Введение к работе
Актуальность проблемы. Большинство практически важных химических реакций протекает при участии различных катализаторов. Среди них особое место занимают полимерные катализаторы биологического происхождения - ферменты, обладающие исключительно высокой каталитической активностью и уникальной групповой или индивидуальной специфичностью. К сожалению, широкое практическое применение натавных ферментов затруднено из-за их недостаточной технологичности, связанной, прежде всего с их лабильностью и экономической нецелесообразностью использования в гомогенных растворах. Эти недостатки можно ликвидировать с помощью ферментов, связанных с носителем различными способами, т.е. путем их иммобилизации.
В настоящее время преимущества использования иммобилизованных ферментов очевидны, поэтому их применение ежегодно расширяется. Получение иммобилизованных ферментов является, например, одним из ключевых моментов создания ферментативных аналитических систем. Несмотря на широкий выбор носителей и методов иммобилизации, проблема поиска, разработки и исследования новых способов, спенсеров и носителей для иммобилизации ферментов является одной из актуальных задач фундаментальной химической науки. При этом наиболее перспективны методы иммобилизации, позволяющие максимально сохранять каталитическую активность ферментов в процессе иммобилизации и повышающие стабильность иммобилизованных препаратов при последующем использовании. В зависимости от метода иммобилизации и дальнейшего использования связанных форм фермента к носителям предъявляются определенные требования. В качестве подложек, носителей для иммобилизации ферментов с успехом могут применяться природные и синтетические материалы органического и неорганического происхождения, например, целлюлозы, синтетические полимеры и гели, иониты, неорганические оксидные материалы.
Среди различных методов иммобилизации наиболее широкое распространение получило ковалентное связывание фермента с носителем. При этом носитель должен иметь жесткую структуру, легко модифицироваться и активироваться, не проявлять сорбционных свойств. Связывание фермента с матрицей носителя в этом случае происходит за счет функциональных боковых и концевых амино- и карбоксильных групп белка. При этом часто нарушается нативная конформация белковой макромолекулы, что приводит к частичной или полной потере каталитической активности фермента. Глубина этой инактивации зависит от условий проведения реакции, а также от свойств носителя и сшивающего агента - спейсера. Поэтому во многих случаях спенсеры являются критическим звеном в технологии получения иммобилизованных ферментов и создания биосенсоров на их основе. Используя в качестве спейсеров соединения, специфически взаимодействующие с функциональными группами фермента, не входящими в его активный центр и, следовательно, не участвующими в каталитическом процессе, можно значительно снизить отрицательные последствия иммобилизации. Для ферментов-гликопротеннов, например, имеется возможность осуще-
ствить иммобилизацию за счет карбогидратной части, не входящей в активный центр фермента. В этой случае вероятность потери ферментативной активности в процессе иммобилизации уменьшается.
В последние годы бурное развитие претерпевает синтез и исследование полимерных материалов с новыми специфическими свойствами - полимерных гидрогелей, способных обратимо реагировать на незначительные изменения свойств внешней среды, и высокопроницаемых ионитов. Это открывает новые возможности конструирования и использования функциональных иммобилизованных биокаталитических систем с новыми полезными свойствами, что также, несомненно, является актуальной задачей. Сорбционные системы, полученные в результате необратимой или высокоселективной сорбиии ферментов с сохранением их физиологических функций, представляют большой теоретический и практический интерес. С их помощью можно моделировать различные биологические процессы, на их основе разрабатываются высокостабильные лекарственные формы пролонгированного действия, создаются высокоэффективные и высокочувствительные ферментные анализаторы. Все сказанное указывает на актуальность теоретического и экспериментального рассмотрения сорбционно иммобилизованных на различных носителях ферментативных систем с единых теоретических позиций. Кроме того, несмотря на существенные различия методов иммобилизации, два основных из них - ковалентний и сорбционный - также могут рассматриваться с единых позиций как процессы с прямоугольной изотермой.
Цель работы - разработка научных основ и методов химической и сорбци-онной иммобилизации ферментов на различных носителях, выявление основных закономерностей и особенностей взаимодействия биологических макромолекул с полимерными гидрогелями, разработка и получение высокоактивных и стабильных биокатализаторов для использования в различных областях биотехнологии, медицины, пищевой промышленности, а также для анализа и контроля окружающей среды. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
синтез, спектральное и хроматографическое исследование производных фенилбороновой кислоты, определение их кислотных свойств в водных растворах, корреляция структура - свойство;
модельное исследование комплексообразования бороновых кислот с диодами в динамических и статических условиях;
активирование неорганических кремнеземных носителей бифункциональными бороновыми кислотами;
разработка химического метода иммобилизации ферментов-гликопротеинов и оптимизация условий иммобилизации глюкозооксидазы с помощью спейсеров на основе бороновых кислот;
разработка нового метода иммобилизации ацетилхолинэстеразы;
систематическое теоретическое рассмотрение термодинамики локальных сорбционных равновесий с участием белков в системе гелевый сорбент - внеш-
5 ний раствор и некоторые подходы к исследованию неравновесных сороционных систем;
экспериментальное исследование сорбционной иммобилизации ферментов на примере каталазы на различных ионных полимерных гидрогелях в зависимости от различных условий внешней среды (рН, ионной силы, концентрации фермента), кинетики и обратимости процесса;
исследование адсорбционной иммобилизации ацешлхолинэстеразы и глюкозооксидази на углеродных и кремниевых носителях;
- исследование возможности использования иммобилизованных ферментов для анализа метаболитов, ингибиторов и токсичных соединений. Научная новизна работы заключается в следующем:
Синтезированы новые спейсеры на основе бифункциональных производных фенилбороновой кислоты и изучено влияние различных заместителей на их кислотные свойства; впервые методом ВЭЖХ установлена их индивидуальность. Детальное ГТМР-спектроскопическое исследование синтезированных спейсеров позволило впервые охарактеризовать вклад дигидроксиборильной группы в химические сдвиги ароматических протонов замещенных бензолов.
Впервые спектрофотометрическим методом определены константы ионизации 16 бороновых кислот в водных растворах, охарактеризовано влияние различных заместителей на кислотность В(ОН)2-группы. На основании полученных спектральных, хроматографических, физико-химических данных впервые установлена корреляция связи структура - свойство для данного класса соединений.
Впервые проведено систематическое теоретическое и экспериментальное исследование взаимодействия бороновых кислот с диолсодержаицими твердыми фазами как моделями гликопротеинов в статических и динамических условиях. Впервые получены систематические данные по хроматографическому удерживанию бороновых кислот на диолсодержащих носителях в водных растворах, а также по их константам комплексообразования с поливиниловым спиртом.
Получены новые активированные кремнеземные носители для химической иммобилизации ферментов-гликопротеинов, целых клеток и клеточных компонентов, а также для аффинной хроматографии диолсодержащих соединений.
Разработан новый способ и оптимизированы условия химической иммобилизации глюкозооксидазы и ацетилхолинэстеразы путем использования подходящих спейсеров на основе бороновых кислот и проведения иммобилизации в условиях образования стабильного боронат-диольного комплекса, с одной стороны, и проявления максим&чьной ферментативной активности, с другой, при сохранении этой активности в процессе иммобилизации, в условиях хранения и непрерывной эксплуатации. Для ацетилхолинэстеразы иммобилизация данным методом проведена впервые.
Впервые проведено систематическое рассмотрение с единых теоретических позиций сорбционной иммобилизации биополимеров на различных типах полимерных гелевых носителей.
Впервые систематически экспериментально исследованы процессы сорб-ционного взаимодействия каталазы с различными ионогенными полимерными
гидрогелями в зависимости от различных факторов внешней среды, установлены основные закономерности и особенности этого взаимодействия. Показано, что сорбция глобулярных белков полимерными гидрогелями происходит в пространстве и времени как типичный процесс образования и эволюции неравновесных систем и представляет собой полифункциональное, многоточечное взаимодействие, приводящее к большим коэффициентам распределения и необратимости процесса, что позволяет рассматривать химическую и сорбцион-ную иммобилизацию ферментов на гелевых носителях с единых позиций как процессы с прямоугольной изотермой сорбции, характерной для необратимо иммобилизованных ферментных систем.
Впервые показана возможность использования катионных полимерных гидрогелей полналлиламина и полиэтиленимина, а также полученных на основе ВЭМЭА для традиционной сорбционной иммобилизации каталазы.
Практическая ценность работы состоит в проведении систематических исследований по разработке нового способа химической иммобилизации фер-ментов-гликопротеинов на кремнеземных носителях, обладающих полупроводниковыми свойствами, с помощью новых бифункциональных спенсеров на основе фенилбороновых кислот. Разработанный метод иммобилизации обладает несомненными преимуществами при необходимости близкого расположения фермента, например, к электродной поверхности для достижения эффективного прямого электронного переноса между ними и может быть рекомендован при создании чувствительных элементов биосенсорных систем для клинической диагностики, биоскрининга новых физиологически активных соединений и других областей биотехнологии. Кроме того, предлагаемый метод может быть рекомендован для иммобилизации целых клеток и клеточных компонентов за счет полисахаридной части клеточных стенок. Хроматографические носители, модифицированные бифункциональными бороновыми кислотами, могут успешно применяться в аффинной хроматографии для разделения и анализа диолсодер-жащих соединений, в частности, Сахаров.
На основе развиваемой теории и выявления основных закономерностей сорбшюнного взаимодействия белков с гелевыми носителями разработаны простые и эффективные методы и оптимальные условия сорбционной иммобилизации ферментов, в частности каталазы, на катионных и анионных полимерных гидрогелях. Получены высокоактивные полимерные комплексы каталазы, стабильные при хранении, при высоких температурах и при высоких концентрациях пероксида водорода, что резко расширяет области их применения.
Полученные в работе иммобилизованные ферменты могут найти применение в различных аналитических биосенсорных системах, в ингибиторном анализе токсичных соединений, в биоскрининге новых физиологически активных соединений, что продемонстрировано на примере холинэстеразной, каталазной и люшіферазной систем.
На защит}' выносятся следующие положения (в скобках указаны шифры специальностей, которым соответствует выносимое на защиту положение):
методы синтеза и исследования новых спейсеров на основе производных фе-нилбороновой кислоты для химической иммобилизации ферментов, корреляция их спектральных, хроматографических, физико-химических характеристик с химическим строением (02.00.10);
модели и теоретическое описание комплексообразования бороновых кислот с диолами и закономерности их взаимодействия в статических и динамических условиях (02.00.06, 02.00.10);
новый способ химической иммобилизации ферментов-гликопротеинов на активированных бифункциональными бороновыми кислотами носителях, на примере глюкозооксидазы и ацетилхолинэстеразы (02.00.10);
георетическое описание локального равновесного распределения белков между полимерными гидрогелями и внешним раствором на фоне низкомолекулярного электролита и некоторые подходы к описанию неравновесных сорбционных систем (02.00.06);
- закономерности и особенности сорбционного взаимодействия ферментов с новыми полимерными материалами - полимерными гидрогелями в зависимости от различных факторов внешней среды (02.00.06);
методы получения новых полимерных комплексов фермента (иммобилизованной каталазы), обладающих высокой ферментативной активностью, повышенной устойчивостью к действию температуры, рН, ингибиторов и стабильных при хранении (02.00.06);
методы анализа метаболитов, ингибиторов и токсичных соединений с исполь
зованием иммобилизованных ферментов (02.00.10).
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе на-іравления и постановке исследований, теоретическом обосновании задач, раз-)аботке методических подходов, непосредственном участии в проведении экс-іеримента, интерпретации и обобщении полученных результатов
Публикации и апробация работы. Основное содержание диссертации из-южеію в 62 печатных работах. Результаты работы докладывались на IV Всесо-озном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата, 1987), Международном симпозиуме "Новые достижения в жидкостной хромато-рафни" (Балатон-Цеплак, 1986), I Всесоюзном симпозиуме "Препаративная ;роматография физиологически активных веществ на полимерных сорбентах" Ленинград, 1988), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология: по-іучение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицине" Москва, 1991), XVIII Межвузовской конференции молодых ученых Современные проблемы физической химии растворов" (Ленинград, 1991), 36-)м Международном конгрессе ИЮПАК по макромолекулярной химии (Женева, 997), Международной конференции "Некоторые проблемы химии и физики юлисахарилов (целлюлоза, хитин, пектин) (Ташкент, 1997), Международном іикросимпозиуме "Коллоиды и поверхности" (Алматы, 1998), 2-ом Междуна-юдном симпозиуме по полиэлектролитам (Нагойя, 1998), Международной на-'чной конференции "Природные соединения - регуляторы метаболизма и адап-ации растений" (Алматы, 1999), 5-ом Международном симпозиуме ученых
тюрко-язычных стран по полимерам и полимерным композитам (Алматы, 1999), 4-ом и 5-ом Международных симпозиумах по полимерам для продвинутых технологий (РАТ-97, Лейпциг,1997; РАТ-99, Токио, 1999), Международных рабочих совещаниях "Неравновесность и неустойчивость динамических структур в природе" (Алматы, 1998) и "Неравновесные системы многих тел" (NEMBS-99, Алматы, 1999), 219-ой Международной конференции Американского химического общества (ACS Spring 2000, Сан-Франциско, 2000).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести разделов основной части, в которых обобщены результаты проведенных автором исследований, критически освещено состояние изучаемого вопроса в литературе, обоснованы направления и описаны экспериментальные методики исследований автора, заключения, списка использованных источников.
