Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 1
ГЛАВА I. БИОКАТАЛИЗ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ 5
/. 1. Биокатализ как составная часть биотехнологии 5
1.2. Гетерогенный биокатализ в промышленности 19
Гетерогенный катализ в пищевой промышленности 21
Гетерогенный катализ в производстве аминокислот 28
Биокатализ в фармацевтической промышленности и тонком органическом синтезе 31
Биокатализ в основном органическом синтезе и в производстве химикатов 34
ГЛАВА II. МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 58
Физико-химические методы исследования неорганических носителей 58
Методы иммобилизации ферментов и бактериальных клеток 60
Определение ферментативной активности 63
11.3.1. Оксидоредуктазы (лактатдегидрогеназа, адкогольдегидрогеназа,
глюкозооксидаза, тирозиназа) 64
Н.3.2. Бактериальные монооксигеназы 65
И.3.3. Протеолитические ферменты 67
Н.3.4. Аминоацилаза I 68
Глюкоамилаза, а-амилаза 68
Инвертаза 70
Определение стабильности биокатализаторов 72
Реакторы для гетерогенных биокаталитических процессов 73
ГЛАВА III. НЕОРГАНИЧЕСКИЕ НОСИТЕЛИ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ
///. 1.Носители оксидной природы (оксид алюминия) 76
1Н.2.Углеродсодержащие носители 78
111.2.1.Носители с поверхностным слоем пироуглерода 78
III.2.2 Носители с поверхностным слоем каталитического
волокнистого углерода 80
III.2.3. Носители с поверхностным графито-подобным слоем 86
Ш.З.Углеродные носители (Сибунит) 88
ГЛАВА IV. ГЕТЕРОГЕННЫЙ ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ БИОКАТАЛИЗ 94
IV.1. Ферменты класса оксидоредуктаз 94
IV.1.1. Иммобилизация лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы 95
IV.1.2. Иммобилизованная глюкозооксидаза как биокатализатор для
аналитического определения глюкозы 107
IV.2. Газо-ассимилирующие бактерии - селективные биокатализаторы прямого окисления низших алканов и алкенов
113
IV.2.1. Скрининг газо-ассимилирующих микроорганизмов, адсорбентов и
методов иммобилизации 114
IV.2.2. Гидроксилирование метана и эпоксидирование пропилена
метанотрофами Methylococcus capsulatus 118
IV.2.3. Эпоксидирование пропилена родококками Rhodococcus sp. 126
ГЛАВА V. ГЕТЕРОГЕННЫЙ БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ 132
V.1.Гидролиз белков протеолитическими ферментами 132
\/.2.Гидролиз ацетил-производных аминокислот
аминоацилазой I 139
V.3. Ферментативный гидролиз крахмала до крахмальных
латок и глюкозных сиропов 143
V.3.1. Сравнение каталитических свойств глюкоамилазы в растворе и в иммобилизованном состоянии
V.3.2. Иммобилизованная на неорганических носителях глюкоамилаза как
гетерогенный биокатализатор гидролиза декстринов 153
V.3.3. Макрокинетика гетерогенного процесса ферментативного гидролиза
декстринов 177
У.ЗАВихревые реактора для гетерогенного биокатализа 179
V.3.4.1. Роторно-инерционный биореактор 181
V.3.4.2. Вихревой погружной реактор 186
V\4. Инверсия сахарозы 191
V.4.1 Фермент дрожжевая инвертаза как активный компонент
гетерогенного биокатализатора для процесса инверсии сахарозы 195
V.4.2. Иммобилизация дрожжевых мембран пекарских дрожжей с
инвертазной активностью 201
V.4.3. Нерастущие клетки пекарских дрожжей как активный компонент
гетерогенного биокатализатора для процесса инверсии сахарозы 210
ГЛАВА VI. ЗАКОНОМЕРНОСТИ АДСОРБЦИОННОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ
И СТАБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ И НЕРАСТУЩИХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
КЛЕТОК НА НЕОРГАНИЧЕСКИХ НОСИТЕЛЯХ 214
VI. 1. Закономерности иммобилизации ферментов 214
VI.1.1. Выбор пористой структуры носителя 215
VI.1.2. Гидрофильно-гидрофобные свойства поверхности носителя 218
VI.1.3. Морфология поверхностного углеродного слоя 227
VI.2. Закономерности иммобилизации нерастущих
бактериальных клеток 232
Vl.2.1. Текстурные характеристики носителя 236
VI.2.2. Гидрофильно-гидрофобные свойства поверхности носителя 242
VI.2.3. Морфология поверхностного углеродного слоя 246
ВЫВОДЫ 252
ПРИЛОЖЕНИЕ. МЕДИЦИНСКИЕ ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ
ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ 256
1. Приготовление и исследование медицинских препаратов 257
Препараты для хирургии 257
Препараты для стоматологии 258
Биоспецифические сорбенты 260
2.Иммобилизованные протеазы для гнойной и ожоговой хирургии
3. Медицинские препараты для терапевтической стоматологии
266
3.1. Адсорбция антисептиков (фурациллина, хлоргексидина) и витамина Е
на углеродсодержащих энтеросорбентах 267
3.2.Адсорбция є-аминокапроновой кислоты на углеродсодержащих
энтеросорбентах 273
4. Биоспецифические сорбенты ТІЇ
ЛИТЕРАТУРА 284
БЛАГОДАРНОСТИ
Введение к работе
Биокатализ как составная часть биотехнологии является по существу междисциплинарным направлением, успешное развитие которого требует совместных усилий квалифицированных специалистов самого различного профиля. Очевидно, что достижения в области биокатализа определяются развитием различных отраслей науки (на схеме), прежде всего, микробиологии, биохимии, химической технологии.
Биокаталитические процессы разрабатываются для решения исключительно практических задач целенаправленного превращения исходного реагента S (субстрата) в коммерчески привлекательный, востребованный рынком продукт Р (S=?P на схеме), причем для этого используется, как правило, одна ферментативная реакция. Особенности данных процессов (по сравнению с химическим катализом) заключаются в том, что, все превращения S=>P протекают стерео- и регио-специфично с образованием одного из изомеров с высоким энантиомерным избытком (>80%е.е.); со 100%-иои селективностью, не зависящей от величины конверсии исходного реагента; все биокаталитические превращения протекают исключительно в жидких, преимущественно, водных средах.
Существует два направления - гомогенный биокатализ, направленный на разработку периодических жидкофазных процессов, и гетерогенный биокатализ, основной задачей которого является разработка непрерывных многофазных процессов с участием иммобилизованных ферментативно-активных субстанций. Общепризнанно, что при промышленном масштабировании биокаталитических процессов гетерогенный режим их проведения является экономически выгодным по сравнению с гомогенными технологиями.
Гетерогенный биокатализатор, приготовленный путем иммобилизации фермен-тативно-активных субстанций (либо индивидуального фермента, либо клеточных мембран, либо целых микроорганизмов) - это основа любого промышленного процесса при условии, что данный биокатализатор обладает высокой активностью, и что более важно, высокой стабильностью в условиях производства, а также сравнительно низкой стоимостью.
Неорганические носители как носители для иммобилизации ферментативно-активных субстанций (ФАС) и приготовления промышленных биокатализаторов обладают очевидными преимуществами перед органическими, а именно, эти носители относительно дешевы и доступны; имеют высокую механическую прочность и низкое гидродинамическое сопротивление; инертны и устойчивы в водных средах; и, что особенно важно, свойства неорганических носителей, их геометрическую форму, текстурные характеристики, химические свойства и морфологию поверхности можно варьировать в очень широких пределах. Тем не менее, не более 1А всех научных и прикладных работ посвящено использованию данных носителей для иммобилизации. Возможно, это объясняется тем, что неорганические носителя не являются традиционными объектами исследований для специалистов из области биотехнологии, биохимии и энзимологии, и недостаток знаний о свойствах неорганических носителей приводит к отсутствию интереса к ним.
Основная цель данной работы заключается в разработке научных основ приготовления высокостабильных гетерогенных биокатализаторов с использованием неорганических носителей. Целью работы являются исследования в области современного аппаратурного оформления гетерогенных биокаталитических процессов, а именно, разработка новых типов высокопроизводительных реакторов.
Для достижения поставленных целей следует решить следующие задачи:
1. Изучить закономерности иммобилизации и стабилизации ферментативно-активных суб
станций (ферментов, клеточных мембран, нерастущих микроорганизмов) на неорганических
носителях, отличающихся следующими характеристиками:
геометрической формой (гранулы, сотовые монолиты) и макроструктурой (пено-материалы),
текстурой (удельной поверхностью, пористой структурой),
химической природой и гидрофильно-гидрофобными свойствами поверхности (при наличии или отсутствии углеродного слоя)
морфологией поверхностного углеродного слоя.
2. Исследовать во взаимосвязи биокаталитические свойства приготовленных гетерогенных
биокатализаторов (ферментативная активность, стабильность) с характеристиками неоргани
ческих носителей.
Исследовать кинетические закономерности различных гетерогенных биокаталитических процессов, контролируемых диффузией субстрата к иммобилизованным на неорганических носителях ФАС, в том числе, процессов гидролиза возобновляемого растительного сырья в востребованные сахаристые крахмалопродукты.
Испытать новые конструкции вихревых реакторов, специально сконструированных для геьтерогенного биокатализа, в которых решены проблемы интенсификации массопереноса субстрата к иммобилизованному ферменту.
Диссертация состоит из 6 глав. Результаты систематических исследований и их обсуждение приведены в главах IV-V. В начале разделов этих глав помещены краткие литературные обзоры, и проведен анализ современного состояния проблемы за последние 5 лет. В главе VI обобщены, систематизированы и проанализированы известные из литературы и все собственные результаты для того, чтобы выявить закономерности иммобилизации и стабилизации ФАС на неорганических носителях. В конце разделов имеются списки научных публикаций автора, где можно найти все первичные экспериментальные данные.
Материалы диссертации опубликованы в 51 научных статьях в рецензируемых журналах и представлены в виде тезисов на 43 Российских и Международных конференциях и симпозиумах. По материалам диссертации защищены. 17 патентов.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Ферменты
АДГ - алкогольдегидрогеназа
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
ГО - глюкозооксидаза
ТЗ - тирозиназа
МО - монооксигеназа
ММО - метанмонооксигеназа
ПОХ - нейтральная протеаза Протосубтилин из Bacillus subtilis
ЩП - щелочная протеаза из Bacillus subtilis
ДРЖ - щелочная протеаза из дрожжей Дрожжелитин
АА - аминоацилаза I
ГАМ - глюкоамилаза
ИНВ - инвертаза Ко-ферменты, реагенты
НАД4/ НАД-Н - никотинаденин динуклеотид окисленный / восстановленный
ГА - глутаровый альдегид
КД - карбодиимид
ПО - пропиленоксид Носители
КВУ - каталитический волокнистый углерод
Г - графит, графито-подобный углерод
СУМС - сферический углерод-минеральный сорбент
П - пенокерамика
М - монолит сотовый
МА - монолит сотовый алюмосиликатный
МК - монолит сотовый кордиеритовый, или корундовый
К - керамзит
С - стеклопена (пеностекло), или «Сапропель», или Сибунит
Л - лигнин Методы
ЕА - единица активности, равная скорости ферментативной реакции, ммоль/мин
ОП - оптическая плотность
СЭМ - сканирующая электронная микрофотография
БЭТ (BET) - метод Брунауэра-Эммета-Теллера для определения удельной поверхности носителей по термодесорбции аргона Реакторы
ДИФР - дифференциальный безградиентный реактор
РЕНЕС - реактор с неподвижным слоем катализатора
РИБ - роторно-инерционный биореактор
ВИПР - вихревой погружной реактор Биологически активные вещества
ФАС - ферментативно-активная субстанция
БСА - бычий сывороточный альбумин
АКК - є-аминокапроновая кислота
