Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Двигательная активность обонятельных жгутиков 11
1.2. Энергообеспечение подвижности обонятельных жгутиков 22
1.3. Математичес кие модели цилиарных структур 27
2. Объект, материалы и методы исследования 31
2.1. Метод математического моделирования 31
2.2. Объект исследования 31
2.3. Методы экспериментального исследования 32
2.3.1. Схема установки 33
2.3.2. Фармакологический анализ 36
2.3.3. Методика обработки полученных экспериментальных данных 45
2.4. Методический эксперимент 47
2.4.1.Подбор условий наблюдения жгутиков обонятельных клеток 47
2.4.2. Подбор рабочих концентраций азида натрия, 2,4- динитрофенола, ротенона и ФКЦФ 48
3. Математическое моделирование движения жгутиков обонятельных клеток 51
3.1. Разработка и обоснование математической модели движения жгутиков обонятельных клеток 51
3.1.1. Обоснование математической модели 53
3.1.2. Разработка математической модели 54
3.2. Алгоритм реализации математической модели 59
3.3. Качественные и количественные характеристики и параметры движения обонятельных жгутиков 62
4. Результаты экспериментального анализа двигательной активности жгутиков обонятельных клеток 67
4.1. Механизм энергообеспечения двигательной активности обонятельных жгутиков в отсутствие одорантов 67
4.2. Действие различных одорантов на характер движений о бонятельных жгутиков 71
4.3. Механизм энергообеспечения двигательной активности обонятельных жгутиков при действии различных одорантов 72
4.3.1. Действие одорантов на фоне азида натрия и ротенона 72
4.3.2. Действие одорантов на фоне 2,4-динитрофенола, ФКЦФ иолигомицина 90
4.4. Результаты регрессионного анализа 92
5. Проверка адекватности математической модели 97
5.1. Моделирование движения жгутиков в условиях отсутствия одорантов 98
5.2. Моделирование движения жгутиков в присутствии одорантов 103
5.3. Моделирование движения жгутиков обонятельной клетки в ответ на действие различных одорантов в отсутствие заданной деформации 105
Обсуждение полученных результатов 109
Выводы 122
- Энергообеспечение подвижности обонятельных жгутиков
- Методы экспериментального исследования
- Алгоритм реализации математической модели
- Моделирование движения жгутиков в присутствии одорантов
Введение к работе
Актуальность проблемы
В обонятельных жгутиках сосредоточена сложная молекулярная система рецепции запахов. В их плазматической мембране локализованы рецептори ые белки, с которыми связаны сигнальные системы обонятельных клеток, осуществляющие трансдукцию химического стимула в электрический сигнал. В современной мировой науке исследование молекулярных механизмов взаимодействия одорантов с рецепторами рассматривается как одна из актуальнейших проблем. Жгутики обладают подвижностью, которую обеспечивают как тубулин-динеиновая, так и актин-миозиновая системы. Однако роль двигательной активности обонятельных жгутиков в рецепции одорантов изучена недостаточно полно. Имеются лишь отдельные разрозненные наблюдения (Бронштейн А.А., 1977), позволившие предположить, что характер движения жгутиков изменяется под действием одорантов. Сложные траектории и асинхронность колебаний затрудняют визуальные наблюдения за подвижностью в отсутствие и присутствии пахучих веществ и трактовку этих наблюдений. Усложняет проблему то, что жгутики данной обонятельной клетки под действием большинства одорантов реагируют только на один из них. При известной трудности количественной оценки параметров движения жгутиков посредством прижизненной световой микроскопии построение математической модели может внести существенный вклад в разрешение проблемы двигательной активности обонятельных жгутиков.
Представленные в современной литературе математические модели подвижности других типов жгутиков и ресничек - цилий и флагелл - не могут быть применены для описания двигательной активности
7 обонятельных жгутиков ввиду принципиальных различий в характере их
движений. При построении математической модели обонятельного
жгутика следует учесть молекулярные механизмы его подвижности,
которые обусловливают столь сложную траекторию движения.
Помимо выявления особенностей двигательной активности
обонятельных жгутиков, необходимо также знать источник энергии,
обеспечивающий эту подвижность в отсутствие и присутствии одорантов в
окружающей среде.
Цель настоящего исследования: построить математическую модель движения обонятельных жгутиков и провести экспериментальный анализ их подвижности и ее энергообеспечения.
Задачи исследования
Построить математическую модель движения жгутиков обонятельных клеток.
Исследовать влияние одорантов на характер двигательной активности обонятельных жгутиков.
Изучить механизм энергообеспечения подвижности обонятельных жгутиков в отсутствие и присутствии одорантов.
В ходе анализа экспериментальных данных проверить адекватность построенной математической модели.
Положения, выносимые на защиту
1. Построена динамическая модель двигательной активности обонятельных жгутиков, адекватно отражающая биофизические процессы, лежащие в основе подвижности жгутиков.
Все изученные в работе одоранты, кроме р-меркаптоэтанола, подавляющего двигательную активность жгутиков, инициируют изменение характера их движений от неупорядоченного к упорядоченному.
Изменение характера движений жгутиков под действием одорантов (кроме Р-меркаптоэтанола) сопровождается синтезом дополнительного пулаАТФ. , '
і'
Научная новизна исследования
Предложена математическая модель движения обонятельных жгутиков как деформируемого стрежня с заданными дополнительными несовместными деформациями в качестве воздействия.
Установлено, что при действии камфары, амилового спирта, этилового спирта, кедрового бальзама, ванилина, цинеола, амилацетата изменяется характер двигательной активности отдельных обонятельных жгутиков: неупорядоченные движения сменяются упорядоченными с преимущественной ориентацией навстречу потоку одоранта. Водный раствор аммиака активизирует неспецифическим образом подвижность обонятельных жгутиков, а р-меркаптоэтанол ее подавляет.
Показано, что действие одорантов, стимулирующих движения жгутиков, включает механизм энергообеспечения подвижности обонятельных жгутиков, связанный с синтезом АТФ вне дыхательной цепи митохондрий и гликолиза.
Научная и практическая значимость исследования
1. Построенная математическая модель и разработанный алгоритм ее реализации могут быть использованы для моделирования двигательной
9 активности других жгутиковых структур в биологических системах.
Это дает возможность более глубокого анализа механизмов
биологической под в и жн ости.
Предложенная модель позволяет прогнозировать количественные характеристики реакции обонятельных жгутиков на действие различных одорантов. Это может быть полезным в медицине и парфюмерии при анализе и прогнозировании восприятия тех или иных ароматов.
Выявленные механизмы энергообеспечения двигательной активности жгутиков обонятельных клеток могут быть использованы при разработке методов (в том числе фармацевтических) коррекции нарушений в восприятии запахов.
Апробация работы
Основные материалы диссертационной работы были представлены на VI и VII Всероссийских конференциях «Фундаментальные Исследования в Технических Университетах» (Санкт-Петербург, 2002, 2003), школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), 3-й научно-практической конференции и школе семинаре «Формирование технической политики инновационных наукоемких технологий» (Санкт-Петербург, 2003), IV Международной школе-семинаре «БИКАМП» (Санкт-Петербург, 2003), IV Международной конференции «Компьютерное моделирование 2003» (Санкт-Петербург, 2003), 1-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), межвузовской научной конференции «XXXII Неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2004).
Публикации: по теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста; состоит из введения, пяти глав, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы. Работа содержит 18 таблиц, 29 рисунков. Список литературы включает 80 наименований.
II ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Двигательная активность обонятельных жгутиков
Орган обоняния представляет собой периферический аппарат обонятельного анализатора. Он располагается в слизистой оболочке полости носа, где занимает часть верхнего носового хода, получившую название обонятельной области слизистой оболочки носа (обонятельной выстилки), которая отличается от остальных участков слизистой оболочки носа оранжевым оттенком.
Обонятельная выстилка состоит из многорядного цилиндрического обонятельного эпителия, который по высоте значительно превосходит респираторный и имеет толщину в среднем 50 - 80 мкм (от 30 мкм у крота до 150 - 200 мкм у лягушки и черепахи) (Бронштейн А.А., 1977), и подлежащей соединительной ткани.
Обонятельный эпителий (ОЭ) состоит из обонятельных (рецепторных), опорных и базальных клеток.
Обонятельные клетки (ОК) являются первичночувствующими рецепторами. Особенности их строения у позвоночных позволяют выделить в них четыре основных морфофункциональных отдела: вершину, периферический отросток, тело клетки и центральный отросток (Винников Я.А., 1971; Бронштейн А.А., 1977).
Я.А. Винников и Л.К. Титова (1957) установили, что вершиной ОК является небольшое овальное или сферическое утолщение диаметром 1 - 2 мкм, и назвали его обонятельной булавой. Обонятельная булава (ОБ) несет 10 - 15 жгутиков, обладающих двигательной активностью, которые являются типичными цилиарными структурами с характерной ультраструктурной организацией. Поскольку обонятельные жгутики (ОЖ) выступают над поверхностью ОЭ, то именно они обеспечивают контакт
OK с внешней средой, увеличивая поверхность клеток, доступную
одорантам. Именно в обонятельных жгутиках происходит трансдукция обонятельных стимулов.
Поверхность обонятельного эпителия покрыта слоем слизи, в которую погружены вершины обонятельных клеток со жгутиками. Обонятельная слизь (ОС) многокомпонентна и содержит значительное количество белков (до 6% массы слизи), а также олигонуклеотидов, нуклеопротеидов и кислых мукополисахаридов (гликозаминогликанов). В слизи отмечена высокая активность многих ферментов, а также обнаружена высокая концентрация катионов калия, натрия и кальция. Концентрация ионов натрия составляет 55 - 122 мМ, калия - 60 - 85 мМ, кальция - 0,6 - 2 мМ (Бронштейн А.А., 1977).
В обонятельной слизи обнаружены в высокой концентрации многочисленные одорант-связьгвающие белки (ОСБ), названные так за их способность обратимо связывать пахучие вещества (Vincent F. et al., 2000; Pelosi P., 2001; Horst R. et al., 2001). ОСБ являются неспецифическими переносчиками пахучих молекул, однако присутствие нескольких типов ОСБ у одного и того же животного может свидетельствовать об их роли и в распознавании запахов. ОСБ обнаруживаются не только в обонятельной слизи, но и в мембранах обонятельных жгутиков (Herent M.F., Collin S., Pelosi P., 1995).
Жгутики обладают двигательной активностью. По характеру движения жгутики обонятельных клеток резко отличаются от ресничек мерцательного эпителия. Обонятельные жгутики в отсутствие одорантов колеблются неупорядоченно, асинхронно, сгибаясь и разгибаясь с непостоянной скоростью и без определенного ритма. Траектория их колебаний достаточно сложна и состоит из компонентов изгибательного,
13 волнообразного и иногда воронкообразного движений. В отличие от
ресничек, они не создают ориентированных (однонаправленных или
циркуляторных) потоков жидкости, поэтому мелкие инородные частицы
не передвигаются вдоль поверхности рецепторного слоя, как над
мерцательным эпителием, а остаются длительное время на одном участке,
беспорядочно перемещаясь вследствие отталкивания выпрямляющимися
вершинами обонятельных жгутиков (Бронштейн А.А., 1977).
Колебания коротких обонятельных жгутиков у лягушек асинхронны и сложны по форме. Движения толстых обонятельных жгутиков более просты и состоят из сгибания и разгибания в сочетании с волнообразным компонентом. У травяных лягушек тонкие короткие жгутики сгибаются и разгибаются с частотой от 20 до 40 - 50, а толстые — от 15 до 30 раз в минуту. Движения длинных обонятельных жгутиков более медленны и похожи на маятникообразные колебания. В выпрямленном состоянии дистальная часть этих жгутиков может вытягиваться в прямую нить или, напротив, остается согнутой почти под прямым углом и лежит на поверхности полусогнутых коротких жгутиков. Это происходит, очевидно, вследствие того, что в активном локомоторном акте у них участвует лишь проксимальный отдел, тогда как более тонкий дистальный отдел двигается пассивно вслед за перемещением проксимального.
Частота сгибаний длинных обонятельных жгутиков в осенне-зимний период у травяных лягушек варьирует от 10 до 25 и составляет в среднем около 15 колебаний в минуту. У лягушек, у которых размеры длинных обонятельных жгутиков превышают 90 - 100 мкм, движения последних становятся малозаметными или даже совсем не обнаруживаются (Reese T.S., 1965; Бронштейн А.А., 1977). Утрачивают видимые на глаз движения и длинные обонятельные жгутики травяных лягушек, когда в весенне-
14 летний период размеры их возрастают до 15 - 100 мкм. Эти данные
свидетельствуют о том, что длина и подвижность обонятельных жгутиков
у земноводных могут определяться внешними факторами и подвержены
сезонным колебаниям (Бронштейн А А., 1964).
Способность жгутиков к таким сложным типам движений обусловлена их ультраструктурной организацией.
Жгутик представляет собой тонкий цилиндрический вырост цитоплазмы, который покрыт плазматической мембраной. Внутри него расположена аксонема, которая в своем составе имеет девять дублетов микротрубочек, образующих внешнюю стенку цилиндра аксонемы. Кроме периферических дублетов микротрубочек, в центре аксонемы располагается пара центральных микротрубочек. В целом систему микротрубочек жгутика описывают как (9х2)+2. В дублетах микротрубочек также различают А-микротрубочку, состоящую из 13 субъединиц, и В-микротрубочку, неполную, содержащую 11 субъединиц.
А-микротрубочка несет на себе «ручки», которые направлены к В-микротрубочке соседнего дублета. От А-микротрубочки к центру аксонемы отходит радиальная связка, или спица, оканчивающаяся головкой, присоединяющейся к центральной муфте, имеющей диаметр около 70 нм, окружающей две центральные микротрубочки. Последние лежат отдельно друг от друга на расстоянии около 20 - 25 нм. Таким образом, в аксонеме обонятельного жгутика располагается 20 продольных микротрубочек.
Микротрубочки состоят из белка тубулина. Тубулин - димерный белок, состоящий из двух сходных, но не идентичных глобулярных субъединиц с молекулярной массой около 50 кДа каждая. Эти субъединицы, носящие название альфа- и бета-тубулинов, слегка
15 отличаются по значению изоэл ектрической точки (Гельфанд В. И.,
Розенблат В.А., 1977; Cleveland D.W., Sullivan K.F., 1985). Тубулин - очень
консервативный белок. Высокая степень гомологии и иммунологическая
кросс-реактивность обнаруживается у тубулинов эволюционно далеких
организмов. Тубулин может подвергаться посттрансляционной
модификации - тирозинилированию, ацетил ированию, фосфорилированию
(Cleveland D.W., Sullivan K.F., 1985). Гетеродимер тубулина может
связывать две молекулы ГТФ, одна из которых легко обменивается с
нуклеотидами из окружающего раствора, а другая связана гораздо более
прочно. Тубулин может также связывать ионы кальция и магния (Гельфанд
В.И., Розенблат В.А., 1977).
Микротрубочки полярны: полимеризация из мономеров идет легче на плюс-конце, чем . на минус-конце. Система микротрубочек строго централизована: они имеют лишь 1-2 центра полимеризации на клетку. Практически все микротрубочки растут из этих центров плюс-концами к периферии (Васильев Ю.М, 1996).
Среди белков, прикрепленных к микротрубочкам в разнообразных клетках, очень важны моторные молекулы - динеины и кинезины. Эти молекулы одним концом прикрепляются сбоку к микротрубочке и могут двигаться по ней, если доставлять им энергию в виде АТФ. При этом большинство вариантов кинезина двигается по трубочке к ее плюс-концу, а все динеины - к минус-концу. Другим полюсом молекула динеина или кинезина может прикрепиться другим микротрубочкам (Васильев Ю.М., 1996).
В обонятельных жгутиках «ручки» образованы динеином. Аксонемные динеины осуществляют скольжение соседних наружных дублетов микротрубочек, что приводит к движению жгутиков или
16 ресничек. Лучше всего изучены динеины наружных ручек в ресничках
тетрагимены, жгутиков хламидомонады и сперматозоидов морского ежа.
Эти динеины содержат три типа полипептидных цепей - тяжелые,
промежуточные и легкие. Количество цепей варьирует у разных
животных. Молекулярная масса тяжелых цепей составляет 400 - 500 кДа,
промежуточных - 60 - 120 кДа, легких - 10 - 40 кДа, а общая
молекулярная масса динеина - 1250 - 2000 кДа (Gibbons I.R., 1988). На
каждой головке динеина имеется по одному сайту связывания с
микротрубочками.
Связывание головок с микротрубочками чувствительно к АТФ и разрушается при его добавлении. Динеин обладает АТФазной активностью, которая стимулируется микротрубочками. Участки связывания и гидролиза АТФ также расположены на головках динеиновой молекулы (Johnson К.A. et al., 1984; Gibbons I.R., 1988; Warner F.D. et al., 1989). Движение эукариотических ресничек и жгутиков осуществляется за счет гидролиза АТФ динеином. Выходя из митохондрий, АТФ преобразуется в креатинфосфат, скорость диффузии которого равна примерно 1 мкм/с (Brown А., 2000). Следовательно, за доли секунды (0,1 -0,2 с) креатинфосфат достигает молекулы динеина путем свободной диффузии, вступает в реакцию с АДФ, образуя АТФ, который и гидролизуется АТФазным доменом динеина.
Кроме микротрубочек, в обонятельных жгутиках присутствуют вытянутые вдоль их длинной оси митохондрии, встречаются вакуоли и каналы гладкой эндоплазматической сети, а в проксимальном отделе -свободно лежащие рибосомы и полисомы. У низших позвоночных здесь же располагаются цистерны аппарата Гольджи и лежащие под ними мембраны шероховатой эндоплазматической сети (Бронштейн А.А., 1977).
17 Следует отметить, что внутреннее строение обонятельных жгутиков
не уникально. Аналогичную тонкую организацию имеют жгутики
сперматозоидов, реснички мерцательного эпителия. Толщина этих
образований примерно одинакова и составляет 200 нм.
Подвижность обонятельных жгутиков обеспечивается следующим образом. Изгиб происходит за счет скольжения дублетов микротрубочек друг относительно друга. Это скольжение обеспечивается перемещением молекулы динеина, которое возникает при гидролизе им молекулы АТФ, то есть химическая энергия АТФ превращается в механическую энергию скольжения одних дублетов микротрубочек относительно других в результате взаимодействия временных контактов динеиновых «ручек» с димерами тубулина (Васильев Ю.М., 1996). Если такое локальное смещение будет продвигаться вдоль аксонемы, то может возникнуть волнообразное движение. При движении жгутиков не происходит изменения их длины, поскольку они нерастяжимы. Следует также отметить, что жгутики не способны вращаться вокруг своей продольной оси, в отличие от бактериальных жгутиков, что обусловлено их иной ультраструктурной организацией.
Жгутик бактерий представляет собой жесткий полый цилиндр, образованный молекулами белка флагеллина, уложенными в плотную спираль. Диаметр цилиндра около 120 нм. Молекулярная масса флагеллина колеблется от 40 до 60 кДа в зависимости от вида бактерий. Флагеллины, в отличие от динеина и кинезина, являются структурными, а не моторными белками (Каппуччинелли П., 1982).
Кроме жгутика, компонентами двигательного аппарата бактерий являются крючок и базальное тельце. Именно строение базального тельца позволяет бактериальному жгутику двигаться. Оно состоит из стержня,
18 связанного с крючком, и четырех соосньгх дисков: Р, L, S, М, причем
последний локализован в плазматической мембране бактерии. На
периферии диска М находятся многочисленные копии белка Mot В.
Несколько копий белка Mot А встроены в мембрану и примыкают к краям
дисков S и М. Вращающий момент возникает за счет взаимодействия
субъединиц Mot В с белковыми субъединицами Mot А. Движение
бактериальных жгутиков осуществляется за счет протонного потенциала
на плазматической мембране жгутика (Скулачев В.П., 1989; Тихонов А.Н.,
1999).
Движения обонятельных жгутиков не являются, по-видимому, необходимым условием или компонентом рецепторной реакции обонятельных клеток, поскольку их прекращение не влечет за собой подавления способности этих клеток к генерированию рецепторных потенциалов (Минор А.В., 1971). Однако обнаружилось, что на препаратах с неподвижными жгутиками наблюдается удлинение волны электроольфактограммы и затягивание процесса восстановления чувствительности рецепторов после стимуляции, в связи с чем их ответы на быстро следующие друг за другом повторные стимулы ослабевают.
Возможно, что движения жгутиков, приближающие их дистальные отделы к поверхности слоя слизи, не только повышают вероятность контакта рецепторов с молекулами пахучих веществ, но и облегчают вместе с тем процессы десорбции молекул пахучего вещества с рецепторных участков их мембраны, вследствие чего у препаратов с неподвижными жгутиками этот процесс оказывается замедленным (Бронштейн А.А., Минор А.В., 1973). Известно, что частота и направление движений жгутиков изменяются в связи с различной степенью поляризации мембраны и что характер их движения находится под
19 контролем механизмов, связанных с мембранным потенциалом
(Бронштейн А.А., 1977). Однако возможен противоположный процесс:
трансмембранный потенциал изменяется в результате движения жгутиков
(ThurmU., 1965).
Следует отметить, что, по данным некоторых авторов (Moran D.T. et al., 1982; Lidow M.S., Menco B.P., 1984), жгутики обонятельных клеток некоторых видов млекопитающих, включая человека, вообще не двигаются, что обусловлено отсутствием динеина. Однако в более ранних экспериментах (Burns M.W., 1979) было показано, что динеин все же присутствует в аксонеме обонятельных жгутиков здорового человека.
Согласно гипотезе, выдвинутой Е.В. Бигдай (2004), движения обонятельных жгутиков при действии на них одорантов могут быть связаны с другими компонентами цитоскелета, а именно с актин-миозиновой системой. В своих экспериментах Е.В. Бигдай обнаружила, что в обонятельных жгутиках лягушки в присутствии одорантов происходит полимеризация актина. Е.В. Бигдай (2004) на основании этих результатов предположила, что за счет актин-миозиновой системы могут двигаться жгутики при действии одорантов. Возможно, что в жгутиках млекопитающих работает именно эта система молекулярной подвижности.
А.А. Бронштейн с целью выяснения роли двигательной активности обонятельных жгутиков в рецепторном процессе наблюдал за изменениями их движений под действием пахучих веществ. Для этого к раствору Рингера добавляли амилацетат, гвоздичное масло, сернистый аммоний, этанол, бутанол, глютаральдегид. По наблюдениям А.А. Бронштейна, низкие концентрации этих веществ, сопоставимые с физиологическими, не оказывают заметного эффекта на двигательную
20 активность жгутиков рецепторных клеток: не было отмечено изменения
характера и ритма движений обонятельных жгутиков.
Однако относительно высокие концентрации (порядка 10"2 М) приводили к различным эффектам, в частности к повышению скорости движения жгутиков. Латентный период действия веществ был значительным (5-10 минут). Поэтому был сделан вывод, что действие пахучих веществ в высоких концентрациях является скорее токсическим, чем физиологическим. Тем не менее, следует иметь в виду, что сложная траектория движений обонятельных жгутиков, асинхронность их колебаний и отсутствие постоянного ритма затрудняют визуальные наблюдения за их состоянием в присутствии пахучих веществ.
Такие наблюдения лучше удались почти через два десятилетия В.О. Самойлову и В.Г. Трущенкову (1995). Они установили, что под действием некоторых одорантов в физиологических концентрациях могут наблюдаться локальные регулярности в движении обонятельных жгутиков, то есть неупорядоченное движение приобретает некоторую упорядоченность.
Таким образом, существующие немногочисленные данные свидетельствуют о том, что двигательная активность обонятельных жгутиков может изменяться при действии на них одорантов. Это вызывает ассоциации с хемотаксисом бактерий. Следовательно, можно лредположить, что для определенных обонятельных жгутиков соответствующий им одорант является аналогом аттрактанта или репеллента, вызывая упорядоченное движение определенных жгутиков обонятельной выстилки.
Однако механизмы подвижности бактерий и эукариот существенно различны. Для того чтобы плавать, бактерии с помощью специальных
электромоторов вращают свои жгутики (Скулачев В.П., 1989). Так,
например, с поверхности бактерии Е. coli наружу выступают шесть жгутиков, каждый длиной 10 мкм. Когда жгутики начинают синхронно вращаться против часовой стрелки, они сплетаются в единый пучок, который образует своеобразный пропеллер. Вращение пропеллера создает силу, заставляющую бактерию двигаться почти по прямой линии. После того как направление вращения жгутиков изменяется на противоположное, пучок расплетается, и бактерия останавливается, вместо поступательного движения она начинает хаотически вращаться на одном месте, ее ориентация изменяется. В тот момент, когда все жгутики бактерии снова начнут синхронно вращаться против часовой стрелки, образовав пропеллер, толкающий бактерию, направление ее поступательного движения будет отличаться от первоначального. Таким способом бактерия может изменить направление своего движения (Громов Б.В., 1997).
Частота вращения бактериальных жгутиков при комнатной температуре составляет 100 - 200 Гц, при этом сила тяги, развиваемая пропеллером, достигает 20 пН, а линейная скорость движения бактерии -100 мкм/с (Berg НС, 1995, 2000, 2003). Электромоторы бактерий в качестве источника энергии используют протонный потенциал на цитоплазматической мембране (Скулачев В.П., 1989).
Само по себе плавание в гомогенной среде не дает бактерии никаких преимуществ. Если же среда неоднородна, а именно так обычно и бывает, бактерии в некоторых случаях могут определять эту неоднородность, тогда движение становится целенаправленным - это так называемые таксисы, которые можно рассматривать как элементарные поведенческие реакции.
Приспособительное значение хемотаксиса для бактерий не вызывает сомнений. Подобным образом действует, по-видимому, и орган обоняния у
22 животных, которые по запаху находят пищу или, наоборот, чувствуя
неблагоприятные запахи, стараются их избежать. Поэтому аналогия
обоняния у животных и хемотаксиса у бактерий небеспочвенна. При этом
хемочувствительными структурами являются обонятельные жгутики,
улавливающие различные запахи так же, как у некоторых бактерий в
структурах их жгутиков находятся рецепторы к хемоэффекторам.
Заметим, что при проведении экспериментов по изучению влияния одорантов на характер подвижности обонятельных жгутиков различные исследователи использовали достаточно высокие концентрации запаховых агентов. Поэтому до сих пор остается не ясным, изменяют ли одоранты в физиологических условиях характер движений обонятельных жгутиков и каким образом.
Таким образом, несмотря на то, что данные о строении обонятельных жгутиков являются достаточно полными, их двигательная активность изучена очень мало. Очевидно, поэтому роль подвижности жгутиков в обонятельной рецепции практически неясна. По нашему мнению, для ответа на этот вопрос нужно провести систематические экспериментальные исследования изменений характера движений жгутиков при действии на них одорантов.
1.2. Энергообеспечение подвижности обонятельных
жгутиков
Данные о характере движений обонятельных жгутиков, как следует из вышеизложенного, очень немногочисленны, а сведений об энергообеспечении их двигательной активности практически нет. По-видимому, она обеспечивается АТФ, что следует из ультраструктурной организации и опытов, проведенных А.А. Бронштейном (1964). Однако
23 место синтеза АТФ, гидролизуемого впоследствии диненином, остается
неясным. Логично предполагать, что синтез этого АТФ происходит в
митохондриях, поскольку в клетках подавляющее большинство молекул
АТФ образуется в результате сопряжения окисления и фосфорилирования.
Ключевую роль в синтезе АТФ в митохондриях играет фермент Н*-
АТФсинтаза.
Н^-АТФсинтаза работает как вращающаяся машина, подобно электромотору, крутящемуся при пропускании электрического тока через его обмотку. Однако в отличие от электромоторов, используемых в технике, ротор ЬҐ-АТФсинтазьі приводится во вращение при прохождении через нее электрического тока, создаваемого не движением электронов, а потоком протонов (BoyerP.D., 1997,1998; Noji Н. et al, 1997).
Мембранная часть фермента ТҐ-АТФсинтазьі, называемая фактором сопряжения Fo, представляет собой гидрофобный белковый комплекс. Второй крупный фрагмент этого фермента - фактор сопряжения Fi -заметно выступает из мембраны в виде сферического образования. В митохондриях РҐ-АТФсинтаза встроена во внутреннюю мембрану, а комплекс Fj обращен в сторону матрикса (внутренняя часть митохондрии).
Образование АТФ из АДФ и неорганического фосфата происходит в каталитических центрах ЇҐ-АТФсинтазьі, расположенных в комплексе Fi. Способность синтезировать АТФ - свойство единого комплекса F0Fi, встроенного в энергопреобразующую мембрану. Связано это с тем, что работа ТҐ-АТФазьі в режиме синтеза АТФ сопряжена с переносом через нее протонов, путь которых пролегает через F0h направлен в сторону Fj.
Протон проводящий канал, по которому ионы водорода из области с высоким протонным потенциалом подводятся к определенным
24 функциональным группам Н^-АТФсинтазы, а затем выходят в область с
низким протонным потенциалом, расположен в мембранном фрагменте
tT-АТФсинтазы (комплекс Fo). Направленный перенос протонов возможен
только в том случае, если РҐ-АТФсинтаза встроена в мембрану замкнутых
энергопреобразующих органелл или в плазматическую мембрану клетки
при условии, что эти мембраны не имеют иных путей транспорта ионов,
включая кроме канала в РГ-АТФсинтазе (комплекса Fo).
Движущей силой для работы ЬҐ-АТФсинтазьі является протондвижущая сила, создаваемая на мембране в результате переноса ТҐ-ионов в направлении более высокого электрохимического потенциала за счет энергии, выделяемой возбужденными гс-электронами при их движении по электрон-транспортной цепи.
В митохондриях межмолекулярный транспорт тс-электронов сопровождается переносом ионов водорода поперек внутренней митохондриальной мембраны: они выходят из матрикса в межмебранное пространство и далее в цитозоль. Так образуется протонный потенциал, то есть разность электрических потенциалов между матриксом митохондрии и цитозолем. Она может достигать 200 мВ, что соответствует разности рН около трех. Таким образом создается протондвижущая сила, стремящаяся возвратить ІҐ-ионьї в матрикс. Однако до открытия канала в комплексе F0 Н^-АТФсинтазы она не реализуется.
Канал открывается при снижении содержания АТФ и, следовательно, падении соотношения АТФ/АДФ. Возникновение потока FT -ионов по каналу из цитозоля в матрикс митохондрии представляет собой протонный электрический ток в «статоре» ТҐ-АТФсинтазьі, вследствие чего ее подвижная часть («ротор») совершает работу по синтезу АТФ. Частота вращения «ротора» составляет примерно 17 Гц, а сила, приводящая к его
25 движению, - около 40 пН (Noji Н. et al., 1997; Kinoshita К. Jr. et al., 1997;
Тихонов A.H., 1999).
Для обонятельных жгутиков не было убедительно показано (Бронштейн А.А., 1977), что именно АТФ, синтезируемый в митохондриях, обеспечивает их движение, хотя именно такой вариант представляется наиболее вероятным. Кроме того, непонятно, какова реакция жгутиков на одоранты и как она обеспечивается энергетически. Продолжая аналогию с движением хемотактильных бактерий, рассмотрим, как обеспечивается их движение.
Как и протонные АТФсинтазы, «электромоторы» бактерий являются устройствами, которые в качестве источника энергии используют протонный потенциал на цитоплазматической мембране. Вращающий момент возникает за счет взаимодействия субъединиц Mot В с субъединицами Mot А, являющимися «статором» такого «электромотора». В состав субъединицы Mot А входят два несоосных протонных полуканала. Подобно протонному каналу АТФсинтазы, путь переноса протонов через мембрану проходит через протонные полуканалы субъединиц Mot А и Mot В. В результате переноса протонов через каналы этих белков, направленного внутрь бактериальной клетки, происходит вращение «ротора». Один полный оборот «ротора» обусловлен переносом через мембрану около 1000 протонов (Скулачев В.П., 1989; Тихонов А.Н., 1999).
Таким образом, складывается впечатление, что механизм энергообеспечения движения жгутиков при действии одорантов может быть аналогичен бактериальному, в том смысле, что молекулярный комплекс, продуцирующий энергию, связан с плазматической мембраной жгутика. Но если движение бактериального жгутика происходит
26 непосредственно за счет тока протонов, поскольку «ротор» и «статор»
являются структурными составляющими жгутика, то для движения обонятельных жгутиков, структура которых представляет собой тубулиндии еиновую систему, необходим посредник, переводящий электрическую энергию протонного потенциала в химическую энергию АТФ. За счет протонного потенциала химическую работу совершают ЬҐ-АТФсинтаза, ЬҐ-пирофосфат-синтаза, трансгидрогеназа, обратная НАДН-KoQ-редуктаза, обратная 0<2Н2-цитохром с-редуктаза. Но в энергию АТФ протонный потенциал «переводит» только ЬҐ-АТФсинтаза.
Следовательно, можно предполагать, что Н^-АТФсинтаза, локализованная в плазматической мембране обонятельного жгутика, может обеспечивать синтез АТФ при действии различных одорантов. Это предположение основано еще и на том, что в литературе существуют данные об активности протонной АТФсинтазы, подобной митохондриальной, локализованной в плазматической мембране адипоцитов (Kim B.W. et al., 2004).
Таким образом, механизм энергообеспечения подвижности обонятельных жгутиков является одним из самых малоизученных вопросов в обонятельной рецепции. Если согласиться с существующим мнением, что под действием одорантов происходит изменение характера двигательной активности жгутиков, то необходимо выяснить, за счет какого источника энергии это возможно. Ссылок на экспериментальные данные, посвященные исследованию этой проблемы, в литературе обнаружить не удалось. Однако исследовать этот вопрос необходимо, поскольку анализ двигательной активности не возможен без понимания механизмов ее энергообеспечения.
1.3. Математические модели цилиарных структур
Анализ двигательной активности обонятельных жгутиков экспериментальными методами исследования весьма затруднителен, поскольку не существует адекватных методов регистрации количественных параметров их подвижности, что затрудняет оценку влияния различных воздействий на движения жгутиков. Построение математической модели может дать такую возможность. Кроме того, наличие такой модели именно для обонятельных жгутиков позволило бы адаптировать ее и к другим цилиарным и флагеллярным структурам, поскольку ультраструктурная организация у них одинакова, а характер движения обонятельных жгутиков является одним их самых сложных.
Однако в современной литературе не удалось найти ни одной модели обонятельных жгутиков. Построенные модели движения бактериального жгутика не могут быть применены к цилиарным структурам, поскольку характер его движений является достаточно простым и представляет собой обычное вращение. Описание движений хвостов сперматозоидов проводят чаще визуально, хотя СИ. Пыриковой (2004) предложен аппаратно-программный комплекс для определения параметров их движения. Но данная методика не может быть применена для оценки параметров движения жгутиков, поскольку они являются частью клетки, которая не способна к движению, в отличие от сперматозоида. Существующие модели движения ресничек мерцательного эпителия оказываются неадекватными, когда их применяют к обонятельным жгутикам, поскольку характер их движений при отсутствии одорантов является неупорядоченным, в отличие от строго упорядоченного движения ресничек.
С. Barton и S. Raynor (1967) в своей модели реснички исходили из того, что она представляет собой твердый цилиндрический объект,
28 изменяющий свою длину в процессе ударного движения, и не учитывали
механизмы, генерирующие колебания ресничек. Однако при движении
ресничек и жгутиков не происходит изменения из длины.
N. Liron и F.A. Meyer (1980) при моделировании не учитывали взаимодействие ресничек с жидкостью и инерционные силы, что и привело к заниженному численному значению скорости движения частицы в слизистом слое.
Впоследствии рядом авторов (Bird R.D. et at., 1977; Blake J.R., 1973, 1977, 1972; Keller S., Wu T.Y., Bremen C.A., 1975; Liron N., Shahar R., 1978) был предложен другой подход к моделированию. Они разработали так называемые дискретные модели. В их основе лежит представление о ресничках как о бесконечном множестве изгибающихся тонких тел, прикрепленных к плоской или криволинейной поверхности упорядоченным образом на постоянных расстояниях друг от друга по двум направлениям. Однако эта группа моделей также лишь частично приближается к реальному объекту. Громоздкость математических формулировок с большим числом параметров и отсутствие сравнения полученных результатов с наблюдаемыми данными в эксперименте является недостатком таких моделей.
В.В. Шабалиным (2002) был предложен другой подход к описанию движения ресничек мерцательного эпителия. При построении кинематической модели движения реснички он полагал, что скорость транспорта слизевого секрета равнялась средней скорости кончика реснички за время эффективного удара в тот момент, когда ресничка касается слоя геля. В модели ресничка представлялась тонким гибким «стержнем», осевая линия которого - пространственная кривая. Этот тонкий стержень совершает гребковые колебания, которые можно отнести
29 к комбинации двух типов движения. Одним из них является
маятникообразное движение, при котором ресничка перемещается взад и
вперед, сгибаясь у основания. Второй тип движения - сгибание, вызванное
скольжением фибрилл друг относительно друга. Данная модель может
быть применена для описания движения ресничек мерцательного
эпителия, но не обонятельных жгутиков в силу разного характера
движений.
Резюмируя данные о математических моделях цилиарных структур, можно говорить о том, что модель обонятельных жгутиков должна существенно отличаться от вышеперечисленных, поскольку характер движения жгутиков обонятельных клеток принципиально отличается от двигательной активности бактерий, сперматозоидов и ресничек мерцательного эпителия. Поэтому необходим иной подход к моделированию этой сложной системы. При моделировании двигательной активности обонятельных жгутиков одним из ключевых моментов является отображение перехода от неупорядоченных движений к упорядоченным.
Таким образом, из проведенного анализа литературных данных следует, что двигательная активность обонятельных жгутиков мало изучена. Сведения о параметрах движения и их изменениях могут дать больше информации о роли двигательной активности жгутиков в обонятельной рецепции. Поскольку количественный анализ параметров трехмерного движения жгутиков весьма затруднителен, построение полной математической модели направлено на решение этой задачи.
Однако в современной литературе нет модели, которую можно было бы адаптировать для обонятельных жгутиков в силу сложного характера их движений. При построении такого рода моделей для максимально
«
полного учета различных факторов необходимы системные данные о влиянии различных одорантов на движение жгутиков. В литературе таких данных не представлено, за исключением некоторых опытов А.А. Бронштейна и В.Г. Трущенкова. Но эти эксперименты не могут быть положены в основу построения модели, поскольку данные, полученные в них, не удается систематизировать. Кроме того, анализ энергообеспечения подвижности обонятельных жгутиков в различных условиях позволит предложить модель не только траектории, а всего процесса двигательной активности.
Вышеизложенным определяется цель данной работы - построение математической модели движения обонятельных жгутиков и проведение экспериментального анализа их подвижности и ее энергообеспечения.
Энергообеспечение подвижности обонятельных жгутиков
Данные о характере движений обонятельных жгутиков, как следует из вышеизложенного, очень немногочисленны, а сведений об энергообеспечении их двигательной активности практически нет. По-видимому, она обеспечивается АТФ, что следует из ультраструктурной организации и опытов, проведенных А.А. Бронштейном (1964). Однако место синтеза АТФ, гидролизуемого впоследствии диненином, остается неясным. Логично предполагать, что синтез этого АТФ происходит в митохондриях, поскольку в клетках подавляющее большинство молекул АТФ образуется в результате сопряжения окисления и фосфорилирования. Ключевую роль в синтезе АТФ в митохондриях играет фермент Н - АТФсинтаза. Н -АТФсинтаза работает как вращающаяся машина, подобно электромотору, крутящемуся при пропускании электрического тока через его обмотку. Однако в отличие от электромоторов, используемых в технике, ротор ЬҐ-АТФсинтазьі приводится во вращение при прохождении через нее электрического тока, создаваемого не движением электронов, а потоком протонов (BoyerP.D., 1997,1998; Noji Н. et al, 1997). Мембранная часть фермента ТҐ-АТФсинтазьі, называемая фактором сопряжения Fo, представляет собой гидрофобный белковый комплекс. Второй крупный фрагмент этого фермента - фактор сопряжения Fi -заметно выступает из мембраны в виде сферического образования. В митохондриях РҐ-АТФсинтаза встроена во внутреннюю мембрану, а комплекс Fj обращен в сторону матрикса (внутренняя часть митохондрии). Образование АТФ из АДФ и неорганического фосфата происходит в каталитических центрах ЇҐ-АТФсинтазьі, расположенных в комплексе Fi. Способность синтезировать АТФ - свойство единого комплекса F0Fi, встроенного в энергопреобразующую мембрану. Связано это с тем, что работа ТҐ-АТФазьі в режиме синтеза АТФ сопряжена с переносом через нее протонов, путь которых пролегает через F0H направлен в сторону Fj. Протон проводящий канал, по которому ионы водорода из области с высоким протонным потенциалом подводятся к определенным функциональным группам Н -АТФсинтазы, а затем выходят в область с низким протонным потенциалом, расположен в мембранном фрагменте tT-АТФсинтазы (комплекс Fo). Направленный перенос протонов возможен только в том случае, если РҐ-АТФсинтаза встроена в мембрану замкнутых энергопреобразующих органелл или в плазматическую мембрану клетки при условии, что эти мембраны не имеют иных путей транспорта ионов, включая кроме канала в РГ-АТФсинтазе (комплекса Fo).
Движущей силой для работы ЬҐ-АТФсинтазьі является протондвижущая сила, создаваемая на мембране в результате переноса ТҐ-ионов в направлении более высокого электрохимического потенциала за счет энергии, выделяемой возбужденными гс-электронами при их движении по электрон-транспортной цепи. В митохондриях межмолекулярный транспорт тс-электронов сопровождается переносом ионов водорода поперек внутренней митохондриальной мембраны: они выходят из матрикса в межмебранное пространство и далее в цитозоль. Так образуется протонный потенциал, то есть разность электрических потенциалов между матриксом митохондрии и цитозолем. Она может достигать 200 мВ, что соответствует разности рН около трех. Таким образом создается протондвижущая сила, стремящаяся возвратить ІҐ-ионьї в матрикс. Однако до открытия канала в комплексе F0 Н -АТФсинтазы она не реализуется. Канал открывается при снижении содержания АТФ и, следовательно, падении соотношения АТФ/АДФ. Возникновение потока FT -ионов по каналу из цитозоля в матрикс митохондрии представляет собой протонный электрический ток в «статоре» ТҐ-АТФсинтазьі, вследствие чего ее подвижная часть («ротор») совершает работу по синтезу АТФ. Частота вращения «ротора» составляет примерно 17 Гц, а сила, приводящая к его движению, - около 40 пН (Noji Н. et al., 1997; Kinoshita К. Jr. et al., 1997; Тихонов A.H., 1999). Для обонятельных жгутиков не было убедительно показано (Бронштейн А.А., 1977), что именно АТФ, синтезируемый в митохондриях, обеспечивает их движение, хотя именно такой вариант представляется наиболее вероятным. Кроме того, непонятно, какова реакция жгутиков на одоранты и как она обеспечивается энергетически. Продолжая аналогию с движением хемотактильных бактерий, рассмотрим, как обеспечивается их движение. Как и протонные АТФсинтазы, «электромоторы» бактерий являются устройствами, которые в качестве источника энергии используют протонный потенциал на цитоплазматической мембране. Вращающий момент возникает за счет взаимодействия субъединиц Mot В с субъединицами Mot А, являющимися «статором» такого «электромотора». В состав субъединицы Mot А входят два несоосных протонных полуканала. Подобно протонному каналу АТФсинтазы, путь переноса протонов через мембрану проходит через протонные полуканалы субъединиц Mot А и Mot В. В результате переноса протонов через каналы этих белков, направленного внутрь бактериальной клетки, происходит вращение «ротора». Один полный оборот «ротора» обусловлен переносом через мембрану около 1000 протонов (Скулачев В.П., 1989; Тихонов А.Н., 1999). Таким образом, складывается впечатление, что механизм энергообеспечения движения жгутиков при действии одорантов может быть аналогичен бактериальному, в том смысле, что молекулярный комплекс, продуцирующий энергию, связан с плазматической мембраной жгутика. Но если движение бактериального жгутика происходит непосредственно за счет тока протонов, поскольку «ротор» и «статор» являются структурными составляющими жгутика, то для движения обонятельных жгутиков, структура которых представляет собой тубулиндии еиновую систему, необходим посредник, переводящий электрическую энергию протонного потенциала в химическую энергию АТФ. За счет протонного потенциала химическую работу совершают ЬҐ-АТФсинтаза, ЬҐ-пирофосфат-синтаза, трансгидрогеназа, обратная НАДН-KoQ-редуктаза, обратная 0 2Н2-цитохром с-редуктаза. Но в энергию АТФ протонный потенциал «переводит» только ЬҐ-АТФсинтаза. Следовательно, можно предполагать, что Н -АТФсинтаза, локализованная в плазматической мембране обонятельного жгутика, может обеспечивать синтез АТФ при действии различных одорантов.
Это предположение основано еще и на том, что в литературе существуют данные об активности протонной АТФсинтазы, подобной митохондриальной, локализованной в плазматической мембране адипоцитов (Kim B.W. et al., 2004). Таким образом, механизм энергообеспечения подвижности обонятельных жгутиков является одним из самых малоизученных вопросов в обонятельной рецепции. Если согласиться с существующим мнением, что под действием одорантов происходит изменение характера двигательной активности жгутиков, то необходимо выяснить, за счет какого источника энергии это возможно. Ссылок на экспериментальные данные, посвященные исследованию этой проблемы, в литературе обнаружить не удалось. Однако исследовать этот вопрос необходимо, поскольку анализ двигательной активности не возможен без понимания механизмов ее энергообеспечения. Анализ двигательной активности обонятельных жгутиков экспериментальными методами исследования весьма затруднителен, поскольку не существует адекватных методов регистрации количественных параметров их подвижности, что затрудняет оценку влияния различных воздействий на движения жгутиков. Построение математической модели может дать такую возможность. Кроме того, наличие такой модели именно для обонятельных жгутиков позволило бы адаптировать ее и к другим цилиарным и флагеллярным структурам, поскольку ультраструктурная организация у них одинакова, а характер движения обонятельных жгутиков является одним их самых сложных. Однако в современной литературе не удалось найти ни одной модели обонятельных жгутиков. Построенные модели движения бактериального жгутика не могут быть применены к цилиарным структурам, поскольку характер его движений является достаточно простым и представляет собой обычное вращение. Описание движений хвостов сперматозоидов проводят чаще визуально, хотя СИ. Пыриковой (2004) предложен аппаратно-программный комплекс для определения параметров их движения. Но данная методика не может быть применена для оценки параметров движения жгутиков, поскольку они являются частью клетки, которая не способна к движению, в отличие от сперматозоида.
Методы экспериментального исследования
Эксперименты проводили на жгутиках обонятельной выстилки травяной лягушки Rana temporaria. Животных отлавливали в осенне-зимний период на северо-востоке Ленинградской области. У лягушек препаровальной иглой разрушали головной и спинной мозг. Затем отделяли дорсальную поверхность головы посредством хирургических ножниц и удаляли с нее кожу, промывая поверхность раствором Рингера. На следующем этапе из полученной носовой части вырезали обонятельные бугорки и снимали с них эпителиальные пласты посредством офтальмологического скальпеля. Полученные пласты под бинокулярным микроскопом разрезали с помощью бритвы на тонкие полоски. Их помещали в каплю раствора Рингера для холоднокровных таким образом, чтобы свободная рецепторная поверхность этих кусочков могла просматриваться затем в проходящем свете в световом микроскопе. Подложки из пластилина, расположенные между предметным и покровным стеклами, препятствовали сдавливанию препаратов и обеспечивали возможность быстрой смены омывающих их растворов проточной системой, создаваемой полосками фильтровальной бумаги в соответствии с рекомендациями А.А. Бронштейна (1977). Стекла и среда с препаратом имели комнатную температуру. Перед экспериментом стекла предварительно очищали 70% этиловым спиртом. 2.3. Методы экспериментального исследования Двигательную активность жгутиков обонятельного эпителия изучали сразу после приготовления препаратов в течение 4-5 часов. Для исследования под микроскопом двигательной активности жгутиков обонятельных клеток выбирали участки эпителия, свободные от сгустков слизи. При воздействии одорантом сначала проводили предварительную оценку подвижности жгутиков, а именно, выбирали препараты, жгутики на которых реагируют на данный одорант. Затем эти препараты изучали более детально, анализируя характер подвижности жгутиков под действием одоранта. 2.3.1. Схема установки Для экспериментального анализа двигательной активности жгутиков обонятельных клеток использовали установку для прижизненной телевизионной микроскопии. Данный метод позволяет изучать в реальном времени структуру и подвижность отдельных частей биологического объекта в переживающих тканях, практически не нарушая их морфофункционального состояния. Движения жгутиков изучали в динамике и наблюдали изменения характера их движений под действием одоранта.
Полученные результаты фиксировали на компьютере. Схема установки для прижизненной телевизионной микроскопии представлена на рис. 1. Одним из основных узлов (элементов) установки для телевизионной световой микроскопии являлся микроскоп МИКМЕД-2 ОАО «ЛОМО». Он предназначен для исследований биологических объектов в проходящем свете. Микроскоп имеет осветительную систему, реализующую принцип Кёлера, обладает улучшенным изображением по полю и повышенным контрастом. В качестве источника освещения использовали галогенную лампу (6 В, 25 Вт). В стандартный комплект микроскопа входят различные сменные объективы, что дает возможность изучать объект при различных увеличениях. Для предварительной оценки движения жгутиков использовали объектив 40х/0,65 (воздушная иммерсия), фотонасадку 14х и нейтральный светофильтр. Второй режим, использованный для детального изучения характера движений жгутиков, отличался от предыдущего объективом: 63х/0,8 (воздушная иммерсия), а фотонасадка и светофильтр оставались прежними. Микроскоп соответствует требованиям ГОСТ Р 50267.2-95 (МЭК 601- 1-2-93). Его эксплуатировали в рекомендованных условиях (температура воздуха в помещении составляла 18 - 22 С). Другой важной составляющей используемой установки является цифровая видеокамера КРС-300С фирмы КТ&С (Южная Корея), которая имеет разрешение по горизонтали 380 телевизионных линий. Минимальная освещенность на объекте составляет 0,1 люкс. Кроме того, в данной видеокамере предусмотрены автоматический баланс белого (через объектив), позволяющий получать четкое изображение микроскопируемого объекта в широком диапазоне условий, и функция компенсации засветки, которая повышает верность воспроизведения изображения, особенно в случае, если источник света расположен напротив видеокамеры, что имеет место в установке для телевизионной световой микроскопии. Светочувствительным элементом в данной видеокамере служит ПЗС-матрица (прибор с зарядовой связью), состоящая из большого числа светочувствительных ячеек, в которых под воздействием света накапливается отрицательный заряд определенной величины. Этот заряд преобразуется в напряжение, величина которого, в свою очередь, переводится в цифровую форму в аналого-цифровом преобразователе (АЦП) камеры (Кистенев И., 2001). Разрешающая способность ПЗС-матрицы определяется количеством составляющих матрицу элементов (пикселей) и ее размером. Используемая видеокамера передает данные в телевизионном стандарте PAL. Поэтому число пикселей, необходимых для фиксации изображения, составляет 415 000. Размер ПЗС-матрицы - 20,2 мм . Следовательно, разрешающая способность данной видеокамеры составляет 7 мкм. Поскольку экран монитора увеличивал изображение в 4 раза, то общее увеличение системы для прижизненной телевизионной микроскопии составляло от 2240х (40-14-4) до 3528х (63 14-4). Это позволяло увидеть отдельные жгутики на препаратах обонятельного эпителия и наблюдать их движения. Регистрацию двигательной активности жгутиков обонятельных клеток проводили с помощью описанной цифровой видеокамеры через плату ввода видеоизображения на жесткий диск персонального компьютера с процессором Intel Pentium І. В данной установке использовали плату ввода видеоизображения Studio DClOplus фирмы Pinnacle Systems Inc. Эта плата не зависит от телевизионных стандартов и позволяет оцифровать сигнал в стандарте PAL, а записать в другом стандарте (например, в NTSC). Запись видеосигнала производили в черно-белом изображении в стандарте PAL, который был выбран в ходе методического эксперимента, при разрешении 720x540 пикселей и частоте 25 кадров/с. Записанные на жесткий диск компьютера видеоизображения обрабатывали специальной программой Pinnacle Studio 7.0, поставляемой вместе с платой ввода Studio DClOplus, и программой Virtual Dub 1 .За
Алгоритм реализации математической модели
Для описания движения жгутика необходимо составить расчетный алгоритм, который позволил бы при изменении исходных данных 60 наблюдать за изменением характеристик движения. При составлении алгоритма приходится ограничить число членов в разложении по формам - считать с тремя степенями свободы. Исходные данные: длина жгутика - I; радиус сечения жгутика - а\ масса жгутика на единицу ее длины - р; модуль Юнга жгутика - Е; динамическая вязкость слизи - //; Задаваемые характеристические функции: заданная деформация - "„ {г, (PyZj); Исходя из ультраструктурной организации жгутиков и механизмов, обеспечивающих их подвижность, заданную деформацию можно принять в следующем общем виде: В данной работе алгоритм расчета, приведенный выше, был адаптирован к изучению подвижности обонятельных жгутиков. В отсутствие одорантов обонятельные жгутики двигаются асинхронно, сгибаясь и разгибаясь с непостоянной скоростью и без определенного ритма. Из сказанного становится очевидным то, что функции заданных деформаций, характеризующие причину движения жгутика, являются функциями независимых случайных величин. Динеиновые «ручки» равномерно распределены по плоскости сечения обонятельного жгутика. Следовательно, любая из «ручек» с равной вероятностью может активировать гидролиз молекулы АТФ, благодаря АТФазной активности динеина. Продольный размер «ручки» в плоскости сечения составляет примерно 8 нм, а диаметр соответствует диаметру микротрубочек - около 28 нм. Система микротрубочек с динеиновыми «ручками» находится на расстоянии порядка 6 нм от плазматической мембраны обонятельного жгутика. Следовательно, любая из «ручек» с равной вероятностью может активировать гидролиз молекулы АТФ; благодаря АТФазной активности динеина. Пусть число к отражает номер диненовой «ручки» в плоскости сечения. Предположим, что АТФ, который впоследствии гидролизуется линейном, синтезируется в митохондриях благодаря сопряжению окисления и фосфорилирования. Пул митохондрий расположен в основном под системой микротрубочек жгутика на расстоянии примерно ОД мкм, поэтому с наибольшей вероятностью молекула АТФ будет гидролизована первой (ближайшей от плоскости обонятельного эпителия) молекулой белка динеина, обладающего АТФазной активностью.
При этом не имеет значения вблизи какой именно микротрубочки это произойдет. По мере продвижения к вершине обонятельного жгутика вероятность провести гидролиз стремительно уменьшается. Это связано с тем, что АТФ является продуктом реакции креатинфосфата и АДФ. АДФ присутствует в обонятельном жгутике за счет реакіщи гидролиза АТФ при движении жгутика. Креатинфосфат попадает в жгутик за счет броуновского движения, скорость которого составляет около 1 мкм/с. Именно это отражает вероятностный параметр Х- Молекулы АТФ, которые впоследствии будут гидролизованы, поступают в произвольные моменты времени. Примем, что одновременно не может идти гидролиз более чем одной молекулы АТФ. Промежутки времени между следующими друг за другом событиями гидролиза в общем случае неодинаковы. Следовательно, частота w является случайной величиной. Исходя из этих соображений, допустим, что заданная деформация для обонятельных жгутиков имеет вид: є (г, ф, z, і) = Cs m(wt) e Qfa) з где w - частота гидролиза АТФ, с1; х параметр, характеризующий вероятность гидролиза АТФ по длине жгутика, м 1. В данной математической модели воздействие одоранта на жгутик рассматривали как стимул, переключающий молекулярные механизмы подвижности с обеспечения режима рыскания (неупорядоченных колебаний) на целенаправленные упорядоченные движения в сторону одоранта. Молекулярные процессы, осуществляющие упорядоченные движения жгутика, мы условно назвали «хемотактильнои силой». Для того, чтобы воздействие одоранта реализовалось, он должен напрямую или опосредованно запустить гидролиз АТФ и, как следствие, активизацию его синтеза. Функция q(t) определяется типом одоранта. Пусть ее аргументами являются еще и постоянные параметры: до и to. Условия эксперимента создавались таким образом, что концентрация одоранта менялась по кривой, близкой к параболе. Тогда: М = 1ё?о — Подставив заданные характеристические функции в явном виде в общий алгоритм расчета, получим алгоритм, позволяющий моделировать движение различных по своим размерам обонятельных жгутиков. Для проверки адекватности математической модели экспериментальным данным рассмотрим три предельных случая и качественно сопоставим с результатами эксперимента: 1) в отсутствие внешнего воздействия единственной причиной, вызывающей движения жгутиков, являются активные внутренние деформации, обусловленные тубулин-динеиновой молекулярной системой подвижности - управляющими параметрами в этом случае являются аргументы функции заданных деформаций, которые представляют собой случайные величины: частота w, число к, параметр Х\ 2) при действии одорантов появляется вторая составляющая в механизме генерации движения, а именно - «хемотактильная сила», которая, по-видимому, отображает включение актин-миозиновой молекулярной системы подвижности, в связи с чем, управляющими параметрами, помимо вышеперечисленных случайных величин, становятся детерминированные q$ и to, зависящие от типа одоранта; 3) в случае, когда по каким-либо причинам единственной составляющей механизма генерации движения является «хемотактильная сила», управляющими параметрами остаются только до и to, зависящие от типа одоранта.
Для сопоставления с результатами опытов мы провели численные эксперименты по моделированию движения одного жгутика. Таким образом, построена математическая модель, позволяющая аналитически находить перемещение каждой точки обонятельного жгутика, что дает возможность моделировать траекторию движения обонятельных жгутиков в различных условиях, включая воздействие различных одорантов. Однако при построении модели сделан ряд предположений, который необходимо проверить в эксперименте. Так, из литературных данных не совсем ясно, где происходит синтез АТФ, обеспечивающего подвижность жгутиков. В модели предполагается, что АТФ синтезируется в митохондриях. Непонятно, за счет какого источника энергии может происходить упорядочивание движения жгутиков. Значения введенных в модель коэффициентов q0 и t0, характеризующих одорант, могут быть выяснены только в ходе экспериментального анализа двигательной активности жгутиков обонятельных клеток. Экспериментальный анализ двигательной активности жгутиков обонятельных клеток был проведен с целью проверки предположений, сделанных при построении математической модели. Вместе с тем эксперименты были направлены и на выяснение механизма энергообеспечения подвижности жгутиков в различных условиях. 4.1. Механизм энергообеспечения подвижности обонятельных жгутиков в отсутствие одорантов В ходе методических экспериментов были подобраны рабочие концентрации агентов, а также определены времена их экспозиции. Однако для выявления механизма энергообеспечения подвижности обонятельных жгутиков представляется важным провести несколько серий экспериментов и более точно установить временные параметры воздействия агентов на двигательную активность жгутиков.
Моделирование движения жгутиков в присутствии одорантов
При описании движения жгутиков учитывали, что при воздействии одорантов появляется «хемотактильная сила», поэтому управляющими параметрами являются число к, вероятностный параметр х, частота w, амплитуда С, концентрация д0, средняя продолжительность движения tQ. Рассмотрим различные значения коэффициентов до и tQ в условиях комбинаций 3) и 4), описанных в п. 5.1. Были выбраны значения до и tQ соответствующие этиловому спирту (#о = Ю М, to = 18,7 с), амилацетату (до = 10" М, to = 39,3 с) и ванилину (да =10 М, to = 38,3 с). 3)Jfc = 7; = 0,8;w=l;C = 0,01. Для анализа влияния воздействия одорантов на движение жгутиков были выбраны фиксированное время 10 с и одна точка жгутика - его вершина. Представленные на рис. 20 и 21 кривые практически полностью совпадают, то есть для трех различных одорантов различной концентрации не наблюдается какого-либо заметного влияния на траекторию движения жгутика. Кроме того, путь, пройденный вершиной жгутика в условиях 3), был одинаков при действии этих одорантов. Однако в случае 4) пути, пройденные вершиной жгутика при действии различных одорантов, незначительно отличаются. Следует отметить, что данная комбинация параметров является предельной, поскольку значение вероятностного параметра в этом случае максимально. Таким образом, под действием «хемотактильной силы» наблюдается переход от неупорядоченного движения жгутиков к упорядоченному. Кроме того, при введении в модель «хемотактильной силы» мы предполагали наличие дополнительного механизма синтеза АТФ, что и было отчасти подтверждено в экспериментальном исследовании. 5.3. Моделирование движения жгутиков обонятельной клетки в ответ на действие различных одорантов в отсутствие заданной деформации Данный случай принципиально отличается от описанного в п. 5.2. тем, что единственной причиной, вызывающей движение жгутиков, является «хемотактильная сила», обусловленная присутствием одоранта. Управляющими параметрами в этом случае являются только концентрация одоранта qo и средняя продолжительность инициированного движения жгутика t0. Рассмотрим их различные комбинации, характерные для этилового спирта, амилацетата и ванилина. На рис. 24 представлено отклонение жгутика от вертикальной оси. При увеличении временного интервала с 5 с до 10 с оно возрастает. Однако, и в том, и в другом случае отклонение является очень незначительным. Путь, пройденный вершиной жгутика, больше, чем центральной частью (рис. 25).
Поскольку продолжительность подвижности жгутика под действием этилового спирта максимальной из исследованных концентраций составляет 18,7 с, то соответственно перемещение его вершины будет очень незначительным за все время движения. Движение жгутиков под действием амилацетата происходит интенсивнее, чем при воздействии амиловым спиртом. Отклонение жгутика от вертикальной оси (рис. 26), а также пути, пройденные вершиной и центральной частью (рис. 27), больше чем при действии этилового спирта. Действие ванилина в концентрации 10" М на подвижность жгутиков сходно с результатом воздействия амилацетата в концентрации 1СГ М. Отклонения жгутиков в этих двух случаях сравнимы между собой, равно как и пути, пройденные вершиной и центральной частью. Поскольку в случае движения жгутиков при действии одорантов при блокировании синтеза АТФ в митохондриях «хемотактильная сила» является единственной причиной движения, то характер подвижности жгутиков является упорядоченным, ввиду отсутствия влияния вероятностного параметра % и числа , которые вносят элемент случайности. Аналогичным образом жгутики двигались и при наблюдении за ними в ходе экспериментов, когда одоранты инициировали подвижность на фоне азида натрия и ротенона. Таким образом, проведенные модельные эксперименты показывают, что в отсутствие одорантов движение жгутиков является неупорядоченным. При внесении одорантов (амилового спирта, камфары, цинеола, кедрового бальзама, амилацетата, ванилина и этилового спирта) в среду характер движений изменяется от неупорядоченного к упорядоченному. Движение жгутиков под действием одорантов имеет строго упорядоченный характер при блокировании синтеза АТФ в митохондриях. Описанная картина совпадает с качественной оценкой экспериментальных данных, что свидетельствует о работоспособности и адекватности модели. На основании уравнений динамики деформируемой среды и решения соответствующей системы уравнений в частных производных построена математическая модель движения жгутика, которая учитывает внешние воздействия и свойства среды. Такая универсальность модели обеспечена тем, что при ее построении учитывали ультраструктурную организацию и механизм генерации движения, которые, согласно литературным данным (Гельфанд В.И., Розенблат В.А., 1977; Cleveland D.W., Sullivan K.F., 1985; Gibbons I.R., 1988; Васильев Ю.М., 1996), одинаковы для всех цилиарных структур. В данном исследовании предложенная модель была адаптирована к изучению подвижности обонятельных жгутиков. Поскольку существуют данные, свидетельствующие о том, что двигательная активность обонятельных жгутиков может изменяться при действии на них одорантов (Бронштейн А.А., 1977; Трущенков В.Г., 1995) (см. главу 1), то возникло предположение, что движения жгутиков обонятельных клеток в присутствии одоранта могут быть подобны движению жгутиков бактериальных клеток при хемотаксисе. При построении модели предполагалось, что для определенных обонятельных жгутиков соответствующий им одорант является аналогом хемоэффектора, что приводит к изменению характера их движений, которые из неупорядоченных становятся упорядоченными. В данной математической модели воздействие одоранта на жгутик рассматривали как стимул, переключающий молекулярные механизмы подвижности с обеспечения режима рыскания (неупорядоченных колебаний) на целенаправленные упорядоченные движения в сторону одоранта.
Молекулярные процессы, осуществляющие упорядоченные движения жгутика, мы условно назвали «хемотактильной силой». Для того, чтобы воздействие одоранта реализовалось, он должен напрямую или опосредованно запустить гидролиз АТФ и, как следствие, активизацию его синтеза. Поскольку системные эксперименты по изучению движения обонятельных жгутиков в литературе описаны не были, то оставался ряд неясностей, без выяснения которых модель не может быть признана адекватной. Так, остается непонятным место синтеза АТФ, за счет которого обеспечивается подвижность жгутиков. Кроме того, для изменения характера движений жгутиков необходим дополнительный источник энергии. Однако не ясно, существует ли этот дополнительный механизм синтеза АТФ, и если существует, то какой именно. При построении математической модели были введены коэффициенты qo и t0, характеризующие одорант, хотя их биофизический смысл на этапе построения модели можно было только предполагать. Выяснить вышеизложенные неочевидные моменты помог экспериментальный анализ двигательной активности жгутиков обонятельных клеток. В отсутствие одорантов обонятельные жгутики двигаются неупорядоченно, сгибаясь в разные стороны. Эти данные представлены в литературе, подтверждены нашими наблюдениями и соответствуют первому предельному варианту. Предполагают, что неупорядоченные движения жгутика обусловлены взаимодействием микротрубочек, образованных тубулином, с динеином. Тубулин-динеиновая молекулярная система сосредоточена, очевидно, в основании обонятельного жгутика. Его дистальная часть движется пассивно, наподобие хлыста в руке человека. Такой «рукой», приводящей в движение обонятельный жгутик, может служить та его часть, которая непосредственно прилежит к апикальному полюсу обонятельной клетки. Результаты исследования изменений двигательной активности обонятельных жгутиков под действием одорантов привели к выводу о принципиальных различиях в действии на них двух групп пахучих стимулов. Первую из них составляют вещества, вызывающие ощущения цветочного, фруктового, пригорелого (прогорклого), пряного (камфорного) и смолистого запахов. Под их действием изменяется характер двигательной активности жгутиков: от неупорядоченного к упорядоченному, причем упорядоченные движения приобретают только отдельные жгутики.
