Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эксперментальше и математшеские методо выделения сигналов в ямр-спекграх пептидов и белков 9
1.1. Методы выделения сигналов ЯМР из шума (Чувствительность спектрометра) 9
1.2. Методы выделения малых сигналов в присут ствии интенсивных сигналов растворителя. (Динамический диапазон спектрометра) . 23
1.3. Методы выделения индивидуальных сигналов в спектрах ЯМР пептидов и белков . 38
Глава 2. Повышение разрешения в спектрах ямр 59
2.1. Общий случай 60
2.2. Случай ограниченного времени наблвдения. Аподизация 62
2.3. Проектирование цифровых фильтров . 65
2.4. Изменение отношения сигнал/шум при использовании весовой функции произвольной формы 72
2.5. Максимальный коэффициент сужения при цифровой фильтрации 79
2.6. Математическое обеспечение для исследования методов цифровой фильтрации с целью повышения разрешения в спектрах ЯМР и его практическая реализация 84
Глава 3. Расчет параметров кривых рН-тигрования . 89
3.1. Математические модели для определения параметров кривых рН-титрования 89
3.2. Определение параметров кривых рН-титрования и их погрешностей 94
3.3. Выбор математической модели 97
3.4. Пример использования значений параметров кривых рН-титрования для определения расстояния между остатками Cys'1 и Glu7 апамща 102
3.5. Описание программы расчета параметров кривых рН-титрования 102
Глава 4. Расчет констант комплексообразования циклопептвдных ионофоров 107
4.1. Математические модели 108
4.2. Расчет констант комплексообразования и спектральных параметров по экспериментальным данным 111
4.3. Выбор математической модели и частные случаи определения содержания отдельных форм в смеси 114
4.4. Результаты расчетов параметров комплексообразования некоторых ионофорных комплексов 120
4.5. Описание программы расчета констант комплек сообразования 125
Глава 5. Метод одновременного накопления %-2-0-спекгр0в с корреляцией по скалярному спин спиновому взаимодействию (cosy) и по ядерному эффекту оверхаузера (noesy) 126
5.1. Базовая схема 127
5.2. Фазовая последовательность 129
5.3. Описание эксперимента одновременного накопления %-2-D-COSY и -^-D-NOESY спектров 136
Экспершшнталъная часть 140
Выводы 141
Список литературы 143
- Методы выделения малых сигналов в присут ствии интенсивных сигналов растворителя. (Динамический диапазон спектрометра)
- Изменение отношения сигнал/шум при использовании весовой функции произвольной формы
- Пример использования значений параметров кривых рН-титрования для определения расстояния между остатками Cys'1 и Glu7 апамща
- Расчет констант комплексообразования и спектральных параметров по экспериментальным данным
Введение к работе
Интенсивное развитие методики и экспериментальной техники ядерного магнитного резонанса (ЯМР) связано прежде всего с тем, что эта область спектроскопии стала эффективным инструментом исследования строения вещества. В частности, спектроскопия ЯМР широко используется в исследованиях свойств и механизма биологического действия белков и пептидов. Особое внимание привлекает способность ЯМР спектроскопии устанавливать пространственную структуру и ее динамику в растворах, в том числе, в физиологических условиях. Для этой цели используют химические сдвиги различных ядер, константы спин-спинового взаимодействия между ядрами и релаксационные параметры отдельных резонансных сигналов. Ключевым этапом этих исследований является выделение сигналов ЯМР и их отнесение к определенным структурным элементам биополимера. Возникающие, как правило, при этом существенные трудности могут быть преодолены путем прямого анализа спектров со специальной математической обработкой, а также с помощью экспериментальных методов возмущений.
Метод возмущений, заключающийся в индуцировании спектральных изменений путем введения в раствор целевых реагентов, позволяет изучать не только пространственную структуру исследуемого объекта, но и возможности конформационных перестроек при смене внешних условий. Факторами, влияющими на пространственную структуру могут быть кислотность (рН) и состав среды, температура, взаимодействие с молекулярными лигандами и ионами, эффекты уширяющих или сдвигающих ионов и реагентов, а также селективная химическая модификация. Однако метод возмущений таит в себе опасность нарушения нативной пространственной структуры молекулы и поэтому его с осторожностью
- в -
следует применять для отнесения сигналов. Вследствие этого, а также в связи с совершенствованием вычислительной техники, возрастает значение прямого анализа сложных спектров биополимеров с использованием богатого набора приемов самого метода ЯМР. К наиболее эффективным методам анализа относятся дифференциальная спектроскопия в сочетании с гомо- и гетероядерным многочастотным резонансом, двумерная (2-D) спектроскопия с корреляцией по скалярному и дипольному взаимодействию ядер, прямой и обратный расчет мультиплетности. Однако потенциальные возможности этих методов не всегда могут быть полностью реализованы из-за ряда аппаратурных причин: низкое отношение сигнал/шум, ограниченный динамический диапазон приемной части спектрометра, сильное уширение линий в ЯМР-спектрах макромолекул, приводящее к их перекрыванию. Эти проблемы могут быть в значительной мере решены путем математической обработки спектров на ЭВМ.
Целью диссертационной работы является базирующийся на математических методах комплексный подход к решению основных проблем спектрального анализа, встречающихся при ЯМР-исследованиях белков и пептидов. К наиболее существенным результатам относятся:
а) общий способ повышения информативности ЯМР-спектров с
помощью цифровых фильтров;
б) алгоритм и математическое обеспечение для обработки экс
периментальных ЯМР-данных при рН-титровании с целью определения
констант диссоциации для форм, участвующих в равновесии, и выбора
модельной схемы, которая описывает происходящие в растворе про
цессы;
в) алгоритм и математическое обеспечение для расчета ЯМР-
спектров метал -ионофорных комплексов для вычисления констант
устойчивости комплексов и их стехиометрии, а также для построения системы равновесных реакций комплексообразования;
г) разработка метода одновременного накопления Н-2-О-корре-ляционных спектров (COSY), с помощью которых получают сведения об основных системах, связанных скалярным спин-спиновым взаимо-
действием (J -связи) и Н-2-Оспектров ядерного эффекта Оверхау-зера, позволяющих выявлять диполь-дипольные магнитные взаимодействия между пространственно сближенными ядрами (ЯЭО-связи), при абсолютно идентичных условиях проведения эксперимента (температура, значение рН, спектральное разрешение и т.д.) при меньших затратах приборного времени.
диссертационная работа состоит из пяти глав.
Первая глава содержит литературный обзор существующих экспериментальных и математических методов выделения сигналов в ЯМР-спектроскопии.
Вторая глава посвящена проблеме цифровой фильтрации в ЯМР-спектроскопии для сужения спектральных линий, а также влияния фильтрации на изменение отношения сигнал/шум. В результате проведенного анализа получено значение максимального коэффициента сужения в реальных условиях - ограниченный динамический диапазон, заданная разрядная сетка ЭВМ и отношение сигнал/шум на входе приемного устройства спектрометра. Предложены практические рекомендации для обработки спектров ЯМР пептидно-белковых веществ.
В третьей главе представлена методика определения параметров рН-зависимостей химических сдвигов в спектрах белков и пептидов и построения математической модели для форм, участвующих в равновесии.
В четвертой главе изложена методика расчета констант комплек-
сообразования и стехиометрии металл-ионофорных комплексов.
Пятая глава посвящена методу одновременного накопления H-2-0-J-корреляционных спектров и Н-2-D-спектров, основанных на эффекте Оверхаузера, с использованием фазо-циклических импульсных последовательностей.
Экспериментальная часть представляет собой описание практических систем обработки данных ЯМР-спектроскопии на базе ЭВМ различных классов.
Методы выделения малых сигналов в присут ствии интенсивных сигналов растворителя. (Динамический диапазон спектрометра)
Эксперименты с пептидами и белками, как правило, проводятся в водных растворах (Н20 или D2 0 ), где концентрация растворителя составляет НО М , в то время как концентрация исследуемого вещества, сигналы от которого необходимо наблюдать, равна приблизительно I мМ . Такое большое, невыгодное соотношение (= 10 ) приводит в ЯМР-спектроскопии с Фурье-преобразованием к серьезной проблеме выделения малых сигналов в присутствии больших по интенсивности сигналов растворителя с помощью электронно-вычислительной машины (ЭВМ), оснащенной аналого-цифровым преобразователем (АЦП), т.е. к проблеме так называемого ограниченного динамического диапазона. При исследовании этой проблемы Купер /27,28/ теоретически и экспериментально показал, что возможность получения точной информации о спектре ограничена относительной точностью аналого- цифрового преобразователя, которая вычисляется по формуле A6/2d где Ах, - амплитуда наибольшего сигнала в спектре, d - число разрядов АЦП. Этот предел характеризуется так называемым разрешением АЦП, которое выражается как 2d , т.е. общим числом разрядов, необходимых для каждого цикла преобразования напряжения сигнала в соответствующее число /5/. Было показано /27/, что наименьший сигнал, который может различить АЦП в присутствии сигнала с амплитудой Ах. , должен иметь такую интенсивность, чтобы отношение Ах / Ац , называемое динамическим диапазоном, равнялось 2d , где Адо - наименьший сигнал в спектре. При этом разрешение преобразователя не должно быть меньше этого отношения. В работе /27/ получено выражение для максимального числа накоплений п макс до возникновения переполнения разрядной сетки ЭВМ, в зависимости от числа разрядов d АЦП, длины машинного слова b и отношения сигнал/шум на входе преобразователя (с/швх :
При отношении (с/пО-ду =5 10 эта формула упрощается: Первая формула может быть использована для расчета пМАКС для спектров с отношением (с/ш)вх м 10, содержащих сигналы примерно равной интенсивности. При наличии в спектрах больших по амплитуде сигналов с отношением (с/ш)вх х. и небольших по ин- тенсивности сигналов с отношением (с/ш)_„ .. динамический диапазон равен (с/ш)вх (J / (с/ш)вх м /28/. Максимальное число накоплений можно также рассчитать по формуле (1-І), где необходимо в качестве (с/ш)вх брать (с/ш)вх б . В этом случае число накоплений будет меньше, чем если бы в спектре имелись только слабые сигналы, поскольку переполнение разрядной сетки ЭВМ в этом случае будет определяться именно этими сигналами. Таблица І-П показывает выходные значения отношений (с/ш)внх м для слабых сигналов, т.е. тех сигналов, в которых содержится спектральная информация, для наиболее распространенных значений (с/ш) , (/ш)м длины машинного слова b и разрешающей способности d АЦП. Как следует из таблицы 1-П,для расширения динамического диапазона необходимо увеличивать длину разрядной сетки ЭВМ. Поскольку для достижения требуемого отношения сигнал/шум в конечном спектре надо сделать вполне определенное количество накоплений, которое может превышать допустимое число накоплений п макс до пеРеполнения памяти ЭВМ,, Купером /27/ был предложен следующий метод. При выявлении переполнения разрядной сетки ЭВМ входной сигнал, содержимое памяти ЭВМ и разрешение АЦП автоматически уменьшается в два раза, после чего накопление автоматически продолжается.
Этот прием применяется до тех пор, пока разрешение АЦП не достигает шести разрядов (минимальное разрешение промыш-ленно выпускаемых АЦП). Однако вследствие увеличения ошибки преобразователя, равной единице младшего разряда, отнесенной к полной шкале АЦП, появляется дополнительный цифровой шум Nu , дающий дополнительный вклад в общее отношение сигнал/шум. В работе /27/ для расширения динамического диапазона был предложен метод блочного накопления, при котором после некоторого числа накопле- ний в одной половине памяти ЭВМ, до появления усечения по амплитуде сигнала ССИ , т.е. до переполнения разрядной сетки ЭВМ, делается Зурье-преобразование и частотный спектр запоминается в другой половине памяти. Затем цикл повторяется, после чего частотный спектр первого блока складывается со спектром второго и т.д. Однако этот метод не лишен недостатков, связанных с несколько большим временем обработки спектров и, как показано Кайзером и Кнайтом /29/, увеличением математического шума NM из-за ошибок округления при урье-преобразовании. Для обобщения вкладов от аналогового шума ЯМР спектрометра NA , цифрового шума Nu аналого-цифрового преобразователя и математического шума N м , возникающего при фурье-преобразовании, Кимбер, Рот и Фини /30/ показали, что отношение с/ш растет не пропорционально Vn" , а имеет вид
Изменение отношения сигнал/шум при использовании весовой функции произвольной формы
Поскольку LUu))=0 при ди)=1/Т2 , то полуширина линии на полувысоте &u)1/2=1/2 Т2 . Таким образом максимальный коэффициент сужения при фильтрации с помощью треугольной весовой функции равен 2. Как показывает практика такого сужения линий вполне достаточно для обработки реальных спектров макромолекул (рис. П-5). Далее (см. П-5) будет строго показано, что при работе с биологическими объектами в условиях ограниченного динамического диапазона и малой величины отношения сигнал/шум коэффициент сужения больше двух получить чрезвычайно сложно, независимо от качества цифрового фильтра. Подводя итоги этого параграфа можно сказать, что предложенные цифровые фильтры могут быть легко реализованы в ЭВМ, не требуют выполнения подпрограмм-функций (экспоненты, синуса), т.е. имеют высокую скорость обработки, обладают достаточной эффективностью для применения в различных областях спектроскопии ядерного магнитного резонанса. П-4. Изменение отношения сигнал/шум при использовании весовой функции произвольной формы. Если шум, присутствующий в спектре, во временной области обозначить через N(t) , а в частотной через N(u)) , то исполь- где т - время регистрации сигнала ЯМР, П - частотный диапазон, в котором рассматривается шум. Если предположить, что сред-неквадратическое значение шума в рассматриваемом диапазоне частот остается постоянным, а за его пределами равно нулю, и если период флюктуации шума много меньше по сравнению со временем интегрирования, то для среднеквадратического значения шума справедливо выражение : из которого можно определить уровень шума в частотном спектре
После фильтрации шум во временной области принимает вид: о где Wlt.pj) - выбранная весовая функция с параметрами р,- . Если предположить, что шум после фильтрации остается "белым", то Допустим, что линия в спектре имеет чисто Лоренцеву форму, тогда применяя ФП (П-2) получаем: С помощью соотношения (П-21) проанализированы несколько фильтров (табл. П-І), причем, поскольку для синусного окна при т = 3 Т2 коэффициент сужения равен 1,5, то и все остальные были рассчитаны для этих же значений кит . Наибольшим уменьшением с/ш обладает конволюционно-разностный метод, так как оператор 1/k , применяемый без аподизации, уменьшает амплитуду сигнала ССИ до нуля в начале временного интервала наблюдения, а в конце сильно увеличивает амплитуду шума. Максимально достижимый коэффициент сужения линий в спектре ЯМР ( ) уже рассматривался в работе Витболда и соавторов /103/ для идеализированного случая, т.е. когда в спектре отсутствует шум и сигнал занимает полную разрядную сетку ЭВМ. Для случая ограниченного динамического диапазона и наличия шума в спектре, используя рассуждения, аналогичные указанным в приведенной работе, выведем значение 1 . Если, как и ранее, принять ССИ одной линии f(t )=exp(-at) , то в момент времени т сигнал достигнет величины где г - количество разрядов слова ЭВМ, d - число разрядов, на которое сокращается разрядная сетка компьютера в условиях ограниченного динамического диапазона, п - количество разрядов, занимаемых шумом (рис. П-6). Откуда x=In2(N -1)/a , где a - исходная полуширина линии. После фильтрации g(t) = w( t)e_it и, если подобрать такой цифровой фильтр, чтобы при t т выпол-нялось соотношение w[tje = 1 f то после ФП линия в спектре будет иметь вид:
Пример использования значений параметров кривых рН-титрования для определения расстояния между остатками Cys'1 и Glu7 апамща
Для расчета параметров кривых, рН-титрования была разработана диалоговая система, укрупненная блок-схема которой приведена на рис. Ш-5. Программа написана на языке ФОРТРАН и состоит из управляющей программы TTRM123 , которая осуществляет ввод и коррекцию исходной информации, управляет последовательностью работы всех других подпрограмм, а также производит вывод полученных результатов. Этап коррекции заключается в следующем. Обычно при вводе массива чисел, при рН-титровании, для одного набора значений рН в память ЭВМ заносятся несколько наборов наблюдаемых значений химических сдвигов $w , где k = 1,2... N порядковый номер соответствующих величин рН и S , индекс j =1,2. -М обозначает номер кривой титрования, поскольку изменение значений химических сдвигов может иметь место одновременно у нескольких сигналов. Чтобы избежать ошибок при вводе,имеется две возможности исправления ошибок: первая - это редактирование непосредственно самой строки, до ее запоминания в памяти ЭВМ, и вторая - осуществляется после завершения ввода данных, когда на дисплей вводится весь массив введенных чисел. После чего оператор может задать номер исправляемой строки и кривой титрования, при этом на дисплей выводится значение необходимых для корректировки данных. Шеется возможность корректировать также значение начальных приближений искомых параметров. Введение в программу этапа коррекции сводит к минимуму получение неправильных значений выдаваемых ЭВМ результатов, а также к экономии машинного времени. Для увеличения скорости обмена параметрами между подпрограммами и с целью экономии памяти компьютера все массивы чисел объединены в соответствующие блоки COMMON . где приращение параметра &Pj обычно выбирается в пределах 1-2 процента величины самого параметра /127/. Подпрограммд]ЧАТ1Му модифицирует матрицу Н-,; для того, чтобы она была положительно определенной, и рассчитывает обратную -1 ей матрицу Ни . диагональные элементы этой матрицы используются для расчета ошибок параметров pj (см. Ш-2).
В результате расчета выходными параметрами являются значение а величины параметров кривых титрования и их ошибки (см. Ш-2). В заключение можно отметить, что апробация вышеизложенного в этой главе алгоритма и стратегии выбора математических моделей для определения значений параметров и их погрешностей при ЯМР рН-титровании позволила с достоверностью обнарулшвать электростатическое взаимодействие титрующихся групп и тем самым показать пространственные контакты между ними, а в некоторых, наиболее благоприятных случаях, оценить расстояние между ионогенными группами.
Расчет констант комплексообразования и спектральных параметров по экспериментальным данным
Методрешения и анализ данных. Для определения неизвестных параметров, к которым относятся константы устойчивости и значения спектральных параметров PLM и pLM , ищем минимум функционала: N где N - число экспериментальных точек; дРэксп [ - набор величин, получаемый из эксперимента, в зависимости от отношения (В/А); й)\ - весовые множители, ш} =1/ -, ( ст; -дисперсия измерения величины {дРэксп } )» в случае равноточных измерений можно принять а =1 ; д выч г і " на Р величин, получаемый в результате расчета по уравнениям (ІУ-2), (ІУ-5) или (ІУ-8), в зависимости от выбранной математической модели комплексообразования при ограничениях К- 0 (IV-13) Для минимизации функционала (ІУ-І2), также как и в главе Ш, использован метод сопряженных направлений Пауэлла, алгоритм которого описан в /121/. Поскольку этот алгоритм разработан для класса задач без ограничений, для его реализации необходимо модифицировать условие (ІУ-ІЗ). Принимая диапазон изменения констант практически неограниченным, представим их в виде К = 10х. Тогда оптимизируемыми параметрами в уравнении (ІУ-І2) являются неКг , a Xj= log К. . . Кроме того для масштабирования параметров, а также для выбора начального шага оптимизации,одинакового для всех оптимизируемых параметров,нормированы значения экспериментально наблюдаемых величин { д-Рэксп.п » путем их деления на максимальное значение (дРэксп )мах Из (ІУ-2), (ІУ-5) и (ІУ-7) видно, что наряду с подлежащими определению параметрами К К ,К , рш и др1М,в них входит неизвестная концентрация свободного лиганда [ L ] . Чтобы отыскать все неизвестные величины, организована следующая итерационная процедура для проведения расчетов на ЭВМ. Для разумно выбранных исходных значений констант К. решалось одно из уравнений (ІУ-3), (ІУ-6), или (ІУ-9), в зависимости от выбранной схемы ком-плексообразования. Решением уравнения (ІУ-3) в случае (I ) является: Решением уравнений (ЗУ-6) и (ІУ-9) в случаях (П) и (Ш) является наименьший положительный корень. Для его получения использована комбинация методов прямого поиска и деления отрезка пополам /133/, Затем, в зависимости от математической модели значения К; , най- денные значения[1_] и исходные параметры, соответствующие различ ным комплексным состояниям ( д р, , АР )t подставлялись в LM _2 М соответствующие уравнения (ІУ-2), (ІУ-5) или (ІУ-7) для определения д Рна(5л#. Полученные таким образом { ДРВЫЧ;} , подставлялись в уравнение (ІУ-І2). Значения концентраций [L] , величин К;, -PLH.-PL2H варьировались до достижения минимума выражения (ІУ-І2). После этого находится оптимальный набор искомых параметров. Анализ набора получаемых параметров рассмотрен в /134,135/, где указывается, о "наилучший" набор параметров не обязательно правильно описывает совокупность химических взаимодействий, протекающих в системе.
Достоверность этого набора зависит от того, насколько соответствует действительности выбранная модель, достаточны и надежны экспериментальные данные, совершенна программа. Погрешности. Экспериментальные величины {АРЭКСП. } сДеР" жат в себе погрешности измерения, которые в свою очередь приводят к ошибкам в определении параметров комплексообразования. Для расчета ошибок параметров комплексообразования, найденных оптимизацией функционала (ІУ-І2), вычислялись индивидуальные доверительные интервалы этих параметров /135/ следующим образом. Преобразуем одну из формул (ІУ-2), (ІУ-5) или (ІУ-8) для вычисления того из параметров, для которого отоится интервал, принимаем все остальные вычисляемые параметры за истинные и подставляем в преобразованную формулу экспериментально наблюдаемые величины {дР Эксп.}« Таким образом получаем соответствующие значения параметра. Затем стандартным методом /126/ определяем доверительный интервал для выбранного параметра. Тем же способом строим интервалы для других параметров. Выбор _модели. Для правильной оценки параметров комплекоообразования наиболее важным является выбор математической модели (схемы комплекоообразования). В некоторых случаях по характеру кривой комплексообразования можно определить математическую модель. Из рис. ІУ-І видно, что при экстрополяции линейных участков экспериментальной кривой, точка их пересечения (точка эквивалентности /136/) находится при соотношении лиганд/катион 1:1. В этом случае расчет ведется по модели (I). Кривые процессов комплексообразования, представленные на рис. ІУ-2, явно сложнее, чем в моделях (I) и (Ш). Тогда расчет следует вести по модели ( П). В других случаях выбрать математическую модель по графику не представляется возможным. Так, например, на рис. ЗУ-З точка эквивалентности смещена относительно соотношения 1:1 в сторону соотношения 1:2. Поэтому при расчете используются модели для случаев (I) и (П), а затем проводится анализ по F -критерию /125/, который расчитывается по формуле /137/
Похожие диссертации на Математические и экспериментальные методы в конформационном ЯМР-анализе пептидов и белков
