Содержание к диссертации
Введение
II. Литературный обзор 5
1.1.. Организация вкусового анализатора 5
П.1.1. Устройство периферического вкусового рецепторного органа 5
II. 1.2. Морфологический анализ клеток вкусовой почки. б
П. 1.3. Электрофизиологические анализ клеток вкусовой почки. 9
П.2. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке 11
11.2.1. Первичные мессенджеры во вкусовой почке 11
11.2.2. АТФ как афферентный вкусовой нейротрансмиттер . 13
П.2.3. Выброс АТФ. 14
113. Ионные каналы вкусовых клеток 15
П.3.1. Ионные каналы как детекторы вкусовых стимулов 16
11.3.2. Потенциал-зависимые ионные каналы вкусовых клеток. 23
И.4. Трансдукция вкусовых стимулов, опосредованная системой вторичных мессенджеров 26
II.4.1. Трансдукция горьких и сладких стимулов 27
11.4.3. Роль гастдуцинаво вкусовой трансдукции 29
III. Материалы и методы 32
Ш.1. Выделение вкусовых клеток 32
Ш.2. Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) 33
Ш.з. Мониторинг внутриклеточного кальция (ca-imaging) 33
Ш.4. Атф-биосенсор 34
Iv. Результаты и их обсуждение 41
Ivл. Электрофизиологическая идентификация вкусовых клеток. Три типа вкусовых клеток на основе их электрофизиологических характеристик 41
Fv.2. Идентификация вкусовых рецепторных клеток, специализирующихся в распознавании веществ категорий горького, сладкого и умами 51
IV.2.1. Вкусовые клетки, экспрессирующие гастдуцин, относятся к электрофизиологическому типу А 51
IV.2.2. TRPM5 функционирует во вкусовых клетках типа А 53
IV.2.3. Вкусовые клетки типа А рецептируют горькие вещества 56
IV.2.4. Клетки типа А в ответ на деполяризацию высвобождают АТФ 57
IV.3. Ответы вкусовых клеток на атф 61
V. Заключение 68
Vi. Выводы 73
Vii. Список литературы
- Устройство периферического вкусового рецепторного органа
- АТФ как афферентный вкусовой нейротрансмиттер
- Трансдукция вкусовых стимулов, опосредованная системой вторичных мессенджеров
- Электрофизиологическая идентификация вкусовых клеток. Три типа вкусовых клеток на основе их электрофизиологических характеристик
Введение к работе
Вкусовое ощущение зарождается при возбуждении
специализированных сенсорных клеток - вкусовых рецепторных клеток - в составе плотных клеточных образований - вкусовых почек. Вкусовые почки формируют периферичекский вкусовой орган - вкусовые сосочки 5 типов, 3 из которых локализованы на языке - желобоватые, листовидные и грибовидные. Основополагающей функцией хеморецепторных клеток в составе вкусовых почек является распознавание вкусовых веществ, трансдукция и кодирование информации о их концентрации и вкусовой модальности для дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга. На основе ультраструктурных критериев идентифицировано несколько типов клеток, включая округлые базальные и три типа веретеновидных клеток (типы I, II, III), которые функционируют во вкусовых почках. Фактически, популяция веретенообразных клеток во вкусовой почке еще более гетерогенна, поскольку клетки подвергаются постоянному обмену и образуются из пролиферирующих и дифференцирующихся базальных клеток. Поэтому даже во взрослом организме среди веретенообразных вкусовых клеток есть клетки, находящиеся на разных стадиях развития, т.е. взрослеющие, взрослые и апоптотические.
Современные представления о вкусовой трансдукции базируются в основном на данных молекулярной биологии, поведенческих экспериментах и регистрациях электрической активности вкусового нерва. К настоящему времени идентифицирован ряд сигнальных белков, которые, как считается, играют ключевую роль в трансдукции вкусовых стимулов. Среди них следует упомянуть: 1) гептаспиральные трансмембранные рецепторы вкусовых веществ, вызывающих ощущения горького, сладкого и умами; 2) G-белок гастдуцин, эффекторный фермент фосфолипазу С(32, ионный канал TRPM5, удаление (knock-out) каждого из которых приводит к снижению или даже подавлению чувствительности генетически модифицированных животных к вкусовым веществам, упомянутых выше категорий; 3) ионный
канал PKD2L1 (относится к семейству TRP), участвующий в распознавании кислого. Тем не менее, при всей значимости данных последних лет, полученных преимущественно методами молекулярной биологии и генной инженерии, существующие представления о процессах возбуждения вкусовых клеток носят в значительной степени гипотетический характер. В частности, последовательность внутриклеточных событий от связывания вкусового вещества с молекулярным рецептором до выброса нейромедиатора фактически не прослежена ни для одного из стимулов. В силу этого, обсуждаемые в литературе механизмы вкусовой трансдукции еще предстоит проверить на уровне одиночных вкусовых клеток.
Прогресс в области исследования сенсорных клеток других типов -фоторецепторов, обонятельных и механочувствительных клеток - в значительной степени базировался на результатах электрофизиологических или фотометрических экспериментов, в которых исследовались электрические ответы изолированных клеток или Са2+ сигналы в их цитоплазме, индуцированные адекватными сенсорными стимулами - светом, запахами, половыми феромонами или механическими возмущениями. Обсуждаемые в литературе механизмы вкусовой трансдукции могли бы быть проверены в аналогичных физиологических опытах. Однако, процент вкусовых клеток, отвечающих на вкусовые стимулы чрезвычайно мал. Отчасти это могло быть связано с десенситизацией клеток при их выделении. Другой вероятной причиной могло быть то, что во вкусовой почке многие клетки вовлечены в выполнение нерецепторной функции. Иными словами, фракция истинно рецепторных клеток невелика, а фракция клеток, отвечающая за распознавание вкусового стимула данного типа, весьма немногочисленна. Поскольку в физиологических экспериментах с одиночными вкусовыми клетками их идентификация на основе морфологических и цитологических критериев невозможна, нам представлялось весьма актуальным попытаться идентифицировать вкусовые клетки, в том числе истинно рецепторные, на основе их электрических
характеристик. Многочисленные корреляции между морфологией клеток и их биофизическими параметрами, установленные с использованием самых разнообразных клеточных систем, давали надежду, что данный подход окажется эффективным.
В свете изложенного, основной целью настоящей работы было провести электрофизиологический анализ гетерогенной популяции изолированных вкусовых клеток, который мог бы послужить основой для их идентификации. В результате проведенных экспериментов нам удалось установить, что вкусовые клетки, выделенные из языковых сосочков всех типов - желобоватого, листовидного и грибовидного - действительно могут быть однозначно разделены (на основе их электрофизиологических свойств) на три группы (А, В, С), которые могут соответствовать трем морфотипам -типу I, типу II и типу III. Используя в дальнейшем функциональные тесты и трансгенных животных, нам удалось показать, что подтип А, определенный электрофизиологически, соответствует морфотипу И, к которому принадлежат истинно рецепторные клетки, ответственные за распознавание горьких и сладких веществ и аминокислот. Таким образом, наша работа позволила сформулировать электрофизиологические критерии для идентификации клеток вкусовой почки, выполняющих хеморецепторную функцию, что существенно повысит, как мы надеемся, эффективность будущих исследований вкусовой трансдукции на уровне одиночных вкусовых клеток.
Устройство периферического вкусового рецепторного органа
Было показано, что клетки вкусовых почек имеют как минимум несколько клеток-предшественниц (около восьми на вкусовую почку) с разными биохимическими свойствами (Stone et al., 2002), что свидетельствует о том, что в почке имеется несколько специализированных и не связанных друг с другом линий клеток.
На основе ультраструктурной гетерогенности клеток вкусовых почек выделяют 4 типа клеток: базальные, тип I (темные), тип II (светлые), тип III (промежуточные) (Murray & Murray, 1970; Kinnamon et al., 1985; Delay et al., 1986).
Клетки I типа в апикальной части имеют до 30-40 микроворсинок, выступающих в полость вкусового канала в виде кисточковидного образования. Апикальная часть клеток содержит большое количество электроноплотных гранул с секретом, который экскретируется во вкусовую пору. Комплекс Гольджи, имеющий отношение к образованию электроноплотных гранул, расположен над ядром. В базальной части клетки присутствуют небольшие плотные митохондрии и хорошо развитый гранулярный эндоплазматический ретикулум. Форма ядра клеток этого типа имеет, несферическую форму (чаще треугольную). Клетки этого типа проецируют пластинчатые, крылоподобные отростки, которые как покров окутывают вкусовые клетки II типа.
Клетки II типа имеют более светлую цитоплазму. Апикальный кончик этих клеток заполнен электроноплотным материалом и продуцирует множество тупоконечных микроворсинок, выступающих во вкусовую пору. В теле клетки наряду с варьирующими по размерам вакуолями содержатся расширенные цистерны гладкой эндоплазматической сети. Встречаются мультивезикулярные тельца, лизосомы и электроноплотный материал.
Клетки III типа отличаются тем, что они имеют одну крупную микроворсинку, которая выступает во вкусовую пору. Клетки имеют хорошо развитый гладкий эндоплазматический ретикулум и довольно слабо развитую гранулярную эндоплазматическую сеть. Характерная особенность клеток - наличие в цитоплазме гранулярных пузырьков диаметром 80-150 нм, а также светлых пузырьков диаметром 30-60 нм. Как считается, эти пузырьки, в первую очередь светлые имеют отношение к афферентным синапсам. Гранулярные пузырьки располагаются и в других частях клетки, но всегда присутствуют в области синапсов.
Наличие/отсутствие экспрессии специфических белков также может использоваться в качестве критерия классификации вкусовых клеток. Так, для определенных типов вкусовых клеток в качестве маркеров были идентифицированы гастдуцин (McLaughlin et al., 1992; Boughter et al., 1997; Yang et al., 2000b), PGP 9.5 (protein gene product 9.5) (Huang & Lu, 1996; Kanazawa & Yoshie, 1996; Wakisaka et al., 1996), серотонин (Delay et al., 1993), NCAM (neuronal cell adhesion molecule) (Nolte & Martini, 1992; Nelson & Finger, 1993). С помощью маркеров было показано, что именно клетки II типа экспрессируют белки, участвующие в рецепции вкусовых категорий сладкого, горького и умами: а) рецепторы T1R (T1R1, T1R2, T1R3), отвечающие за распознавание сладкого и умами; б) рецепторы семейства T2R, распознающие горькие вещества (Adler et al., 2000); в) G-белок гастдуцин, фосфолипаза С р2, ионный канал TRPM5 (Yang et al., 2000b; Clapp et al., 2001), удаление (knock-out) которых приводит к снижению или потере чувствительности к горькому, сладкому и умами вкусам (Wong et al., 1996; Zhang et al., 2003).
Несмотря на то, что существуют немногочисленные данные о наличии афферентных синапсов с клетками I и II типов у мыши (Mus musculus) (Kinnamon et al., 1985; Kinnamon et al., 1988) и американского протея (Necturus maculosus) (Delay & Roper, 1988), афферентные синапсы у клеток I и II типов являются предметом спора (Yang et al., 2000а; DeFazio et al., 2006).
В то же время, клетки, которые всегда образуют синапсы с афферентным нейроном, а также экспрессируют пресинаптический белок SNAP-25, участвующий в синаптическом экзоцитозе, относятся к III типу клеток (Yang et al., 2000а; Medler et al., 2003; Clapp et al., 2006). Ранее тот факт, что клетки данного типа образуют синапсы с афферентным волокном, позволял рассматривать эти клетки как истинно рецепторные (Гистология, 1997; Smith, 2000).
АТФ как афферентный вкусовой нейротрансмиттер
ВРК позвоночных экспрессируют несколько типов калиевых каналов, включая TASK-подобные каналы, каналы задержанного выпрямления, входящего выпрямления, кальций-активируемые каналы, основная роль которых - участие в формировании мембранного потенциала и потенциалов действия (Chen et al., 1996; Sun & Herness, 1996; Lin et al., 2002). To, что калиевые каналы имеются и на апикальной мембране, ответственной за распознавание вкусовых стимулов, было обнаружено у амфибий (Kinnamon et al., 1988; Roper & McBride, 1989; Fujiyama et al., 1994; Miyamoto et al., 1996b). Прямое участие в детекции вкусовых стимулов этих апикальных каналов было продемонстрировано на Necturus maculosus.
Потенциал-зависимые калиевые каналы Necturus. По чувствительности к блокаторам апикальные калиевые каналы Necturus maculosus отнесены к каналам задержанного выпрямления. Апикальные калиевые каналы играют ключевую роль в превращении вкусовых стимулов -К+, Н+, Са2+, хинина - в рецепторный потенциал у Necturus.
Считается, что увеличение концентрации ионов калия в ротовой полости может напрямую детектироваться посредством калиевого тока через открытые каналы апикальной мембраны ВРК у Necturus. Это становится причиной деполяризации, что в свою очередь вызывает активацию каналов, находящихся в закрытом состоянии согласно их чувствительности к потенциалу (Kinnamon & Roper, 1988; Bigiani & Roper, 1991).
Протон, вызывающий кислые ощущения, быстро и напрямую блокирует потенциал-зависимые калиевые каналы ВРК (Kinnamon & Roper, 1988; Cummings & Kinnamon, 1992). Интересно отметить, что протон-индуцированная деполяризация более пролонгированная, чем калиевые ответы. Это четко соотносится с типом взаимодействия стимула с канальным белком: транслокация для калия, и модуляция канала-детектора для протона.
Ионы кальция также вызывают блокаду апикальных калиевых каналов у Necturus. Как и для протона, индуцированная дивалентными катионами деполяризация носит более пролонгированный характер, нежели для калия. Предположительно, экстраклеточные ионы кальция напрямую блокируют эти каналы, хотя остается возможным, что эффекты увеличения концентрации кальция связаны с экранированием поверхностного заряда липидного бислоя и тем самым изменения активности канала (смещение вольт-амперной характеристики вправо) (Bigiani & Roper, 1991; Cummings & Kinnamon, 1992).
У Necturus детекция хинина, вызывающего горькие ощущения, также связана с блокадой калиевых каналов (самый пролонгированный эффект в сравнении с перечисленными выше) (Cummings & Kinnamon, 1992).
Потенциал-зависимые калиевые каналы лягушки и млекопитающих. На апикальной мембране ВРК лягушки было идентифицировано несколько типов калиевых каналов, включая потенциал-зависимые, кальций-зависимые, натрий-зависимые (активируются внутриклеточным натрием) каналы, но, как таковых, подтверждений их прямого участия в детекции вкусовых стимулов нет (Fujiyama et al., 1994; Miyamoto et al., 1996b).
Несмотря на то, что млекопитающие экспрессируют несколько типов калиевых каналов, экспериментальные данные указывают на то, что апикальные мембраны млекопитающих не имеют калиевых каналов (Kim & Mistretta, 1993; Ye et al., 1994). Тем не менее, детекция калия может быть связана с другими апикальными каналами или же калиевыми каналами базолатеральной мембраны. Вероятно, ионы калия могут проникать через амилорид-чувствительные натриевые каналы - у крыс бензамил и амилорид блокировали ответы вкусового нерва на KG. Неселективная ионная проводимость также может быть вовлечена в восприятие повышенной концентрации калия (см. Bigiani et al., 2003). В качестве альтернативы, калий мог бы диффундировать через клеточные контакты внутрь вкусовой почки. В этом случае повышенная концентрация калия могла бы вызывать деполяризацию и быть причиной активации ВРК (Kolesnikov & Margolskee, 1998). Недавно, группа Миамото привела подтверждения возможного участия калиевых каналов входящего выпрямления и хлорных каналов в трансдукцию КС1 в ВРК мыши. Эти каналы скорее всего локализованы на базолатеральной мембране (Miyamoto et al., 2001).
Специфические натриевые каналы DEG/ENaC-суперсемейства являются ключевыми молекулами в детекции ионов Na2+ и Н+ ВРК позвоночных. Члены DEG/ENaC-суперсемейства вовлечены в различные физиологические функции организма, такие как натриевый транспорт в адсорбирующем эпителии (ENaC: эпителиалные натриевые каналы), механотрансдукция (DEG Caenorhabditis elegans, эти белки требуются для осязательной трансдукции, а при мутациях могут являться причиной нейродегенерации), нейротрансмиссия (FaNaC улиток Helix aspersa, которые напрямую управляются нейропептидом FMRF-амидом) (см. обзоры Waldmann & Lazdunski, 1998; Benos & Stanton, 1999; Bianchi & Driscoll, 2002; Kellenberger & Schild, 2002; Welsh et al., 2002). Эпителиальные натриевые каналы.
Открытие в начале восьмидесятых Ыа2+-транспортных путей языкового эпителия привело в последствии к существенному прогрессу в понимании молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе №2+-детекции у позвоночных. Применение методов пэтч-клямп и молекулярно-биологического анализа позволило детально изучить класс натриевых каналов, экспрессирующихся в ВРК лягушки, крысы и хомяка (Avenet & Lindemann, 1988, 1991; Gilbertson et al., 1992, 1993; Simon et al., 1993; Li et al., 1994, 1995; Doolin & Gilbertson, 1996; Miyamoto et al., 1996a; Kossel et al., 1997; Gilbertson & Zhang, 1998b; Lindemann et al., 1998; Kretz et al., 1999; Lin et al., 1999; Bigiani, 2001b). Эти каналы формально были названы амилорид-чувствительные натриевые каналы (ASSC) за их чувствительность к амилориду. В настоящий момент, после успешного клонирования данных каналов, их принято называть эпителиальными натриевыми каналами (ENaC).
Трансдукция вкусовых стимулов, опосредованная системой вторичных мессенджеров
За последние пятнадцать лет силами многочисленных молекулярных, биохимических и электрофизиологических исследований горькой и сладкой вкусовой трансдукции были идентифицированы многие компоненты сигнальных каскадов, такие как: 1) G-белки: а-гастдуцин, (McLaughlin et al, 1992; Wong et al., 1996), а-трансдуцин палочек сетчатки (Mclaughlin et al, 1994; Ruiz-Avila et al, 1995), Gcri-2, Gori-2, Gal4, Gal5, Gaq, Gas, а-трансдуцин колбочек сетчатки (Mclaughlin et al, 1994; Ruiz-Avila et al, 1995; Kusakabe et al, 1998), Gy 13 (Huang et al, 1999), GP3 (Rossler et al, 2000); 2) эффекторные молекулы: PLC 02, IP3R3 (Clapp et al, 2001), фосфодиэстеразы dnc-1, PDE-3 (Mclaughlin et al, 1994) PDE1A (Margolskee, 2002), аденилат циклазы 4-го, 6-го и 8-го типов (Abaffy et al, 2003); 3) ионные каналы: TRPM5, относящийся к семейству TRP-каналов (Perez et al, 2002; Zhang et al, 2003) и циклонуклеотид-регулируемые каналы (Kolesnikov & Margolskee, 1995; Misaka et al, 1997).
На настоящий момент идентифицировано около 25 членов мультигенного семейства ВРК-экспрессируемых GPCR, получивших название T2R/TRB (Adler et al, 2000). На основании данных генетического картирования локуса, определяющего чувствительность к горькому (Adler et al, 2000), экспрессии рецепторов mT2R5, отвечающего на горький компонент - циклогексимид, hT2R4 и mT2R8, отвечающих на денатониум и 6-М-пропил-тиоурацил в экспрессионных системах (НЕК-293) (Chandrashekar et al, 2000), полагают, что члены этого семейства чувствительны к горьким стимулам. Эти рецепторы имеют высоко консервативные области в цитоплазматических петлях и прилежащих к этим областям трансмембранных сегментах (предположительно выполняющих функцию взаимодействия с G-белками) и сильно дивергирующие экстраклеточные области (потенциальные сайты связывания с лигандами). У крыс и мышей T2R/TRB рецепторы экспрессируются в 15-20% ВРК желобоватых и листовидных сосочках и в очень малом количестве ВРК грибовидных сосочков. Основываясь на данных in situ гибридизации, показано, что T2R/TRB рецепторы экспрессируются в определенных типах ВРК (Adler et al., 2000). Так, была показана совместная экспрессия T2R/TRB рецепторов и гастдуцина; mT2R5 - рецептор, отвечающий на циклогексимид, (Chandrachekar et al., 2000) селективно связывался с а-гастдуцином, а не с другими а-субъединицами G-белков.
Недавно был выделен новый рецептор, T1R3, который был идентифицирован как генный продукт sac (мышиный локус сладкой чувствительности) (Max et al., 2001). Он рассматривается как рецептор, реагирующий на сладкие стимулы и имеет гомологию около 30% с T1R1 и T1R2, G-белок связывающими рецепторами, избирательно экспрессируемыми в ВРК грибовидных, листовидных и желобоватых сосочков (Нооп et al., 1999). Двойная in situ гибридизация показала совместную экспрессию T1R3 с T1R1 в антериальных ВРК и T1R3 с T1R2 в постериальных ВРК. Показано, что T1R3 может представлять из себя гомодимер, а также гетеродимеризоваться с T1R1 и T1R2, притом гетеродимер T1R1/T1R3 является рецептором аминокислот (Nelson et al., 2002), а гетеродимер T1R2/ T1R3 - единственный рецептор всего спектра сладких веществ. (Nelson et al., 2001).
Современные данные (Zhang et al., 2003) склоняют к тому, что как сладкие, так и горькие вкусовые стимулы, скорее всего, активируют фосфоинозитидный каскад. Zhang и коллеги показали, что нокауты фосфолипазы С р2 и катионного канала TRPM5 почти полностью подавляли чувствительность к вкусовым ощущениям категорий горького, сладкого и умами, но не к кислому и соленому вкусу. Поэтому на настоящий момент принимается следующая точка зрения: гетеротример G-белка, активируемый
T2R/TRB рецепторами в случае горького стимула и T1R рецепторами в ответ на сладкие и умами стимулы вызывает образование IP3/DAG. Последующие этапы в этом процессе не ясны: PLC-IP3/DAG путь по-видимому приводит к активации 1РЗ-рецепторов (IP3R3) и выходу кальция из внутриклеточных депо, приводящему к активации кальций активируемого канала TRPM5 (Bernhardt et al., 1996; Clapp et al., 2001; Zhang et al., 2003; Liu & Liman, 2003; Prawitt et al., 2003) и реализации нейротрансмиттера.
BPK способны воспринимать одну вкусовую модальность - либо горькую, либо сладкую, так как T1R рецепторы и T2R рецепторы не со-экспрессируются, а во вторых восстановление активности выключенной нокаутом фосфолипазы под промоутером горьких рецепторов (методика rescue) приводило к восстановлению чувствительности к горькому, но не сладкому и умами (Zhang et al., 2003).
Было показано, что а-гастдуцин, относящийся к классу Gi/Go белков избирательно экспрессируется в 25-30% BPK (McLaughlin et al., 1992; Boughter et al., 1997). Биохимические исследования in vitro и анализ in vivo мышей с инактивированным геном а-гастдуцина идентифицировали его участие в трансдукции горьких стимулов. У мышей проявлялись редуцированные поведенческие и/или нервные ответы на такие горькие компоненты, как бензоат денатониума, сульфат хинина, циклогексимид, тетраэтиламмоний (Wong et al., 1996). Взаимодействующие с эффектором пептиды, полученные из сс-трансдуцина и имитирующие действие возбужденных трансдуцина/гастдуцина, активировали вкусовую фосфодиэстеразу, позже идентифицированную как PDE1A (Margolskee, 2002). Использование антител против а-гастдуцина (иммунопреципитация) показало, что многие горькие компоненты ведут к гастдуцин-зависимому снижению уровня циклических нуклеотидов.
Электрофизиологическая идентификация вкусовых клеток. Три типа вкусовых клеток на основе их электрофизиологических характеристик
На основе данных световой и электронной микроскопии клетки вкусовой почки можно подразделить на нескольких типов, в том числе тип I - темные, тип II - светлые, тип III - промежуточные. Фактически, популяция веретенообразных клеток во вкусовой почке еще более гетерогенна, поскольку клетки подвергаются постоянному обмену и образуются из делящихся и дифференцирующихся базальных клеток. Поэтому даже во взрослом организме среди веретенообразных вкусовых клеток есть клетки, находящиеся на разных стадиях развития, то есть взрослеющие, взрослые и апоптотические.
Однако пока не существует электрофизиологических критериев для идентификации взрослых рецепторных клеток, которые были бы применимы в электрофизиологических и биофизических экспериментах по изучению механизмов вкуса. В то же время, в таких экспериментах морфологические или иммуногистохимические критерии неприменимы для идентификации вкусовых клеток. Поэтому одной из целей нашей работы было разработать электрофизиологические критерии для идентификации клеток вкусовой почки на основе их электрических характеристик, что и послужило отправной точкой настоящей работы.
Мы проанализировали около 1000 веретенообразных вкусовых клеток мыши и установили, что в псевдофизиологических условиях регистрации в ответ на импульсную стимуляцию (п=564) вкусовые клетки демонстрировали наличие потенциал-зависимых (ПЗ) клеточных токов различных семейств. Характерные регистрации представлены на рис. 9А-С, и для удобства клетки, демонстрирующие родственные семейства интегральных токов были названы типы А, В и С соответственно.
Клетки типа А были наиболее представленными среди выделенных одиночных клеток вкусовой почки (52%). Для клеток этого типа были характерны входящие ПЗ натриевые токи амплитудой 100-800 пА, блокируемые ТТХ, относительно медленно активирующиеся выходящие токи порядка 2 нА и значительные по амплитуде хвостовые токи, генерируемые в ответ на реполяризацию клеточной мембраны до поддерживаемого потенциала в -70мВ (Рис. 9А, 10А).
Анализ хвостовых токов позволяет грубо оценить природу проводимости, активируемую при данном командном потенциале. Мгновенный хвостовой ток можно записать как: /, = G(V.) (Vh-Vr) где G(V) - проводимость при данном потенциале, Vc - командный потенциал, Vh, - поддерживаемый потенциал, Vr - потенциал реверсии. Из уравнения следует, что в псевдофизиологических ионных условиях при Vh =-70 мВ калиевые каналы должны производить выходящие хвостовые токи, в то время как причиной входящих хвостовых токов могут быть другие катионные и анионные каналы (например, Na , Са , СГ, либо неселективные ионные каналы) с потенциалом реверсии значительно правее -70 мВ. Отношение амплитуды хвостовых токов при Уь=-70мВ и токов при потенциале + 50 мВ около -1 говорит о том, что потенциал реверсии данных токов около -10-0 мВ. Таким образом, вклад калиевых каналов в ПЗ выходящие токи в клетках типа А мал. Действительно, частичная замена экстраклеточного натрия на тетраэтиламмоний (TEA), блокатор калиевых каналов, незначительно блокировали выходящие токи (Рис. 11). Кроме того, данные токи регистрировались с сохраняющейся в порядковом отношении амплитудой в условиях, когда К+ в пэтч-пипетке заменялся на Cs+ (Рис. 12А), NMDG (не показано). Эта проводимость частично блокировалась, когда хлор в экстраклеточном растворе заменялся на глюконат, смещая потенциал реверсии вправо на 31 ±5 мВ, и частично ингибировалась милимолярными концентрациями немоновалентных ионов в экстраклеточном растворе (Ва , А13+). Потенциал реверсии тока для данной проводимости близок к нулю. Предполагая, что данная проводимость может быть анионной, мы протестировали действие различных хлорных блокаторов (NPPB, нифлумовая кислота, DIDS, SITS, 9-АС), однако оказалось, что самый эффективный из них, DIDS, блокировал данные токи лишь на 20-30 % (не показано).
. Вкусовые клетки демонстрируют различные наборы интегральных токов. А-С - репрезентативные семейства потенциал- зависимых (ПЗ) интегральных токов (слева) и соответствующие вольт-амперные кривые (справа). А, В и С справа -зависимость неинактивирующегося тока (V), ПЗ Na+OKa (А), и хвостовых токов () (вставки в А и В) от мембранного потенциала. Вставка в С - вольт-амперная зависимость быстрого ёмкостно-подобного тока (о), регистрируемого несмотря на полную компенсацию мембранной ёмкости.
Тип В (31% клеток) в псевдофизиологических условиях также демонстрировал наличие чувствительных к ТТХ потенциал-зависимых Na+-токов, превышающие по амплитуде натриевые токи, регистрируемые от клеток типа А (Рис 9В, 10В). В отличие от клеток А-типа, для выходящих токов клеток типа В была характерна относительно быстрая активация и слабая инактивация. Хвостовые токи были очень малы и имели входящее направление при потенциалах, меньших -20 мВ и становились выходящими при более положительных потенциалах. Это свидетельствует о том, что К+ является основным носителем выходящих токов при потенциалах -ЮмВ и выше (Рис. 9В-вставка). Экстраклеточные TEA (Рис. 11), Ва2+ (частично), хинин, а также форсколин блокировали данную проводимость, как и замена калия на цезий в петч-пипетке - в условиях Naout/Csin выходящие токи блокировались почти полностью, а в хвостовых токах пропадала выходящая компонента и они становились отрицательными (Рис. 12).
