Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы .11
1.1. Воспалительные и не воспалительные процессы в альвеолярных отростках верхней и нижней челюстей .11
1.2. Виды материалов для замещения костных дефектов 14
1.3. Носители и фиксация на них BMP .25
2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Технология получения rhBMP-2 29
2.2.Технология получения остеопластического материала 29
2.3. Получение эксплантационного материала в эксперименте на культуре клеток-предшественников стромальных фибробластов костного мозга 30
2.4. Подготовка остеопластического материала с выращенными на его поверхности костномозговыми стромальными клетками к электронному сканирующему микроскопированию 32
2.5. Описание эксперимента на лабораторных животных 33
2.6. Описание экспериментальных групп 34
2.7. Техника операции .34
2.8. Оценка состояния животных после операции .37
2.9. Компьютерная томография 38
2.10. Морфологическое исследование .41
2.11. Документирование 42
2.12. Статистический анализ полученных данных .42
3. Результаты собственных исследований 43
3.1. Эксперимент со стромальными клетками-предшественниками костного мозга 43
3.2. Результаты сканирования 44
3.3. Оценка клинических признаков в эксперименте на лабораторных животных 47
3.4. Результаты морфологического исследования через 1 месяц .55
3.5. Результаты морфологического исследования через 2 месяца 61
3.6. Результаты морфологического исследования через 3 месяца 65
3.7. Оценка костеобразования во всех группах в течение всего срока наблюдения 71
3.8. Результаты компьютерной томографии 73
4. Обсуждение 77
Выводы 84
Практические рекомендации 85
Список сокращений 86
Список литературы
- Виды материалов для замещения костных дефектов
- Получение эксплантационного материала в эксперименте на культуре клеток-предшественников стромальных фибробластов костного мозга
- Компьютерная томография
- Результаты морфологического исследования через 1 месяц
Виды материалов для замещения костных дефектов
Проблема восстановления костной ткани является актуальной задачей в современной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, о чем свидетельствуют непрекращающиеся поиски новых и совершенствование известных остеопластических материалов для восстановления дефектов костной ткани. (Анастасов А.Н., 2002; Беззубов А.Е., 2010)
Существует ряд воспалительных и не воспалительных процессов в челюстно-лицевой области, ведущих к деструктивным изменениям и образованию дефектов и полостей в костной ткани челюстей.(Леус П.А., 2002; Лобко С.С., 1997)
Выделяют несколько основных причин редукции альвеолярного гребня, сопровождающейся уменьшением объема и снижением высоты альвеолярного отростка верхней челюсти (Робустова Т.Г, 2003.), а именно: образование одонтогенных кист, травматичное удаление зубов, сопровождающееся повреждением стенок альвеолы, развитие осложнений инфекционно воспалительного характера после удаления зуба (альвеолита, остеомиелита), заболевания пародонта: а) пародонтит, пародонтоз, сопровождающиеся резорбцией костной ткани альвеолярной части челюстей со снижением высоты межзубных, межкорневых перегородок; б) деструктивные формы периодонтита, сопровождающиеся резорбцией костной ткани вокруг апикальной части корней зубов и компактной пластинки дна верхнечелюстной пазухи.(Аснина С.А., 2004; Бакиев Б.А., 1985)
Длительное отсутствие функциональной нагрузки на альвеолярную часть челюсти после удаления зубов, некомпенсированной путем своевременного съемного протезирования так же ведет к атрофии костных структур и деформации альвеолярного отростка, по типу так называемой горизонтальной резорбции.(Безруков В.М., 2000; Кулаков А. А., 1997, 2008; Попов В.Ф., 2009) Позднее вертикальная потеря кости стабилизируется на уровне 0,1 мм в год. Эта резорбция может ускоряться, и плотность кости будет уменьшаться из-за системных факторов, таких как гормональный дисбаланс, метаболические факторы, воспаление и системные заболевания. Возраст и пол так же влияют на объем потери кости. (Mullender, 2005; Лосев Ф.Ф., 2000). Возникает остеопороз, при котором происходит перестройка архитектоники костной ткани (регрессивная трансформация губчатой кости в компактную).
Данные дефекты костной ткани, ее возрастная утрата или патологические состояния затрудняют реабилитацию пациентов не только посредством имплантации из-за недостатка объема костной ткани, но и могут доставлять трудности при протезировании в связи с плохой фиксацией съемных протезов.
Необходимость в классификации ограниченных костных дефектов в области адентии возникла давно. Сведения о вмешательствах, направленных на регенерацию кости при наличии таких дефектов, стали появляться в литературе с 1957 г. Успешное устранение значительных костных дефектов (т.е. дефектов таких размеров и формы, когда вероятность самопроизвольной регенерации кости в области дефекта чрезвычайно мала) требует соблюдения определенных биологических принципов. При этом становится возможным получение запланированного объема кости.
Сохранение всех стенок лунки после удаления зуба означает, что «костный конверт» остался интактным. Потеря большей или меньшей части окружающей альвеолу кости означает, что защитный механизм стабилизации кровяного сгустка нарушен и может понадобиться применение специальных методик для получения достаточного объема кости.(Кузнецова Н.Н., 2005)
Окончатый дефект Окончатым называют ограниченный со всех сторон дефект альвеолярного гребня с вестибулярной или язычной стороны, который образуется при установке имплантата в недостаточно широкий гребень. (Коротких Н.Г., 2004) Щелевидные дефекты Щелевидный дефект образуется при установке имплантата, когда обнажается не более 50% его диаметра от шейки в апикальном направлении. Щелевидный дефект I класса образуется, когда имплантат не выступает за наружную границу «костного конверта». Щелевидным дефектом II класса называют такой дефект, когда имплантат выступает за наружную границу «костного конверта». (Барер Г.М., 1996) Дефицит ширины альвеолярного гребня Дефицит ширины альвеолярного гребня характеризуется тем, что при установке имплантата обнажение его будет более 50% диаметра от шейки в апикальном направлении.
При дефиците ширины альвеолярного гребня 1-го класса имплантат не выступает за наружную границу «костного конверта». Дефицит ширины альвеолярного гребня II-го класса характеризуется тем, что имплантат выступает за наружную границу «костного конверта». (Григорьян А.С., 1997)
Получение эксплантационного материала в эксперименте на культуре клеток-предшественников стромальных фибробластов костного мозга
Весь эксперимент на животных проводили в условиях вивария МГМСУ им. Евдокимова. (зав. вивария Комова Л.В.)
В исследовании использовали биокомпозиционный материал на основе недеминерализованного костного матрикса «Остеодент» в виде гранул в чистом виде и соединенный с рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости (rhBMP-2). Синтез и соединение рекомбинантного морфогенетического белка с деминерализованным костным матриксом проводились на базе Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики Российской Академии Наук (ИТЭБ РАН) по методике, описанной зарубежными авторами (Malik D.K., 2007). Концентрация белка в имплантате составляла 0,6-0,8 мг/см. В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс массой тела 400-500 г. Во всех случаях выполнялась операция по одной и той же методике.
В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс породы Wistar с массой тела 400-500 г в возрасте 4-5 месяцев. Животные были разделены на 3 группы: I-я - контрольная, II-я – группа сравнения и III-я – экспериментальная (по 18 крыс в каждой). У животных II-ой группы (группы сравнения) дефект заполняли чистым недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», а у III-ей (экспериментальной) группы дефект заполняли недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», содержащим rhBMP-2. В контрольной группе дефект заживал под сгустком. Из эксперимента животные выводились в следующие сроки: 1, 2, 3 месяца, по 6 крыс из каждой группы.
После выведения всех животных из эксперимента проводили КТ исследование черепа крысы. Следующим этапом выполняли сегментарную остеотомию свода черепа, после чего выделенный сегмент свода черепа фиксировали в формалине и помещали в пробирку для морфологического исследования. Исследования проводили в течение первых 10 дней после получения материала.
Все операции выполнялись под общим обезболиванием Золетил 100 0,2 мл. Во время операции животные фиксировались в положении на животе. После трехкратной обработки операционного поля 70% раствором спирта в области свода черепа крысы выполнялся кожный разрез длиной 3 см до кости. Мягкие ткани гладилкой отсепаровывались от свода черепа и фиксировались пинцетом. В центре свода черепа при помощи физиодиспенсера с охлаждением стерильным физиологическим раствором при температуре 5С и трепана выполнялся бикортикальный костный дефект диаметром 8 мм. Рисунок 5.Разрез в области свода черепа и формирование бикортикального
Образованный дефект высушивался при помощи стерильных марлевых салфеток и заполнялся чистым недеминерализованным костным матриксом либо насыщенным рекомбинантным морфогенетическим белком кости, заготовленным заранее (ортотопическая имплантация). Рана ушивалась узловыми швами наглухо. Кожный шов обрабатывался раствором бриллиантовой зелени.
В день операции и на следующий день все животные получали антибиотикотерапию: линкомицина гидрохлорид по 80 мг. в/мышечно. Животные содержались в клетках по 5 особей. Из эксперимента их выводили путем передозировки наркоза (соблюдались требования «Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах или в иных научных целях» от 18.03.1986 г.).
Повышение температуры тела Отек мягких тканей Увеличение регионарных лимфоузлов Наличие гиперемии Несостоятельность швов Наличие гематомы Нагноение раны Клиническую картину оценивали по набору этих клинических признаков по системе «Да» и «Нет», что соответствует числовым значениям «1» и «0», и заносили результаты в таблицы в процентах. Оценку течения раневого процесса у всех животных всех групп производили на 1-ые, 3-и, 5-ые и 7-е сутки после операции. На 7-ые сутки после операции снимали швы.
Для определения объема и качества восстановленного дефекта выполнялась компьютерная томография черепа крыс с последующей оценкой плотности костной ткани по шкале Хаунсфилда. Компьютерная томография — это особый вид рентгенологического исследования, которое проводится посредством непрямого измерения ослабления или затухания, рентгеновских лучей из различных положений, определяемых вокруг обследуемого объекта.
Большинство КТ-сечений ориентированы вертикально по отношению к оси тела, которые называются аксиальными или поперечными срезами. Для каждого среза рентгеновская трубка поворачивается вокруг пациента, толщина среза выбирается заранее. Большинство КТ-сканеров работают по принципу постоянного вращения с веерообразным расхождением лучей. При этом рентгеновская трубка и детектор жестко спарены, а их ротационные движения вокруг сканируемой области происходят одновременно с испусканием и улавливанием рентгеновского излучения. Таким образом, рентгеновские лучи, проходя через пациента, доходят до детекторов, расположенных на противоположной стороне. Веерообразное расхождение происходит в диапазоне от 40 до 60, в зависимости от устройства аппарата, и определяется углом, начинающимся от фокусного пятна рентгеновской трубки и расширяющимся в виде сектора до наружных границ ряда детекторов. Обычно изображение формируется при каждом обороте в 360, полученных данных оказывается для этого достаточно. В процессе сканирования во многих точках измеряют коэффициенты ослабления, формируя профайл затухания.
Исследование было выполнено в Красногвардейской ветеринарной клинике на аппарате ToshibaAsteionS4 по стандартной методике: толщина томографического среза 1 мм, обработка информации по программе мультипланарной и объемной поверхностной реконструкции в режиме сканирования томографических срезов Innerear, при напряжении на трубке 110 кв и 120 мАс.
Компьютерная томография
В качестве контроля адгезии фибробластов использовали препараты на предметном стекле. Адгезированные клетки распластывались, увеличивались в размерах, формировали монослой, в котором визуализировались плотные контакты между клетками, клетки начинали синтезировать коллаген и межклеточный матрикс.
На гладкой поверхности образцов «Остеодент» адгезированные фибробласты выглядели таким же образом, как на поверхности стекла. На волокнистой поверхности материала «Остеодент» фибробласты адгезировались, но по сравнению с гладкой поверхностью хуже распластывались, плотность межклеточных контактов менее выражена, соответственно и синтез коллагена и межклеточного матрикса был меньше. На шероховатой поверхности фибробласты адгезировались, но формирование межклеточных контактов и клеточного пласта было затруднено из-за гранул на шероховатой поверхности. Таким образом, в результате проведенного исследования было установлено, что фибробласты способны адгезироваться к поверхности препарата «Остеодент», несмотря на наличие морфогенетического белка кости в составе остеопластического материала. Принципиальной разницы между порошком и гранулами препарата «Остеодент» по морфологическим свойствам и характером взаимодействия с фибробластами не выявлено. Для адгезии, распластывания и формирования пласта фибробластами определяющим фактором является рельеф поверхности – чем более гладкой является поверхность, тем больше фибробластов адгезируется.
Для оценки остеиндуктивной активности морфогенетического белка кости (rhBMP-2) в составе остеопластического материала «Остеодент» в рамках работы был запланирован и проведен эксперимент на лабораторных животных. Эксперимент на лабораторных животных проводился на базе вивария Московского Государственного Медико-Стоматологического Университета им. Евдокимова.
Дефект заживал под недеминерализованным чистым сгустком костным матриксом, недеминерализованным содержащим rhBMP-2 костным матриксом В послеоперационный период животным производили антисептическую обработку раны раствором хлоргексидина 0,05% на первые, третьи, пятые и седьмые сутки. У животных всех групп швы снимали на седьмые сутки после операции. При осмотре фиксировали признаки послеоперационных воспалительных явлений и проводили оценку течения раневого процесса у всех животных на первые, третьи, пятые и седьмые сутки после операции и заносили результат в таблицы. Клиническая картина была оценена по набору клинических признаков, которые оценивали по системе «Да» и «Нет», что соответствовало баллам 1 и 0, и выражали в процентном соотношении.
контрольной группе на первые сутки повышение температуры тела наблюдалось у 66,7% животных, отек мягких тканей у 72,2%, наличие гиперемии у 11,1%. На третьи сутки повышение температуры тела наблюдалось у 33,3%, отек мягких тканей у 55,6%, наличие гиперемии у 5,6%. На пятые сутки повышение температуры тела определялось у 11,1%, отек мягких тканей у 33,3%, наличие гиперемии у 5,6%, наличие гематомы у 11,1%. На седьмые сутки повышение температуры тела было у 5,6%, отек мягких тканей у 11,1%, наличие гематомы у 11,1%. Несостоятельность швов и нагноение раны не наблюдалось ни в один срок
В группе сравнения на первые сутки повышение температуры тела наблюдалось у 94,4% животных, отек мягких тканей у 83,3%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 27,8%. На третьи сутки повышение температуры тела определялось у 77,8%, отек мягких тканей у 77,8%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 66,7%. На пятые сутки повышение температуры тела определялось у 38,9%, отек мягких тканей у 44,4%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 27,8%. На седьмые сутки повышение температуры тела определялось у 16,7%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 11,1%, несостоятельность швов у 11,1%, нагноение
В экспериментальной группе на первые сутки повышение температуры тела наблюдалось у 94,4% животных, отек мягких тканей у 72,2%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 27,8%, наличие гематомы у 5,6%. На третьи сутки повышение температуры тела определялось у 83,3%, отек мягких тканей у 83,3%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 61,1%, наличие гематомы у 5,6%. На пятые сутки повышение температуры тела определялось у 33,3%, отек мягких тканей у 38,9%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 27,8%, наличие гематомы у 5,6%. На седьмые сутки повышение температуры тела определялось у 11,1%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 5,6%, несостоятельность швов у 5,6%, нагноение раны у 5,6%.
На первые сутки после операции в контрольной группе определялось повышение температуры тела, отек мягких тканей и наличие гиперемии. В группе сравнения и экспериментальной группе определялось также увеличение регионарных лимфоузлов, клиническая картина в этих группах схожа, однако повышение температуры тела и наличие гиперемии наблюдались чаще, чем в контрольной.
Результаты морфологического исследования через 1 месяц
Дефекты костной ткани, ее возрастная утрата или потеря в связи с патологическими состояниями не могут быть полностью устранены путем физиологической регенерации или посредством хирургического вмешательства.
В таких ситуациях используются биоматериалы или их синтетические аналоги. Имеющиеся методы далеко не всегда позволяют не только заполнить объем имеющегося дефекта, но и создать условия выполнения механической функции кости. Иными словами, мы приблизились к созданию достаточного объема костной ткани, но структурные характеристики получаемого костного регенерата далеки от желаемого. Возникшую проблему мы и попытались решить в представленном исследовании.
Метод, оказывающий влияние на механизмы ремоделирования костной ткани, связан с использованием рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости (rhBMP-2), который, в свою очередь, активизирует функцию остеобластов. Изучение свойств и возможностей использования rhBMP-2 проводится в настоящее время в большинстве медико-биологических центров мира. На первом этапе исследования задача состояла в синтезе и получении непосредственно самого белка для планируемых исследований. Эта задача была успешно решена в содружестве с Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН, лаборатория тканевой инженерии, руководитель лаборатории д.ф.-м.н Акатов Владимир Семенович. Белок был получен методом генной инженерии, который включал следующие этапы: 1. Генноинженерная сборка биологической конструкции; 2. Введение созданной молекулы в клетки бактерии E.Coli; 3. Наработка достаточного объема бактериальной массы для получения необходимого количества белка; 4. Выделение белка из бактериальной массы и его биохимическая очистка. Проведенный анализ литературных данных позволил оптимально выбрать биоматериал, необходимый для совместного использования с rhBMP-2. Таким материалом выступил «Остеодент», представляющий собой стерильный биопластический материал на основе костного ксеноколлагена, насыщенный сульфатированными гликозаминогликанами (сГАГ) для направленной костной регенерации, производитель ЗАО «ЭОЗ ВладМиВа»
В дальнейшем, получив необходимую композицию (биоматериал с rhBMP-2), мы приступили к лабораторным исследованиям.
В лаборатории стромальной регуляции иммунитета ФГБУ НИИ им. Н.Ф. Гамалеи под руководством д.м.н. проф. Р.К. Чайлахяна был запланирован и успешно проведен эксперимент, целью которого ставилось выявление имеющееся митотической активности клеток-предшественников стромальных фибробластов костного мозга и визуально оценить их адгезивную активность на поверхности предложенного биоматериала, содержащего rhBMP-2.
Клетки-предшественники стромальных фибробластов костного мозга получали следующим методом: крыс усыпляли эфиром. С соблюдением правил асептики через разрез на задней части бедра выделяли бедренные и большеберцовые кости. Эпифизы костей обрезали и шприцом выдували костный мозг во флакон с питательной средой. Фрагменты костного мозга пропускали через шприц с последовательно уменьшающимся диаметром игл при минимальном давлении в нем до получения гомогенной взвеси клеток. Взвесь дважды отмывали центрифугированием при 4С (400g), осадок ресуспендировали в свежей питательной среде, фильтровали через 4-х слойный капроновый фильтр.
Для получения штаммов стромальных клеток-предшественников костного мозга эксплантировали во флаконы. На 10-14 день культивирования, когда колонии стромальных фибробластов были полностью сформированы, проводили I пассаж.
Для изучения взаимодействия штаммов остеогенных клеток предшественников с остеопластическим материалом, насыщенным рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости rhBMP-2, его засеивали пассивированными клетками. Культивирование проводили в течение 5-7 дней. Затем производили фиксацию.
Перед фиксацией культуральную среду сливали, материал несколько раз промывали физиологическим раствором и на 30 мин. заливали 80% этанолом. Фиксированные на остеопластическом материале, содержащем рекомбинантный морфогенетический белок кости rhBMP-2, культуры окрашивали по Гимзе. После этого оценивали полученный результат под микроскопом.
Визуальная оценка клеток-предшественников на остеопластическом материале с помощью сканирующего электронного микроскопа показала, что наличие rhBMP-2 не препятствует прикреплению и фиксации клеточного материала на недеминерализованном костном матриксе. Данное исследование проводилось в лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ НИИ им. Н.Ф. Гамалеи, руководитель лаборатории – д.м.н. Л.В. Диденко.
После завершения лабораторной части исследования приступили к эксперименту на животных. Для проведения экспериментальной части нами была разработана экспериментальная модель критического дефекта в своде черепа крысы. Используемая нами экспериментальная модель дефекта, по мнению зарубежных исследователей, является максимально информативной и приближенной к естественным условиям функционирования остеоиндуктивного биоматериала в организме реципиента. Моделирование процесса восполнения дефекта дает возможность исследовать плотность, объем и качество образующегося регенерата и оценить остеоиндуктивные характеристики в цифровых значениях. Так же исследовалось влияние рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости rhBMP-2 в составе недеминерализованного костного матрикса на процесс костеобразования как в зоне хирургического вмешательства, так и в сегменте в целом.
В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс породы Вистар с массой тела 400-500 г в возрасте 4-5 месяцев. Животные были разделены на 3 группы: I-я - контрольная, II-я – группа сравнения и III-я – экспериментальная (по 18 крыс в каждой). У животных II-ой (экспериментальной) группы дефект заполняли чистым недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», а у III-ей (экспериментальной) группы дефект заполняли недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», содержащим rhBMP-2. В контрольной группе дефект заживал под сгустком. Из эксперимента животные выводились в следующие сроки: 1, 2, 3 месяца, по 6 крыс из каждой группы.
В послеоперационный период животным производили антисептическую обработку раны раствором хлоргексидина 0,05% на первые, третьи, пятые и седьмые сутки. У животных всех групп швы снимали на седьмые сутки после операции. При осмотре отмечали признаки послеоперационных воспалительных явлений и проводили оценку течения раневого процесса на первые, третьи, пятые и седьмые сутки после операции и заносили результат в таблицы. Клиническая картина была оценена по набору клинических признаков, которые оценивали по системе «Да» и «Нет», что соответствовало баллам 1 и 0, и выражали в процентном соотношении.
