Введение к работе
Актуальность темы исследования Одной из важнейших задач химической и биологической физики является установление пространственного строения органических и биоорганических соединений. Хорошо известно, что биологическая активность протеинов связана с их пространственным строением. Изучение конформаций олигопептидов также важно, так как они являются структурными блоками полипептидов, и знание их пространственного строения может быть использовано для предсказания конфигурации цепей протеинов Кроме того, многие из олигопептидов обладают фармакологическими свойствами, а некоторые короткие пептидные последовательности, синтезируемые клеткой, являются частью иммунной системы живого организма.
Традиционно исследования пространственного строения органических соединений в растворах основаны как на данных одномерной ЯМР спектроскопии, включая динамический ЯМР, так и на использовании современных подходов в ЯМР, таких как двумерная ЯМР NOESY спектроскопия (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера и обмена), которая позволяет определять расстояния между магнитными ядрами, отстоящими друг от друга на расстоянии до 5 А. К сожалению, применение двумерной NOESY ЯМР спектроскопии к исследованию низкомолекулярных органических соединений,
подпадающих под условие быстрого движения (СО о * Тс« 1, где Тс - время корреляции
молекулярного движения, СОо - угловая скорость прецессии магнитных ядер) не всегда эффективно В этом случае наблюдаются слабые по интенсивности кросс-пики в спектрах ЯМР NOESY, что затрудняет получение количественной информации о межпротонных расстояниях в таких системах
Среди направлений в приложениях ЯМР спектроскопии особое место занимает подход к определению конформаций молекул, растворенных в магнитно-ориентированных лиотропных жидкокристаллических системах (Tjandra N, Вах A, Science, 1997) В его основе лежит анализ остаточного диполь-дипольного взаимодействия (residual dipolar couplings, RDC) между магнитными ядрами С недавних пор этот подход активно используется при исследованиях методом ЯМР биохимических объектов, таких как полипептиды и позволяет независимым образом определять структуру этих соединений в растворах. Актуальным является приложение этого подхода к определению конформаций молекул, подпадающих под условие быстрого движения, к которым относятся и олигопептиды
Задача частичного ориентирования исследуемых органических молекул в магнитном поле требует поиска и подбора подходящих лиотропных жидкокристаллических сред, включающих ламеллярную (La) - фазу В литературе есть описание некоторых лиотропных сред, однако в этих работах не приводятся фазовые диаграммы ламеллярного состояния для них, определенные методом ЯМР спектроскопии, что осложняет использование смесей при определении остаточного диполь-дипольного взаимодействия. Поскольку, большинство органических соединений растворимы лишь в органических растворителях, то выявление лиотропных смесей на их основе также являлось важной задачей
Цель работы определение пространственного строения олигопептидов, содержащих в цепи от двух до четырех аминокислотных остатков, с использованием подхода, основанного на анализе величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия, проявляющегося при растворении пептидов в лиотропных жидкокристаллических средах В
качестве пар магнитных ядер выбраны ядра ,3С и 'Н, разделенные одной химической связью, как единственно возможные при исследованиях олигопептидов с естественным содержанием изотопов.
Необходимость апробации подхода к определению конформации олигопептидов, подпадающих под условие быстрого движения, определила дополнительную задачу: исследование стереоизомеров тиакаликс[4]арена, подпадающих под это условие при комнатной температуре и низкой концентрации их в растворе.
Физико-химические свойства исследованных соединений определили необходимость поиска лиотропных магнитно-ориентированных сред, обладающих ламеллярными свойствами в широком диапазоне температур и концентраций, включая среды на основе органических растворителей Решение этой задачи и определение границ существования ламеллярной фазы для этих сред методом ЯМР спектроскопии являлось условием достижения выше обозначенной цели.
В качестве объектов исследования выбраны дипептид Glu-Trp, являющийся основной составляющей лекарственных средств; трипептиды Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-GIy-Tyr, Glu-Cys-GIy, которые используются в качестве лигандов в комплексах с Си (II) и применяются в качестве моделей активных центров ферментов; тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe - актуальная модель исследования межмолекулярных взаимодействий пептидов с растворителями
Научная новизна работы определяется следующим:
Показана принципиальная возможность использования подхода, основанного на определении и анализе остаточных диполь-дипольных взаимодействий между магнитными ядрами |3С и 'Н, разделенными одной химической связью ('Dch) для описания пространственного строения соединений, подпадающих под условие быстрого движения. С помощью этого подхода впервые удалось различить конформации конус и 1,3-альтернат для изомеров тетратиакаликс[4]арена Результат подтвержден двумерными ЯМР NOESY ('Н-'Н) экспериментами, проведенными для этих соединений в изотропном растворителе CDCb.
На основании анализа величин Dch впервые определено пространственное строение ряда олигопептидов, имеющих важное практическое приложение: дипептида Glu-Trp, трипептидов Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-GIy-Tyr; Glu-Cys-GIy и тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe.
Впервые метод Н ЯМР предложен для определения границ существования магнитно-ориентированной ламеллярной La - фазы в координатах температура - концентрация мицеллообразующих соединений, основанный на рассмотрении квадрупольного расщепления ЯМР сигналов 2Н дейтерированной воды
Впервые; предложена и изучена лиотропная жидкокристаллическая система п-алкил-поли(этилен)гликоль (Ci2Ej, где С„ означает число атомов углерода в углеводородной цепи, а Ет число гликольных фрагментов), диметилсульфоксид и вода, которая может быть использована для частичного ориентирования нерастворимых (или плохо растворимых) в воде органических или биоорганических молекул; методом 2Н ЯМР определены фазовые диаграммы ламеллярного состояния для предложенной системы.
Методом 2Н ЯМР впервые определены границы ламеллярной La -фазы в координатах температура - концентрация п-алкил-поли(этилен)гликоля в воде для лиотропных жидкокристаллических систем на основе С„Е„, - октанол и вода Показано, что
предложенная нами система С12Е5 - октанол и вода проявляет искомые ламеллярные свойства в более широком диапазоне температур и концентраций, чем известная система CgE3 - октанол и вода.
Научная и практическая ценность
1 Координаты атомов (в pdb формате), входящих в состав изученных олигопептидов
(дипептид Glu-Trp, трипептиды Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Туг; Glu-Cys-GIy и
тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe), определенные путем анализа экспериментальных
значений 'Dch, могут быть использованы при сравнении с координатами атомов
аналогичных аминокислотных последовательностей (в частном случае фрагментов цепей
полипептидов).
2 Предложенные лиотропные жидкокристаллические системы могут быть
использованы для частичного ориентирования как воднорастворимых соединений [система
п-алкил-поли(этилен)гликоль (C|2Ej) - октанол - вода], так и соединений, растворимых
лишь в органических растворителях [система диметилсульфоксид - п-алкил-
поли(этилен)гликоль (С12Е5) - вода]
3 Способ определения границ существования ламеллярной магнитно-
ориентированной La - фазы, основанный на рассмотрении квадрупольного расщепления
ЯМР сигнала Н дейтерированной воды, может быть применен при исследованиях фазовых
состояний различных лиотропных сред.
Обоснованность и достоверность результатов подтверждается:
а) использованием подхода, основанного на анализе остаточного диполь-дипольного взаимодействия в исследованиях строения полипептидов и белков; б) согласием с аналогичными исследованиями, проводимыми с помощью других подходов в ЯМР спектроскопии (например, с данными двумерной ЯМР NOESY спектроскопии, в тех случаях, где это было возможно); в) использованием современного ЯМР оборудования и программного обеспечения
Результаты исследований обсуждались в рамках научных конференций, а также в известных научных изданиях, где анализировались на предмет достоверности.
На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах
Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на VII - ой Молодежной научной школе «Новые аспекты применения магнитного резонанаса» (г. Казань, 2003); на XVII - м Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г Казань, 2003); на II - ой Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов (г. Ростов-на-Дону, 2003), на IV - й Научной конференции Молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (г. Казань, 2004); на VII - м Международном семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология) (г Ростов-на-Дону, 2004), на IV - м Всероссийском семинаре "Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях" (г Казань, 2005); на X, XI, XII и XIII - й Всероссийских конференциях "Структура и динамика молекулярных систем" (г. Йошкар-Ола, 2003 - 2006) и на Итоговой конференции Казанского государственного университета (Казань, 2007).
Работа, на отдельных этапах, выполнялась в соответствии с Техническими заданиями Грантов РФФИ (03-03-ЗЗШа, 06-03-32101а), программы "Развитие научного потенциала Высшей школы" и гранта Казанского государственного университета (НИР КГУ № 1.3.03, ЕЗН-тема"СДМС")
По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах и 11 работ в сборниках статей и тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 129 страницах, содержит 62 рисунка и 14 таблиц. Список цитированной литературы содержит 99 наименований.
В первой главе представлены общие вопросы одно- и двумерной ЯМР спектроскопии, а также принципы подхода к определению конформаций органических молекул растворенных в лиотропных магнитно-ориентированных жидкокристаллических системах, основанного на анализе остаточного диполь-дипольного взаимодействия между магнитными ядрами. Во второй главе рассмотрена спектроскопия ЯМР ориентированных молекул как метод структурного анализа, описаны типы жидкокристаллических сред, используемых в спектроскопии ЯМР для слабого ориентирования молекул В данной части работы представлены и оригинальные исследования методом ЯМР спектроскопии лиотропных жидкокристаллических систем, их свойств, в частности, представлены фазовые диаграммы ламелляркого состояния (в координатах концентрация компонентов -температура раствора) для некоторых известных лиотропных средах и средах предложенных нами. В третьей главе рассмотрена возможность использования подхода, основанного на анализе остаточных диполь-дипольных взаимодействий между магнитными ядрами С и 'Н, разделеных одной химической связью ('Dch), Для органических соединений, подпадающих под условие быстрого движения Показана принципиальная возможность применения этого подхода для установления пространственного строения изомеров тиакаликс[4]арена. Подход использован при установлении пространственного строения ряда олигопептидов: дипептида Glu-Trp; трипептидов Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr; Glu-Cys-Gly; тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe. В четвертой главе описана техника и методика проведения эксперимента и измерений, условия приготовления образцов.
