Введение к работе
Актуальность темы исследования. Известно, что физико-химические свойства органических и биоорганических веществ, характер внутри- и межмолекулярных взаимодействий зависят от пространственного строения молекул. Установление пространственной структуры молекул, изучение их подвижности в широком диапазоне времён корреляции молекулярного движения, определение параметров взаимодействия с другими молекулами (образования комплексов) являются первостепенными задачами химической и биологической физики.
Спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО, в английском варианте - nuclear Overhauser effect spectroscopy, NOESY) является одним из эффективных методов получения структурной информации. Этот метод ограниченно применим к молекулам, удовлетворяющим условию быстрого движения (0-xc << 1, где ю0 - частота ларморовой прецессии, Tc - время корреляции молекулярного движения), и удобен при изучении молекул и молекулярных образований (комплексов), подпадающих под условие медленного движения (0-Tc >> 1). В случае неэффективности данного подхода применяют альтернативные методы ЯМР, например, спектроскопию ЯЭО во вращающейся системе координат, релаксационные измерения, анализ величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия (ОДДВ, в английском варианте - residual dipolar coupling, RDC).
При связывании молекул малой молекулярной массы (например, олигопептида) с мицеллами на основе поверхностно-активного вещества образуется комплекс, молекулярная масса которого значительно превосходит массу несвязанной молекулы. С точки зрения методических аспектов ЯМР, исследуемое низкомолекулярное соединение переходит из разряда малых молекул (условие быстрого движения) в разряд молекул, подпадающих под условие медленного движения. Таким образом, спектроскопия ЯМР NOESY может быть использована при решении структурных задач для небольших по количеству аминокислотных остатков пептидов.
Целью работы являлось определение пространственной структуры (координат атомов в формате PDB) биологически активных пептидов методами одно- и двумерной спектроскопии ЯМР (NOESY, TOCSY и др.), а также с использованием подхода, основанного на анализе величин остаточного диполь- дипольного взаимодействия.
Для установления пространственного строения соединений, время корреляции молекулярного движения которых в растворе соответствует режиму быстрого движения (0-Tc << 1), решалась задача повышения эффективности метода двумерной спектроскопии ЯМР NOESY, достигаемого за счёт образования комплекса изучаемых молекул с тяжёлыми надмолекулярными образованиями - мицеллами поверхностно-активного вещества.
Задачей исследования также являлось установление конформационного состава и определение термодинамических параметров конформационного обмена для циклоспорина, находящегося в состоянии равновесия нескольких конформеров.
Объекты исследования. В работе проведены исследования следующих пептидов: дипептида yGlu-Trp, трипептида Gly-Gly-His, декапептида с аминокислотной последовательностью Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly и циклоспорина А ^«^o(-Bmt-Abu-Sar-Mle-Val-Mle-Ala-DAla-Mle-Mle-Mva-) (краткое обозначение CsA). Дипептид гамма-глутамил-триптофан и циклоспорин представляют собой активные компоненты лекарственных препаратов. Так, дипептид проявляет антибактериальную и противовоспалительную активность, циклоспорин CsA подавляет отторжение пересаженных тканей. Трипептид и декапептид служили модельными объектами для отработки методов спектроскопии ЯМР молекул малой молекулярной массы в растворах и в комплексе с модельными мембранами.
Научная новизна состоит в следующем:
Показана принципиальная возможность использования двумерной спектроскопии ЯМР NOESY для определения внутримолекулярных межпротонных расстояний в соединениях, подпадающих под условие быстрого движения, при образовании комплекса этих соединений с тяжёлыми надмолекулярными образованиями - мицеллами поверхностно-активного вещества (анионным ПАВ - додецилсульфатом натрия, ДСН). Данный подход впервые был опробован при исследовании методами спектроскопии ЯМР трипептида Gly-Gly-His и декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly в водных растворах, содержащих мицеллы ДСН. Методом двумерной спектроскопии ЯМР NOESY определены координаты атомов (в формате PDB) декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly в комплексе олигопептид - модель мембраны (мицеллы на основе додецилсульфата натрия).
Анализом величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия 1D(QH) впервые определено пространственное строение дипептида yGlu-Trp и циклоспорина CsA. Дипептид yGlu-Trp исследован в растворе лиотропной жидкокристаллической системы на основе н-алкил-полиэтиленгликоля (C12E5), гексанола и воды. Впервые получены величины гетероядерного остаточного диполь-дипольного взаимодействия 1D(C,H) для циклоспорина CsA, растворённого в анизотропной среде - деформированном геле из полистирола, набухшего в хлороформе. На основании величин 1D(C,H) было установлено пространственное строение преимущественной конформации циклоспорина в этой среде.
На основании данных о межпротонных расстояниях (спектроскопия ЯМР NOESY) в совокупности с расчётом методом молекулярной динамики (программа XPLOR-NIH) впервые установлена пространственная структура циклоспорина CsA в комплексе с мицеллой на основе поверхностно-активного вещества - додецилсульфата натрия. Проведено сравнение структур, существующих в неполярных органических средах и в комплексе с мицеллами в растворе.
Анализом одно- и двумерных спектров ЯМР (модификации COSY, TOCSY, NOESY) впервые установлен информационный состав циклоспорина CsA и определены термодинамические параметры конформационного равновесия в растворе хлороформа. Определённая экспериментально разница свободных энергий конформеров, свободная энергия активации, а также картина изменения химических сдвигов в минорном конформере по сравнению с преимущественным позволили описать пространственное строение минорного конформера.
Научная и практическая значимость.
Продемонстрированная возможность использования двумерной спектроскопии ЯМР NOESY для соединений, подпадающих под условие быстрого движения, существующих в комплексе с тяжёлыми надмолекулярными образованиями - мицеллами поверхностно-активного вещества, - приводит к более информативным двумерным спектрам ЯМР NOESY, что, в свою очередь, позволяет получать количественную информацию о межпротонных расстояниях в таких соединениях.
Координаты атомов (в формате PDB), входящих в состав изученных олигопептидов (дипептида yGlu-Trp, циклоспорина ^M^o(-Bmt-Abu-Sar-Mle- Val-Mle-Ala-DAla-Mle-Mle-Mva-)), определённые путём анализа экспериментальных значений 1D(QH) и спектров ЯМР NOESY, могут быть использованы при сравнении с координатами атомов аналогичных аминокислотных последовательностей (в частном случае - фрагментов цепей полипептидов).
Данные о пространственном строении циклоспорина CsA в связанном с модельной мембраной состоянии позволяют строить обоснованные модели того, как молекула циклоспорина может размещаться в клеточной мембране и взаимодействовать с другими молекулами, такими, так интегральные белки.
Описание пространственного строения минорного конформера циклоспорина даёт представление о нежёстком участке пептидной цепи, и эта информация может быть полезна при анализе взаимодействий циклоспорина CsA с другими молекулами.
Обоснованность и достоверность результатов подтверждается взаимным соответствием данных спектроскопии ЯЭО (NOESY) и анализа величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия (в случае, когда были одновременно получены оба типа данных); согласием измеренной свободной энергии активации и скорости обмена для циклоспорина в хлороформе с литературными данными о типичных параметрах для цис-транс изомеризации пептидов; использованием современного оборудования и программных средств.
Личный вклад автора: регистрация одно- и двумерных спектров ЯМР, создание вспомогательных программных средств для анализа спектров, написание статей по теме проведённых исследований. Автору принадлежат результаты интерпретации спектров ЯМР (информация о геометрии исследованных соединений) и результаты компьютерного моделирования молекулярных структур.
На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: XII и XV Молодёжных школах «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложения» (Казань, 2009, 2012), Международном симпозиуме и летней школе «ЯМР в конденсированных средах» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской молодёжной школе «Магнитный резонанс в химической и биологической физике» (Новосибирск, 2010), 7 Зимней молодёжной школе-конференции «Магнитный резонанс и его приложения» (Санкт-Петербург, 2010), V Всероссийской конференции «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (Казань, 2011), X и XI Научных конференциях молодых учёных, аспирантов и студентов НОЦ КФУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2011, 2012), Молодёжной школе «Магнитный резонанс и магнитные явления в химической и биологической физике» (Новосибирск, 2012).
Диссертационная работа выполнена в лаборатории ЯМР Института физики КФУ и, частично, в Институте аналитической химии Лейпцигского университета. Исследования были поддержаны Министерством образования и науки Российской Федерации (ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.), Министерством образования и науки Республики Татарстан (совместная программа МОиН РТ / DAAD «Алгарыш», программа «Евгений Завойский»), грантом РФФИ 09-03-00077_а. Часть работы выполнена в рамках работы ФЦКП ФХИ в Казанском (Приволжском) федеральном университете и научно-образовательного центра «Биомедицинская радиоспектроскопия и оптика».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах и 9 работ в сборниках трудов и тезисов вышеперечисленных конференций различного уровня.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, приложения, списка цитируемой литературы из 120 наименований и списка публикаций автора. Работа изложена на 133 страницах.
Похожие диссертации на Пространственное строение биологически активных пептидов в растворах и в комплексе с модельной мембраной по данным двумерных методов спектроскопии ЯМР
![Двумерная спектроскопия ЯМР NOESY в изучении пространственной структуры мономерных и димерных производных каликс[4]аренов в растворах](/i/i/4433/297326.png "Двумерная спектроскопия ЯМР NOESY в изучении пространственной структуры мономерных и димерных производных каликс[4]аренов в растворах Гадиев Тимур Артурович")
