Содержание к диссертации
Содержание 2
Введение 5
Актуальность проблемы 5
Задачи исследования: 6
Научная новизна работы 7
Практическая значимость работы 8
Часть I. Обзор литературы 9
1. Кислород, его активные формы и аэробный метаболизм 9
2. Источники активных форм кислорода в клетке 12
Дыхательная цепь митохондрий 12
Цитохром Р-450 в гладком эндоплазматическом ретикулуме... 13
Цитохром оксидазы в ядерной мембране 13
Пероксисомальные ферменты 13
NADP(H) оксидаза и цитохром Ь558 в цитоплазматической мембране 14
Цитоплазматические ферменты, генерирующие АФК 14
Неферментные источники АФК 14
3. Активные формы кислорода, как сигнальные молекулы 15
4. Причины нарушения кислородного гомеостаза в органах и тканях 16
Различие между гипоксией и аноксией 17
5. Клеточные сенсоры нарушения кислородного гомеостаза 18
Митохондрия, как рецептор концентрации кислорода 18
NADP(H) оксидаза, как рецептор концентрации кислорода 20
Механизм кислородной регуляции фактора HIF-a 21
6. Нарушение внутриклеточного гомеостаза кальция при гипоксии
7.Активация протеинкиназ при снижении парциального давления кислорода 26
Протеинкиназы группы МАРК 26 Протеин киназы С 29
8. Молекулярные механизмы адаптации к гипоксии 31
9. Регуляция экспрессии генов при гипоксии 34
Гены, отвечающие за метаболизм железа 36
Гены, отвечающие за регуляцию работы сосудов .37
Гены, отвечающие за метаболизм глюкозы 38
Гены, отвечающие за запуск программы клеточной смерти 38
10. Молекулярные механизмы клеточной смерти, вызванной гипоксией 39
Особенности апоптоза, включающего в себя стадии активации каспаз и выхода цитохрома с 41
Особенности апоптоза, не включающего в себя стадии активации каспаз и выхода цитохрома с 43
И. Методы определения снижения концентрации кислорода в тканях 45
12. Методы повышения устойчивости клеток и тканей к действию гипоксии... 47
Часть II. Материалы и методы 51
1. Экспериментальная модель 51
2. Выделение и электрофорез ДНК 51
3. Выделение митохондрий и приготовление митопластов 52
4. Исследование функциональной активности митохондрий 53
5. Определение содержания цитохрома с в суспензиях митохондрий и супернатантах 54
6. Иммуногистохимия 55
7. Электронная микроскопия 56
Часть III Экспериментальные результаты и обсуждение 57
1. Модель срезов ткани миокарда, переживающих в условиях аноксии 57
2. Ультраструктура и динамика изменений функциональной активности митохондрий ткани миокарда в условиях аноксии 60
Изменения ультраструктуры мембран митохондрий в условиях аноксии 61
Основные стадии изменений системы окислительного фосфорилирования в условиях аноксии 61
Пермеабилизация мембран митохондрий в условиях аноксии...65
Связывание цитохрома с митохондриями в составе ткани и в суспензии в условиях открытой неспецифической поры 66
Два механизма нарушения интактности внешней мембраны митохондрий миокарда в условиях аноксии 73
3. Динамика и молекулярный механизм индукции "цитохром с независимого" апоптоза в ткани миокарда в условиях аноксии 75
Динамика индукции апоптоза в ткани миокарда в условиях аноксии 75
Образование неспецифической поры в митохондриях необходимая стадия индукции "цитохром с - независимого" апоптоза в аноксии 77
4. Обсуждение результатов 81
Два типа апоптоза, возникающего в кардиомиоцитах при
снижении парциального давления кислорода 82
Вероятная схема ключевых стадий апоптоза, протекающего в ткани миокарда в условиях аноксии 84
Открывание поры в митохондриях в процессе развития апоптоза при аноксии 85
Почему цитохром с не выходит из митохондрий с открытой порой в условиях аноксии 89
Заключение 92
5. Выводы 94
Благодарности 96
Список работ, опубликованных по теме диссертации 97
Список литературы 99
Введение к работе
Для аэробных форм жизни кислород является одним из важнейших метаболитов. С одной стороны, молекулярный кислород - конечный акцептор электронов при дыхании аэробных организмов, с другой стороны, активные формы кислорода (АФК) - это молекулы, играющие огромную роль во внутриклеточной и межклеточной сигнализации. В процессе онтогенеза, а также при некоторых патологиях в тканях могут возникать области с пониженным содержанием кислорода. Падение парциального давления кислорода в тканях индуцирует включение ряда сигнальных систем. В частности при гипоксии может происходить активация апоптоза или пролиферации. Самым активным потребителем кислорода в организме млекопитающих является ткань миокарда. Снижение уровня кислорода приводит к нарушению ее функции. Реакция тканей сердца на снижение парциального давления кислорода активно изучается во многих лабораториях. Наибольший интерес представляет изучение изменений, происходящих в митохондриях, так как кислород является одним из основных субстратов для этих органелл и снижение его концентрации, с одной стороны, приводит к нарушениям энергетики клетки, а с другой стороны, резко изменяет скорость генерации АФК в дыхательной цепи. Кроме этого митохондрия контролирует запуск апоптоза, который часто индуцируется в кардиомиоцитах в условиях гипоксии. В большинстве исследуемых моделей изучается быстрая реакция ткани на гипоксию, опосредованная окислительным стрессом, связанным с повышением скорости генерации АФК. В случае полного отсутствия кислорода (аноксии), когда генерация АФК невозможна, изменения в ткани миокарда развиваются более медленно. Изучение механизмов изменений, происходящих в ткани миокарда, при длительном анаэробиозе осложняется тем, что в таких условиях возникает значительное (более 2 единиц) снижение рН, вызванное активацией гликолиза. Сильное снижение рН приводит к некрозу тканей, как в аэробных, так и в анаэробных условиях. До настоящего времени изменения, происходящие в кардиомиоцитах в условиях длительной аноксии при слабом (около 1 единицы) снижении рН, исследовались лишь на моделях переживающих клеточных культур. Подобные исследования на сердечных тканях не проводились. До сих пор остаются неизвестными изменения структуры и функции митохондрий в составе ткани миокарда, происходящие в условиях длительной аноксии, а также механизм клеточной смерти, который развивается в этой ткани при полном отсутствии кислорода и без сильных изменений рН.
Цель работы - изучить изменения системы митохондриальной энергетики в ткани миокарда, происходящие в условиях длительной аноксии при отсутствии значительного снижения рН, и определить особенности механизма клеточной гибели, протекающей в этой ткани при полном отсутствии кислорода.
Задачи исследования:
1. Разработать экспериментальную модель, позволяющую исследовать биохимические изменения, происходящие в ткани миокарда в условиях продолжительной аноксии.
2. Исследовать изменения ультраструктуры и функции митохондрий в составе ткани миокарда, происходящие в условиях длительной аноксии:
а) изучить изменения системы окислительного фосфорилирования,
б) изучить изменения проницаемости митохондриальных мембран, в) установить изменения ультраструктуры митохондрий. 3. Изучить особенности механизма клеточной гибели кардиомиоцитов, запускаемой в ткани миокарда в анаэробных условиях.
Научная новизна работы
В работе найдены условия, при которых в переживающей в бескислородной среде ткани миокарда сохраняется ультраструктура миофибрилл и дыхательная активность митохондрий в течение 1-3 суток. В ткани миокарда впервые зарегистрирована индукция особого типа апоптоза, который характеризуется специфичной межнуклеосомной фрагментацией ДНК и не сопряжен с выходом цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий. С помощью ингибиторного анализа доказано, что данный тип апоптоза включает в себя стадию открывания неспецифической поры в митохондриях. Показано, что открывание неспецифической поры является необходимым условием активации эндонуклеаз. Обнаружено, что в составе ткани миокарда митохондрии могут удерживать цитохром с в межмембранном пространстве в условиях открытой поры. Обнаружено, что в условиях аноксии целостность внешней мембраны митохондрий может нарушаться независимо от процесса открывания циклоспорин А чувствительной поры. Однако такое нарушение не приводит к индукции апоптоза. Изучена динамика изменения функции системы окислительного фосфорилирования митохондрий, а также изменения ультраструктуры митохондриальиых мембран, происходящие в ткани миокарда во время длительной инкубации в аноксических условиях. Практическая значимость работы
Разработана новая экспериментальная модель для изучения процессов, происходящих в ткани миокарда в условиях длительной аноксии. Продемонстрирована возможность использования данной модели для поиска и исследования механизмов действия биологически активных веществ, обладающих кардиопротекторными свойствами.
