надмолекулярные агрегаты склеропротеина коллагена и неколлагеновые белки. К ним относятся: мукопротеины, сиалопротеины, альбумин, а также гликозаминогликаны, которые участвуют в формировании волокнистых структур, в процессах оссификации, регуляции водно-солевого обмена и межклеточных взаимодействиях, начиная со стволовых клеток. Коллаген является основным белком кости, он составляет 57% общего содержания коллагена в организме (Мазуров В.И., 1974). Из коллагена, протеогликанов и гликопротеинов образуются коллагеновые фибриллы, и волокна волокнистого остова кости. Коллаген состоит на 1/3 из глицина, значительных количеств пролина, оксипролина и оксилизина. От коллагена в основном зависят биомеханические характеристики соединительной ткани (Слуцкий Л.И., 1990).
Молекула коллагена имеет структуру тройной спирали, которая составлена из трех переплетенных полипептидных а-цепей. Первичная структура а-цепей коллагена состоит из повторяющихся последовательностей (глицин - X - У), где X и У может быть любой аминокислотой (кроме глицина), но чаще всего это пролин и оксипролин (гидроксипролин). Коллаген представляет собой гетерогенную популяцию молекул - изоколлагенов, которые принято называть типами.
Молекулярная характеристика типов коллагена в литературе представлена достаточно полно. Так, коллаген I типа состоит из двух ccl(I) цепей и одной ос2-цепи. Коллаген I типа наиболее распространен в организме, он содержится в костной ткани, сухожилиях, составляет основную часть коллагена кожи взрослых особей, в большом количестве обнаруживается в фиброзном кольце межпозвонкового диска и внутренних органах (Слуцкий Л.И., 1990; Mark К., 1981; Ayad S. et al., 1998). Коллаген II типа составляет основную массу коллагена хрящевой ткани.. (Eyre D.R., Muir Н., 1977). У животных обнаружены и другие типы коллагенов (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Слуцкий Л.И., 1990; Burgeson R.E., Nimni М.Е., 1992; Bateman J.F., et al., 1996; Ayad S. et al., 1998). Молекулярная гетерогенность коллагена обусловлена генетически; для каждого типа а-цепи существует свой ген (Byers Р.Н., 2000; Myllyharju J. and Kivirikko K.I., 2001).
В коллагеновых структурах идентифицировано и охарактеризовано около 10 различных по своей химической природе поперечных связей. Так, в нерастворимом коллагене кости человека и хряще найдены в небольших количествах дигидролизинонорлейцин, оксилизинонорлейцин. Основной связью в коллагене кости является оксилизинооксинорлейцин. Обнаружены в коллагене кости невосстанавливаемые связи - пиридинолин (ПИД) и дезоксипиридинолин (ДПИД), являются природными межмолекулярными связями (Замараева Т.В., Лебедев Д.А., 1985; Fujimoto D., 1980). ПИД и ДПИД играют большую роль в стабилизации костного коллагена. Поперечные связи формируются экстрацеллюлярно после отложения молекул коллагена в матрикс (Долгов В.В., Ермакова И.П., 1998; Минченко и др., 1999; Eyre D., 1992; Seyedin S.M., 1993; Kraenzlin М.Е., Seibel M.J., 1999). После отщепления пропептидов молекулы коллагена образуют многоуровневую систему надмолекулярных агрегатов.
Для оценки состояния обмена веществ в костной системе существуют и другие биохимические маркеры, определяемые в биологических жидкостях. Различают биохимические маркеры формирования и резорбции кости, характеризующие функции остеобластов и остеокластов.
Биохимические маркеры используются для оценки состояния метаболизма в костной ткани и установления скорости обменных процессов, происходящих в ней (Долгов В.В., Ермакова И.П., 1998; Минченко Б.И. и др. 1999; Robins et al, 1994; Kraenzlin M.E., Seibel M.J., 1999).
Матрикс костной ткани содержит и белки неколлагеновой природы. Их содержание в сухом деминерализованном костном матриксе составляет около 17% (Слуцкий ЛИ., 1969). Неколлагеновые белки функционируют как регуляторы минерализации (Fischer L.W., Termine J.D., 1985) и являются главными носителями антигенных свойств костной ткани.
Известно, что коллаген и гидроксиапатит сами по себе не обладают (или обладают слабовыраженными) остеоиндуцирующими свойствами. Отмеченный эффект композиций обусловлен их способностью фиксировать циркулирующие в крови факторы роста, возбуждающие остеогенез, -вторичная остеоиндукция (Десятниченко К.С., и др., 1987; 1995; 1997; Шевцов В.И., Десятниченко К.С., 2000). Той же способностью обладают некоторые неколлагеновые белки костной ткани (НБК), которые она депонирует в процессе гистогенеза (Wozney J.M. 1999; Мс Carthny T.L., Centrella М., 2000). Этим объясняется эффективность использования материалов для имплантации в костный дефект, приготовленные из нативной кости или ее дериватов. Показано, что будучи минорной фракцией зрелой компактной костной ткани, НБК представляют собой гетерогенную группу, содержащую более 4 десятков белков, отличающихся молекулярной массой, сродством к анионо- и катионообменникам, растворимостью, характером биологического действия (Десятниченко К.С., 1997). Среди факторов роста, выделенных из костной ткани, обнаружены трансформирующий фактор роста бета и относящиеся к тому же семейству морфогенетические белки кости, факторы роста фибробластов, инсулинподобные факторы роста, колониеобразующие факторы гранулоцитов и макрофагов, интерлейкины (Fincelman R.D., 1992).
Не менее двух десятков НБК в экспериментах in vitro и на животных с различными моделями репаративного остеогенеза показали свойства факторов роста, влияя на пролиферативную активность предшественников остеогенных, кроветворных и иммунокомпетентных клеток, их дифференцировку и экспрессию дифференцированными клетками тканеспецифических белков (Мс Carthny T.L., Centrella М., 2000; Десятниченко К.С., Балдин Ю.П., 1995; Shevcov V.L, Desiatnichenko K.S., 1997). Введение композиции нескольких НБК со свойствами факторов роста оказывает более энергичное влияние на репаративный остеогенез вследствие кооперативности их действия. Стимулирующее остеогенез влияние такой комбинации нескольких НБК было показано также на модели возмещения дефекта трубчатой кости посредством дистракционного остеосинтеза (Десятниченко К.С. и др., 1987). Углеводно-белковые соединения костной ткани подразделяют на классы гликопротеинов и протеогликанов, в состав которых входят макромолекулы гликозаминогликанов. Благодаря их способности фиксировать воду, обеспечивается прочность ткани на сжатие. Это свойство особенно выражено в хрящевом матриксе, чем и объясняется амортизирующая функция хряща.
Методика оценки свойств остеопластического материала с помощью декстеровской культуры костного мозга
Пластинки Гапкола были разделены на 4 группы в зависимости от технологии приготовления: 1-я группа - контроль: Гапкол без НБК, дубленный формальдегидом без вакуумной обработки; 2-я группа: дефект закрывался Гапколом + НБК С дублением формальдегидом без вакуумной обработки; 3-я группа: Гапкол +НБК без дубления и без вакуумной обработки; 4-я группа: Гапкол +НБК без дубления, с вакуумной обработкой. Эксперименты выполнены с использованием костного мозга мышей (С57В1/6 х СВА) F1 массой 18-24 г, поставляемых питомником РАМН «Столбовая». Длительные культуры костного мозга декстеровского типа вели, как описано ранее (Чертков и др.). Костный мозг одной бедренной кости мышей без суспендирования помещали в 10 мл полной среды на основе среды Фишера, обогащенной L-глютамином, 14% лошадиной сыворотки, 6% эмбриональной телячьей сыворотки, 10"8 М гидрокортизона и антибиотиками. Культуры вели при температуре 33 С в пластиковых флаконах (площадь дна 25 см) с еженедельной сменой половины культуральной среды.
Через 3 недели культивирования, когда на дне флакона образовывался нормально функционирующий стромальный подслой, проводили изучение процессов кроветворения на остеопластическом материале, помещенном в длительные культуры костного мозга. Было проведено сравнение материалов четырех вышеуказанных групп.
Образцы материала прямоугольной формы размером 20 х 8 мм, массой 0,15 г, толщиной 0,5-1 мм, сначала помещали в чашки Петри диаметром 35 мм, на поверхность полоски наносили костный мозг в концентрации 1,5x106 клеток на мл среды. После этого инкубировали в течение 30 минут при температуре 37 С. Затем материал переносили в культуральные флаконы, содержащие 3-недельные длительные культуры костного мозга, и помещали в термостат для дальнейшего культивирования. Через 7, 14, 21 и 28 суток культивирования из флаконов извлекали образцы и проводили исследование клеточного состава адгезирующего слоя. Было взято по 4 полоски Гапкола каждого вида из 4-х видов во все сроки исследования.
Для снятия клеток с Гапкола использовали раствор трипсина в концентрации 0,02% в сочетании с 0,02 % раствором ЭДТА. С целью изучения морфологического состава костного мозга, снятого с материала, раствор с клетками центрифугировали 10 минут при скорости 1500 оборотов в минуту. Затем клетки промывали раствором Хенкса и повторно центрифугировали. После центрифугирования сливали надосадочную жидкость и из осажденных на дне пробирки клеток приготавливали мазки-отпечатки, которые окрашивали по методу Паппенгейма, и подсчитывали миелограммы.
С целью оценки интенсивности процессов кроветворения на различных по составу исследуемых образцах, перед приготовлением мазков для морфологических исследований, под микроскопом в камере Горяева подсчитывали общее количество клеток костного мозга в суспензии. После снятия клеток измеряли размер каждой полоски с точностью до 1 мм, вычисляли площадь поверхности, а затем результаты оценки количества клеток на мембранах рассчитывали на 1 см поверхности мембран. Абсолютные значения содержания стромальных и кроветворных клеток на изучаемом материале получали расчетным путем, на основании значений общего количества клеток, снятых с 1 см поверхности материала, и процентного содержания стромальных и кроветворных клеток, определенных при подсчете миелограмм.
Статистическая обработка цифровых данных Цифровые данные, полученные в ходе исследований, подвергались статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента для сравнения средних величин, определения погрешности измерений и достоверности различий параметров между исследуемыми группами. Различия между группами считали достоверными t 2 и при р 0,05.
В теменных костях 48 белых крыс «Вистар» весом 180-220 грамм под гексеналовым наркозом (1 мл 2% раствора на 100 грамм веса) зубоврачебным бором делали отверстия диаметром 8 мм. Для этого животное фиксировали спиной вверх к операционному столику для мелких лабораторных животных, острыми ножницами делали полулунный разрез в передней части головы примерно на 1 см выше глазницы. Посередине обеих теменных костей, по возможности равно отступя от швов, делали сквозные отверстия до твердой мозговой оболочки. Животных разделили на 4 группы: 1-я группа - контроль: заживление костной раны без Гапкола, под кровяным сгустком, 2- группа: дефект закрывался Гапколом + НБК с дублением формальдегидом без вакуумной обработки, 3-я группа: Гапкол +НБК без дубления и без вакуумной обработки; 4-я группа: Гапкол +НБК без дубления, с вакуумной обработкой.
Кожу укладывали на место и накладывали 3 шва из шелка. Шов находился примерно в 1см от переднего края раны и, по-видимому, существенно не влиял на течение раневого процесса. В обеих группах место повреждения закрывали мягкими тканями. Крыс выводили из опыта через 15, 30, 60 и 90 суток после операции введением избыточной дозы гексенала.
Теменные кости выделяли, очищали от мягких тканей и помещали в холодный 5% раствор гипохлорита натрия для деорганификации. После тщательной отмывки в проточной воде полученные образцы обезвоживали в растворах ацетона восходящей концентрации и высушивали из С02 методом перехода критической точки в аппарате Hitachi НСР-2 (Япония). Затем с помощью токопроводящего клея (Watford, Англия) их наклеивали на столики и напыляли медью в атмосфере аргона на приборе Balzers SCD 040 (Лихтенштейн). Все образцы просматривали в сканирующем электронном микроскопе Philips SEM-515. На сканограммах измеряли площадь остающегося отверстия.
Свойства остеопластического материала Гапкол модифицированного введением НБК и вакуумной обработкой, на модели длительной культуры костного мозга
Как было сказано в главе 2, пластинки Гапкола были разделены на 4 группы в зависимости от технологии приготовления: 1-я группа — контроль - Гапкол без НБК, дубленный формальдегидом без вакуумной обработки; 2-я группа: дефект закрывался Гапколом + НБК с дублением формальдегидом без вакуумной обработки; 3-я группа: Гапкол +НБК без дубления и без вакуумной обработки; 4-я группа: Гапкол +НБК без дубления, с вакуумной обработкой.
Таким образом, 2 варианта Гапкола (№1 и 2)были приготовлены как обычно, то есть не содержали НБК, обработаны формальдегидом, и без последующей вакуумной обработки. Два других варианта Гапкола не обработаны формальдегидом и содержали НБК, но один из них (№3) не подвергался вакуумированию, а другой - подвергался вакуумной обработке.
На основании проведенных экспериментов по изучению изменений числа стромальных и кроветворных клеток, развивающихся на материалах Гапкол в длительных культурах костного мозга в течение 4 недель культивирования, было установлено, что исследованные материалы не вызывали отрицательных реакций и не оказывали ингибирующего влияния на рост клеток костного мозга. Наблюдалось постепенное возрастание общего числа клеток на материалах, отмечалось нормальное кроветворение и образование молодых и зрелых гранулоцитов. Эти данные могут свидетельствовать о хорошей биосовместимости исследованных материалов, что является важным фактором для успешного практического применения, так как вне зависимости от состава и технологии приготовления, материалы для костной пластики должны обладать такими свойствами, как безвредность, биосовместимость и способность медленно резорбироваться с замещением на костную ткань. Гапкол не терял упругости и сохранял свою структуру и форму до 14-х суток культивирования включительно, а, начиная с 21-х суток, наблюдалось его частичное разрушение.
В табл. 1 представлены данные по изменению процентного содержания различных клеточных популяций костного мозга на Гапколе в течение 28 суток культивирования, а в табл. 2 представлены данные по изменению абсолютного числа стромальных и кроветворных клеток на материале Гапкол в разных модификациях.
Как видно из таблиц, на Гапколе в разных группах с увеличением времени культивирования происходило постепенное увеличение общего количества клеток за счет стромальных и кроветворных клеток. Так, если через 7 суток культивирования общее число клеток на 1см" поверхности составляло 62,5x10 , то через 28 суток культивирования оно возрастало до 142,0х103. Число стромальных клеток увеличивалось с 53,4х103до 88,0х103, а количество кроветворных клеток составляло, соответственно, 9,1x103 и 54,0х103.
При оценке морфологического состава клеток на Гапколе было установлено, что процентное содержание стромальных клеток через 21-28 суток, по сравнению с 7-ми сутками увеличивалось в основном за счет ретикулярных клеток, а увеличение числа кроветворных клеток происходило за счет молодых и зрелых гранулоцитов (табл.1 и 2).
При исследовании материалов, изготовленных на основе недубленого Гапкола с добавлением НБК (3-я и 4-я группы), было установлено, что эти материалы оказались менее устойчивыми по сравнению с Гапколом дубленным (2-я группа) и подвергались видимым нарушениям структуры и формы на протяжении всего времени культивирования в длительных культурах костного мозга.
Через 4 недели культивирования на материалах были выявлены существенные различия содержания фибробластоподобных стромальных клеток, в популяцию которых могут входить и остеогенные клетки (табл.5). Так, при пересчете на абсолютное число клеток их содержание на Гапколе №2, №3 и №4 составляло соответственно 33,0x103, 36,4x103 и 41,6x103 по сравнению с 10,7x10 на мембранах Гапкол. В это же время отмечались существенные различия содержания молодых и зрелых гранулоцитов на материалах. Так, количество молодых гранулоцитов на Гапколе №2, №3 и №4 было соответственно 52,8х103, 54,0х103 и 48,1х103 по сравнению с 22,7x10 на «обычном» Гапколе. Эти данные свидетельствуют о большей способности указанных остеопластических материалов с добавлением НБК обеспечивать как процессы кроветворения, так, по-видимому, и процессы остеоиндукции и остеоинтеграции.
Полученные данные о числе и морфологическом составе клеток на обычном Гапколе и Гапколе в разных модификациях свидетельствуют о хорошем развитии кроветворных клеток на всех материалах. По-видимому, увеличение содержания кроветворных клеток на Гапколе в процессе культивирования может характеризовать интенсивное развитие кроветворного микроокружения, которое взаимосвязано с остеогеннои способностью клеток-предшественников и играет важную роль в механизме регенерации костной ткани.
Развитие костномозгового кроветворения на остеопластическаих материалах в условиях культивирования в длительных культурах костного мозга может отражать способность материалов усиливать остеоинтеграцию. О важности развития полноценного микроокружения, как для кроветворения, так и проявления остеоиндуктивных и остеоинтегративных свойств композиционных материалов свидетельствует анализ литературных данных, приведенных в 1-й главе работы.
Установлено, что в регуляции гемопоэза важную роль играет кроветворное микроокружение, осуществляющее адгезивную функцию для стволовых кроветворных клеток в костном мозге и регуляцию их пролиферации и дифференцировки (Гольдберг Е.Д. и др., 2000; Trentin JJ.,1976). Гемопоэтический эффект достигается созданием «ниш» микроокружения, обеспечивающих прямой межклеточный контакт и интенсивный гуморальный обмен стромы с гемопоэтическими клетками (LordB.L, 1980).
Костномозговое микроокружение необходимо также и для нормального протекания процессов. развития и перестройки костной ткани (Щепёткин И. А., 1994), а в условиях применения биоматериалов адгезирующие на их поверхности клетки, могут оказывать положительное влияние на остеоиндукцию. Остеобластогенез и функциональная активность зрелых остеокластов находятся под регуляторным контролем полипептидных факторов роста, продуцируемых кроветворными и стромальными клетками костномозгового микроокружения, гемопоэтические факторы роста принимают активное участие в остеогенезе (Щепёткин И. А., 1994, LeGeros R.Z. etal, 1993).
Проведенные эксперименты, результаты которых изложены в настоящем разделе, показали, что в длительных культурах костного мозга на мембранах Гапкол и Гапкол с добавлением НБК происходит развитие стромальных и кроветворных клеток, и идут процессы формирования кроветворного микроокружения, обеспечивающего нормальное кроветворение. На материалах наблюдается постепенное увеличение общего числа клеток, возрастание стромальных и значительное увеличение содержания кроветворных клеток. Причем с увеличением времени культивирования, в зависимости от состава Гапкола, отмечается разная степень устойчивости структуры мембран, а также проявляются различия в изменениях общего количества клеток на мембранах и соотношения стромальных и кроветворных клеток. Более устойчивыми в биологической среде и эффективными в плане течения процессов кроветворения являются материала Гапкол, дубленный формальдегидом, по сравнению с «недубленым» Гапколом.
Количественная оценка репаративной регенерации костной ткани под влиянием остеопластического материала Гапкол в разных модификациях (на модели теменной кости крысы)
В данный срок наблюдения на сканограмме препарата теменной кости видно (Рис.4),.что остающееся отверстие имеет большие размеры. Отчетливо выраженных признаков новообразования костных структур по его периметру не выявлено. Площадь отверстия составляет 12,28 мм .
На другой сканограмме этого срока наблюдения данной группы видно, что отверстие в теменной кости располагается в ее центральных отделах, несколько ближе к затылочной кости. Остатки внутренней компактной пластинки занимают лишь небольшую часть площади отверстия (Рис.5). По краю отверстия наблюдается формирование новых костных структур, однако их площадь в целом не велика. Площадь незаполненных костной тканью участков составляет 8,80 мм". 30 суток.
К данному сроку наблюдения площадь отверстия в теменной кости существенно уменьшается и составляет на одном из препаратов 5,23 мм2 (Рис.6).
На другом препарате в котором отверстие также расположено в центральном отделе теменной кости (Рис.7) площадь незаполненных регенератом участков в составляет еще меньшую величину - 3,86 мм2.
Через 60 суток опыта большая площадь отверстия на теменной кости заполнена вновь образованными костными структурами (Рис.8). Площадь остающихся отверстий на двух препаратах составляет 1,90 мм2.
На другом препарате основная часть отверстия теменной кости также закрыта новообразованными структурами (Рис.9). Площадь оставшегося канала звездчатой формы еще меньше и составляет 1,00 мм". 90 суток.
В результате изучения препаратов теменной кости крыс контрольной группы через 90 дней после нанесения травмы на одном препарате (Рис.10) видно, что дно дефекта заполнено вновь образованной костной тканью. По краю существовавшего отверстия наблюдается формирование новых костных структур. В полости дефекта выявляются остатки гранул заполняющего его вещества. Создается впечатление, что костная ткань формируется как со стороны внутренней, так и внутренней компактной пластинки.
Возможно, что дно отверстия образуют остатки внутренней компактной пластинки, над которой происходит активное новообразование грубоволокнистих костных структур. Для них характерно большое количество близко расположенных формирующихся костных лакун, что видно при большом увеличении (Рис.11). Площадь не заполненных вновь образующимися трабекулами участков невелика и составляет всего 0,46 мм2. По периметру отверстия обнаруживаются сравнительно немногочисленные сосудистые каналы, диаметр которых колеблется в пределах от 30 до 100 мкм. Практически вся поверхность костных структур, образующих стенки отверстия является формирующейся. В некоторых местах встречаются прободающие волокна. Участки резорбции немногочисленны и невелики по размеру. 1««і15Єки 1.79Е1 ввіб вЗ URAT97L
Рис.11. 1-я группа. Контроль, 90 суток. Новообразованные грубоволокнистые структуры, заполняющие отверстие на наружной поверхности теменной кости. СЭМ. Ув.300. Их поверхность является формирующейся и содержит многочисленные прободающие волокна (Рис.12). Площадь оставшегося отверстия составляет 0,37 мм2.
2-я группа, дефект закрывался Гапколом + НБК с дублением формальдегидом без вакуумной обработки. 15 суток.
В данный срок наблюдения остающееся отверстие также как и в предыдущей группе имеет большие размеры (Рис.13), и его площадь по продемонстрированному препарату составляет 10,06 мм . В других препаратах этой группы размеры отверстия в среднем были немного меньше и составляли от 9,1 до 10,0 мм 30 суток
На 30-е сутки опыта на демонстрируемом препарате закрытие отверстия теменной кости происходит со стороны его краев (Рис.14). Площадь незаполненных участков составляет на данном препарате 4,12 мм".
На другом препарате видна довольно типичная картина, нередко встречающаяся в данном эксперименте, когда отверстие заполняется по периметру неравномерно с разных сторон новообразованными костными структурами (Рис.15). Площадь незаполненных костной тканью участков составляет в среднем 3,60 мм . 60 суток
Показано, что через 60 суток опыта во 2-й группе отверстие в теменной кости со стороны краев заполняется костными структурами, имеющими значительное количество сосудистых отверстий небольшого диаметра (Рис.16). Площадь незаполненных участков в составляет 3,00 мм2.
