Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. а-Токоферол (а-ТФ) и особенности его действия 13
1.1.1. Структура, номенклатура, транспорт и локализация витамина Е... 13
1.1.2. Функции а-ТФ 15
1.1.2.1. Антиоксидантная роль токоферолов 16
1.1.2.1.1. Антиокислительные способности а-ТФ 17
1.1.2.1.2. Участие а-ТФ в регуляция пероксидного окисления липидов в биологических мембранах 22
1.1.2.2. Структурные и динамические особенности мембран и модификация их а-ТФ 26
1.2. Действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах - новая область исследований 39
1.2.1. Общие закономерности действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах и существующие теории, объясняющие их 41
1.2.1.1. Роль специфических (рецепторных) взаимодействий в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах 48
1.2.1.2. Особенности структуры жидкой воды и их роль в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах 53
1.2.2. Действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах на биологические мембраны 62
Глава 2. Материалы и методы 70
2.1. Методика приготовления растворов а-ТФ в спирте и вазелиновом масле 70
2.2. Выделение мембран эндоплазматического ретикулума и плазматических мембран из клеток печени мышей 70
2.3. Определение концентрации белка в мембранах 72
2.4. Применение метода спинового зонда для изучения структурно-динамического состояния микросомальных и плазматических мембран ...72
2.4.1. Измерение вязкостных характеристик различных областей липидного бислоя мембран 74
2.4.2. Определение термоиндуцированных структурных переходов в липидном бислое мембран и расчет эффективной энергии их активации. 81
2.5. Статистическая обработка данных 84
2.5.1. Интервальные оценки распределения средних показателей 84
2.5.2. Сравнение двух средних показателей 86
2.5.2.1. /-Тест или Меритерий Стьюдента (параметрический критерий) 87
2.5.2.2. Критерий Уилкоксона (непараметрический критерий) 88
2.5.3. Корреляционный анализ 89
2.5.4. Сравнение двух стандартных отклонений (F-критерий Фишера)...90
2.5.5. Вычисление суммарной ошибки в определении эффекта 91
2.6. Использование инфракрасной спектроскопии для изучения структурно-динамического состояния водных растворов а-ТФ 92
2.6.1. Измерения флуктуации показателей пропускания тонких слоев водных растворов в средней части ИК-спектра 93
2.6.2. Использование расстояния Махаланобиса в качестве формального критерия происходящих в воде изменений 97
Глава 3. Экспериментальная часть и обсуждение результатов 99
3.1. Влияние а-ТФ на структурное состояние глубоколежащих областей микросомальных мембран клеток печени мышей in vitro 100
3.1.1. Изменение микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10'4-10"25М) при температуре 293 К 100
3.1.2. Температурные зависимости тс и термоиндуцированные структурные переходы в глубоколежащих областях микросомальных мембран 104
3.1.3. Эффективная энергия активации термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих областях липидов микросомальных мембран 113
3.2. Влияние а-ТФ на структурное состояние поверхностных областей микросомальных мембран клеток печени мышей in vitro 115
3.2.1. Изменение жесткости поверхностных областей липидного бислоя микросомальных мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) при температуре 293 К 115
3.2.2. Температурные зависимости S и термоиндуцированные структурные переходы в поверхностных областях микросомальных мембран 119
3.3. Влияние а-ТФ на структурное состояние глубоколежащих областей плазматических мембран клеток печени мышей in vitro 128
3.3.1. Изменение микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя плазматических мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (\0'4-\0'25М) при температуре 293 К 129
3.3.2. Температурные зависимости тс и термоиндуцированные структурные переходы в глубоколежащих областях плазматических мембран 132
3.3.3. Эффективная энергия активации термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих областях липидов плазматических мембран 138
3.4. Влияние а-ТФ на структурное состояние поверхностных областей плазматических мембран клеток печени мышей in vitro 140
3.4.1. Изменение жесткости поверхностных областей липидного бислоя плазматических мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) при температуре 293 К 140
3.4.2. Температурные зависимости S и термоиндуцированные структурные переходы в поверхностных областях плазматических мембран 143
3.5. Роль полярности растворителя, в частности, воды в эффектах сверхнизких и «мнимых» концентраций а-ТФ 153
3.5.1. Сравнительное изучение эффекта полярных (водно-спиртовых) и неполярных (в вазелиновом масле) растворов а-ТФ на вязкостные свойства микросомальных мембран 153
3.5.2. Влияние а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) на показатели ИК-спектра тонких слоев воды 159
Глава 4. Заключение 166
4.1. Особенности и возможные механизмы действия а-ТФ на структуру микросомальных и плазматических мембран в трех областях концентраций 166
4.1.1. Неспецифическое встраивание а-ТФ в мембрану как механизм его действия в «физиологических» концентрациях (ІСҐ-ІО"9 М) 167
4.1.2. Специфическое взаимодействие а-ТФ со связывающими центрами на мембране и инициирование образования микродоменных структур в ней в качестве возможных механизмов действия а-ТФ в СМД (10'9-10"18 М) 168
4.1.3. Роль полярных свойств растворителя (воды) в механизме действия «мнимых» концентраций а-ТФ (10"18-10"25М) 170
Выводы 174
Список литературы 176
- Структурные и динамические особенности мембран и модификация их а-ТФ
- Действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах на биологические мембраны
- Применение метода спинового зонда для изучения структурно-динамического состояния микросомальных и плазматических мембран
- Влияние а-ТФ на структурное состояние поверхностных областей микросомальных мембран клеток печени мышей in vitro
Введение к работе
Актуальность исследования.
Одним из самых поразительных открытий последних двух десятилетий является обнаружение действия биологически активных веществ (БАВ) -гормонов, пептидов, пестицидов, ядов, антиоксидантов (АО) и других аген-тов, в сверхнизких концентрациях (10' -10" М) на живые системы различной степени сложности (от ферментов и мембран до целостных организмов и популяций) [126-128,133]. Каждому из веществ может соответствовать своя специфическая мишень, свои особенности метаболизма, но при действии их в сверхмалых дозах (СМД) наблюдается ряд общих свойств [128,133]:
Немонотонная, нелинейная полимодальная зависимость "доза-эффект". В большинстве случаев максимумы активности наблюдаются в определенных интервалах концентраций, разделенных между собой так называемой "мертвой зоной", где эффект не проявляется или минимален;
Изменения чувствительности (как правило, увеличение) биообъекта к действию разнообразных агентов, как эндогенных, так и экзогенных;
Проявление кинетических парадоксов, а именно возможность уловить эффект СМД БАВ, когда в клетке или в организме имеется то же вещество в концентрациях, на несколько порядков превышающих вводимую дозу. Влияние на рецептор вещества в концентрациях, на порядки более низких, чем константы диссоциации комплекса лиганд-рецептор;
Зависимость "знака" эффекта от начальных характеристик объекта;
"Расслоение" свойств БАВ по мере уменьшения его концентрации, при котором еще сохраняется активность, но исчезают побочные эффекты.
Несмотря на лавинообразное увеличение количества фактов разнообразного характера о действии БАВ в СМД, механизм этого явления до конца не установлен. Природа таких общих закономерностей действия БАВ в СМД может быть связана с общностью критических мишеней. На основании ряда работ [155,158-163,233,256] можно было полагать, что в качестве таких мишеней могут выступать клеточные и субклеточные мембраны. Именно в био-
логических мембранах локализованы важнейшие регуляторные системы, отвечающие за функционирование клетки и организма: системы вторичных посредников и пероксидного окисления липидов (ПОЛ) [1,48,59], которые находятся в тесном взаимодействии и оказывают влияние друг на друга [161,165,166,264]. Система регуляции ПОЛ контролирует скорость пероксидного окисления липидов в биомембранах, и ее параметрами являются: состав липидов, их способность к окислению и радикалообразованию, скорость выхода из мембраны, а также ее структурно-динамическое состояние [57-59]. Существенную роль в регуляции ПОЛ играют и природные антиоксиданты, встроенные в мембрану и ингибирующие ПОЛ как за счет обменных реакций со свободными радикалами в липидах, так и благодаря созданию более компактной структуры, уменьшающей доступ кислорода к липидам [59,98]. Одним из наиболее известных и эффективных природных АО является си-токоферол (а-ТФ), принадлежащий к группе витамина Е и являющийся его наиболее активной формой, чем и обусловлена его витаминная и физиологическая активность [3-6], недостаток которой приводит к тяжелым биохимическим нарушениям [2,7-9]. Благодаря своей липофильности и строению, ос-ТФ сосредоточен в липидном бислое мембраны и поэтому способен непосредственно влиять на ее структурные и динамические свойства [91,98], в частности образуя домены с определенной стехиометрией и фосфолипидным составом [15,104], а также связываясь с продуктами гидролиза липидов, оказывающих детергентно-подобное действие на мембрану [99,100]. Однако, как уже указывалось выше, состав и структурно-динамическое состояние липид-ного бислоя являются одними из наиболее важных факторов для клеточного метаболизма, занимающими центральное место в цепи регуляции ПОЛ, изменение которых влияет на активность и чувствительность мембранно-связанных и липид-зависимых регуляторных белков, ферментов и рецепторов. До недавнего времени действие а-ТФ как на химических, так и биологических моделях, исследовалось в интервале относительно высоких концен-траций 10" -10' М. Однако в последние годы появились биохимические ис-
следования, в которых достоверно установлено влияние а-ТФ на ПОЛ [155,168] и на активность одного из ключевых ферментов фосфоинозитидно-го цикла, являющегося одновременно пероксилипид-зависимым, протеинки-назы С (пк-С), в ультранизких концентрациях ( вплоть до 10"8 М) [164,165].
В связи с вышесказанным, изучение взаимодействия а-ТФ с различными регионами липидного бислоя биологических мембран, отличающихся по своим биохимическим и регуляторным свойствам, может приблизить нас к решению весьма актуального и важного вопроса о механизме действия БАВ в сверхнизких концентрациях.
Цели и задачи исследования.
Цель данной работы состоит в изучении влияния природного АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) на структурные характеристики различных регионов липидного бислоя биологических мембран клеток печени мышей in vitro.
В качестве объектов исследования использовались: а) мембраны эндо-плазматического ретикулума (ЭР), которые являются традиционной моделью для исследования процессов ПОЛ и влияния на него анти- и прооксидантов; б) плазматические мембраны (ПМ), в которых локализованы регуляторные системы вторичных посредников.
Конкретными задачами исследования являлись:
Исследование методом спиновых зондов ЭПР влияния а-ТФ в интервале концентраций (10"4-10"25М) на жесткость поверхностных (~8А) и микровязкость глубоколежащих (~20А) областей липидного бислоя мембран ЭР и ПМ клеток печени мышей при температуре 293 К. Получение зависимостей доза-эффект.
Изучение методом спинового зонда ЭПР влияния концентраций а-ТФ, соответствующих экстремумам на дозовой зависимости и не влияющих на определяемые параметры, на термоиндуцированные структурные переходы в различных областях липидного бислоя, а также эффективную
энергию их активации в глубоколежащих областях липидов мембран ЭР иПМ.
Конкретизация механизмов действия различных концентраций а-ТФ на исследуемые структурно-динамические параметры мембран ЭР и ПМ.
Выяснение роли полярности растворителя а-ТФ в механизме действия его «мнимых» концентраций (10"18-10'25 М) путем сравнительного изучения влияния а-ТФ, приготовленного в полярном (спирт-водные растворы) и неполярном (в вазелиновом масле) растворителях, на вязкостные свойства глубоколежащих (~ 20 А) и поверхностных (~ 8 А) областей ЭР in vitro.
Выяснение роли динамических характеристик воды в механизме полученных ранее эффектов «мнимых» (10"18-10"25 М) и сверхмалых (10'9-10' 18М) концентраций а-ТФ на структуру биологических мембран путем изучения различия на основе многомерного критерия Махаланобиса флуктуации показателей пропускания тонких слоев воды в 9 областях ИК-спектра: 3500-3200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см"1 в водно-спиртовых растворах а-ТФ в широком спектре концентраций (10"4— 10"25 М) по сравнению с соответствующими спиртовыми растворами в бидистиллированной деионизованной воде, взятыми в качестве эталонов.
Научная новизна.
Впервые показано, что природный АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М), включающем сверхмалые (10'9-10'18 М) и даже так называемые «мнимые» концентрации (<10'18 М), существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных регионов биологических мембран, выделенных из печени мышей. При этом зависимость эффекта от дозы водимого вещества имеет нелинейный полимодальный характер с максимумами в каждой из указанных областей и разделяющими их «мертвыми зонами», где эффект отсутствует.
Впервые обнаружено, что а-ТФ в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липид-ной компоненты, индуцирует появление дополнительного термоиндуциро-ванного структурного перехода липидов в области физиологических температур (307-314 К, 34-41 С).
Впервые установлено, что каждый из наблюдаемых максимумов на кривых доза-эффект обусловлен своим особым механизмом взаимодействия а-ТФ с биомембранами: в области «физиологических» концентраций (10"4-10" 7М) - ограничением при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипидов (ФЛ); в области
О 1Я
СМД (10" -10" М) - высокоэффективным специфическим взаимодействием со связывающими центрами на мембране (в частности, с пк-С), инициированием а-ТФ образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификацией уже имеющихся; в области «мнимых» концентраций а-ТФ (<10"18 М) - опосредованным влияние на мембрану через изменение структурно-динамических характеристик воды. В связи с этим впервые экспериментально установлено, что именно полярные свойства растворителя (воды) играют основную роль в механизме действия «мнимых» концентраций БАВ вообще и а-ТФ в частности.
Таким образом, вода представляет собой не только некую среду, в которой могут находиться молекулы действующего вещества, но и является активным участником происходящих в ней процессов «записи» и «передачи» информации о веществе в том или ином виде на пути к его мишени. Учитывая, что живые организмы состоят в основном из воды (по массе), полученные в данной работе сведения могут существенно дополнить имеющиеся представления о механизмах функционирования многих БАВ in vivo.
Научно-прикладное значение работы.
Изменение структурно-динамических характеристик биологических мембран может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях.
Обнаружение эффекта а-ТФ в СМД на структурное состояние липид-ной компоненты биологических мембран, являющейся одним из важнейших параметров системы регуляции ПОЛ, весьма существенно для возможного снижения терапевтической дозы а-ТФ при использовании его для коррекции ряда заболеваний, протекающих на фоне нарушения или изменения функционирования данной системы.
Апробация диссертационной работы.
Материалы работы докладывались на ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2002, 2004, 2005), XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), VI и VII Международных конференциях «Биоантиоксидант» (Москва, 2002, 2006), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XLVII Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва-Долгопрудный, 2004), First Dijon International Workshop on Lipids "Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders " (Dijon, France, 2005), 46-th International Conference on the Bioscience of Lipids (Ajaccio, Corsica, France, 2005), Всероссийской конференции молодых ученых и II школе им. академика Н.М. Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006), IV Международном Конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006), 4th Euro Fed Lipid Congress «Oils, Fats and Lipids for a Healthier Future» (Madrid, Spain, 2006).
Публикации.
Основные положения диссертационной работы опубликованы в 19 печатных работах (6 журнальных статьях и 13 тезисах докладов) и 2 статьи поданы в печать.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы. Работа изложена на 193 страницах, иллюстрирована 4 схемами, 50 рисунками и 6 таблицами. Библиография включает список из 288 работ.
Структурные и динамические особенности мембран и модификация их а-ТФ
На протяжении последних 30 лет жидкостно-мозаичная модель мембраны Зингера и Николсона [60] является основой для понимания структуры и динамики биологических мембран. В рамках этой модели мембрана представляется как текучий фосфолипидный бислой, в который погружены свободно диффундирующие белки. Белки и липиды являются основными компонентами биологических мембран. На долю углеводов может приходиться около 10% массы мембран, при этом они всегда входят в состав гликолипи-дов и гликопротеинов. Соотношение между белками и липидами в мембранах значительно варьирует - от 20% (по массе сухого вещества) белка в миелине до 80% в митохондриях. Наиболее поражает в мембранных липидах их огромное разнообразие. Любая конкретная мембрана может содержать более ста разных типов липидных молекул, относительное содержание которых зависит от вида мембраны. Существуют основные классы липидов (глицеро-фосфолипиды, сфингофосфолипиды, гликоглицеролипиды, гликосфинголи-пиды, стеролы), а также так называемые минорные компоненты (свободные ЖК, лизофосфолипиды, моноацил- и диацилглицеролы, полиизопреноидные липиды), присутствующие в мембране в малых количествах. Причины такого огромного числа разновидностей липидов выясняются, однако становится все более очевидным, что это, по-видимому, связано с тем разнообразием функций, которые они выполняют в мембранах [1,65,75]. Во-первых, обеспечение структурной организации и стабильности бислоя, в особенности сильно искривленных участков мембраны. Во-вторых, выполнение барьерной и транспортной функций. В частности, некоторые липиды способствуют образованию контакта между мембранами или связыванию определенных белков [61]. В-третьих, фундаментальная роль в передаче информации и регулировании метаболических процессов. Так, некоторые липиды являются важными биорегуляторами (фосфатидилинозитол) и вторичными посредниками (диа-цилглицерол), участвуют в реакциях биосинтеза (фосфатидилглицерол) и необходимы для поддержания оптимальной активности ряда ферментов (фос-фатидилсерин). Ганглиозиды, как полагают, играют важную роль в регуляции роста клеток, являются специфическими рецепторами в ПМ и ответственны за клеточную адгезию. В-четвертых, выполнение специфических функций, в частности, в качестве компонентов цепи электронного транспорта в мембранах (убихиноны и менахиноны).
Сочетание в молекуле липида полярного и неполярного компонентов, т.е. дифильность, обуславливает ее амфипатические свойства и, следовательно, способность к образованию мембран. Липидный бислой стабилизируется силами гидрофобного взаимодействия, способствующими образованию таких структур, в которых площадь контакта между водой и неполярными углеводородными цепями минимальна [62]. Важную роль играют также межмолекулярные взаимодействия в области полярных головок, в частности, гидратация и водородные связи [63], а также вандерваальсовы силы притяжения между соседними гидрофобными цепями.
Мембранные белки ответственны, как правило, за функциональную активность мембран. К ним относятся разнообразные ферменты, каналы, поры и т.д., которые обеспечивают уникальность функций каждой мембраны. В основе современных представлений о структуре мембранных белков лежит идея о том, что их полипептидная цепь уложена так, чтобы образовалась неполярная, гидрофобная поверхность, контактирующая с неполярной областью липидного бислоя. Полярные или заряженные домены белковой молекулы могут взаимодействовать с полярными головками липидов на поверхности бислоя. Различают четыре способа прикрепления белков к мембране [74]: (1) связывание с другими белками, погруженными в бислой; (2) связывание с поверхностью бислоя с помощью нековалентных взаимодействий -гидрофобных или электростатических сил; (3) связывание с помощью гидрофобного «якоря», в качестве которого может выступать ковалентно связанная с белком ЖК или ФЛ, либо гидрофобный домен; (4) трансмембранные белки, пересекающие бислой один или несколько раз. Обычно мембранные белки подразделяют на наружные (периферические) или внутренние (интегральные), причем различия между ними не задаются однозначно способом прикрепления к мембране, а определяются лишь относительной силой их связывания [60].
В отличие от модели Зингера-Николсона прежняя модель Дэвсона-Даниели была статичной. Детально изучить строение мембраны не представлялось возможным из-за ограничений оптического разрешения. В то же время начиная с 1970 г. большое внимание стало уделяться изучению динамических свойств и их взаимосвязи с мембранными функциями. В последние годы жидкостно-мозаичная модель мембраны Зингера-Николсона тоже подверглась модификации во многом благодаря разработке новых методов микроскопии, основанных на наблюдении движения отдельных молекул, что позволило преодолеть ограничения оптического разрешения и изучить динами ческое поведение отдельных липидов и белков с пространственным разрешением 7-40 нм. Стало ясно, что не все мембранные белки свободно диффундируют в жидком липи дном бислое [64]. Кроме того, имеются данные, что белки и липиды распределены в мембране вовсе не произвольно, а образуют неоднородности в виде микродоменов, имеющих огромное структурное и функциональное значение [65-67]. Различают несколько типов микродоменов.
Жидкие липидные домены составляют примерно несколько микрон в диаметре и занимают порядка 20-30% площади поверхности клеточной мембраны. Липидные рафты представляют отдельный, своеобразный класс доменов. Эти особые области в мембране значительно более упорядочены по сравнению со своим микроокружением из-за повышенного содержания холестерина, сфингомиелина и ганглиозидов, а также преимущественно насыщенного характера жирнокислотных цепей ФЛ. Средний диаметр рафтов составляет 50-100 нм, и они покрывают примерно 50% площади ПМ. В качестве одного из механизмов образования рафтов рассматривается пространственная несовместимость в жидко-кристаллической фазе между твердой сте-рольной структурой молекулы холестерина и жестким изгибом ненасыщенной углеводородной цепи соседней молекулы фософлипида, имеющей цис-двойную связь в положении С9-С10 [68]. Такая затрудненность во взаимной упаковке молекул приводит к выталкиванию холестерина из областей с ненасыщенными ФЛ, с последующей его концентрацией и стабилизацией в областях с преимущественно насыщенным характером жирнокислотных цепей ФЛ. Дальнейшая стабилизация происходит при локализации белков (рецепторов) в рафтах, благодаря чему среднее время их жизни составляет порядка 1 мс. Однако при связывании лигандов с рецепторами, вызывающее их активацию и олигомеризацию, среднее время жизни рафтов значительно увеличивается и может достигать нескольких минут. Вокруг таких образовавшихся рецепторных кластеров могут образовываться маленькие, но стабильные отдельные липидные рафты с локализованными в них белками [68].
Действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах на биологические мембраны
В настоящее время высказывается предположение, что природа общих закономерностей действия БАВ в СМД, о которых говорилось в разделе 1.2.1., может быть связана с общностью критических мишеней, например, клеточных и субклеточных мембран. Эта гипотеза обусловлена тем, что в ряде исследований, выполненных в том числе и в нашей лаборатории, обнаруживалось, что при введении СМД БАВ в организм животного, клеточную культуру или в модельную систему, содержащую суспензию мембран, происходит изменение структурных характеристик липидного бислоя мембран. В свою очередь, структура мембраны является одним из важнейших параметров регуляторной системы ПОЛ, и ее изменение будет влиять на активность мембранно-связанных ферментов, многие из которых являются компонентами важнейших регуляторных систем клетки (ПОЛ, циклы вторичных посредников). Наличие же полимодальности в ответе можно, по-видимому, объяснить сменой доминирующего механизма действия вещества в том или ином концентрационном интервале на структуру мембраны.
Для выяснения вопроса о взаимосвязи систем циклических нуклеоти-дов, фосфоинозитидного цикла и параметров ПОЛ исследовалось влияние специфических модификаторов первых двух систем на отдельные звенья системы ПОЛ. Так, в работе [161] было показано, что опухолевый промотор, модификатор систем вторичных посредников, 12-О-тетрадеканоилфорбоил-13-ацетата (ТФА) в широком спектре концентраций вплоть до супермалых доз (10"9-10"15 М) увеличивает микровязкость поверхностных слоев липидов и уменьшает ее в глубоколежащих гидрофобных областях in vitro. При этом максимальный эффект наблюдался в диапазоне низких концентраций ТФА (10"10-10"15М). Исследования проводились на микросомальных и плазматических мембранах клеток печени и мозга мышей. Скорее всего, изменения микровязкости липидов не является прямым следствием рецепторного акта (известно, что рецепторами ТФА являются молекулы пк-С), поскольку количество рецепторов ТФА существенно различается как в плазматических мембранах по сравнению с микросомальными, так и в головном мозге по сравнению с печенью. Экстраполируя выводы работы [230] на реальные ПМ и клетки с учетом полученных данных, высказывается предположение о роли ТФА в активации пк-С. Модификация структуры мембраны под действием ТФА может влиять на специфический акт непосредственного связывания с ферментом двойственным образом: увеличение жесткости поверхностных областей липидов способствует созданию конформационной структуры мем-бранно-связанной пк-С, благоприятной для взаимодействия с лигандом, субстратом и активатором. Уменьшение вязкости гидрофобных областей липидов, облегчающее связывание цитозольной пк-С с мембраной, приводит к увеличению числа рецепторов в мембране и возрастанию общей активности фермента. Делается вывод о том, что, возможно, неспецифические изменения лежат в основе взаимосвязи систем вторичных посредников.
Исследования по сравнительному изучению действия форболового эфира в трех концентрациях (10"?, 10"11 и 10"14М) [231] на культуру опухолевых клеток Krebs 11 показали, что параметр тс, характеризующий микровязкость липидов мембран ЭР в области локализации поверхностного зонда (глубина погружения не более 4А), существенно изменяется при действии всех изученных концентраций ТФА, однако наибольший эффект (увеличение в 5 и более раз) отмечен для наименьшей концентрации ТФА. Кроме того, при действии этой концентрации зафиксированы наибольшие сдвиги в температуре термоиндуцированных структурных переходов (на 4 и 8С по сравнению с контролем) и уменьшение энергии активации этих переходов в 4 раза.
Изучалось действие азидотимидина и фактора активности тромбоцитов на мембрану тромбоцита в диапазоне концентраций от 10"15 М до 10"4 М. Показано, что применение малых доз веществ приводит к термостабилизации белкового компонента мембраны, а больших - к дестабилизации последнего [232].
В настоящее время проблема действия СМД БАВ настолько актуальна, что разрабатываются методологические основы обнаружения повреждающего воздействия СМД физиологически активных веществ (ФАВ). В работе [233] обнаружение эффектов воздействия ФАВ на клетки крови проводили в двух направлениях: выявление признаков повреждения структуры клеточных мембран и изучение влияния веществ на функциональные свойства клетки. О повреждении структуры клеточных мембран под влиянием внешних факторов судили по таким признакам, как структурные перестройки липидного бислоя мембраны, конформационное состояние мембранных белков, изменения липидного состава и проницаемости мембран. Так как в состав клеточных мембран эритроцитов входят М-холинорецептор и ацетилхолинэстераза, то в качестве химических агентов, повреждающих мембраны клеток крови человека, были выбраны: 1. блокаторы М - холинорецепторов - 3-хинуклидилбензилат и его аналоги; 2. ингибиторы ацетилхолинэстеразы - фосфорорганические ингибиторы, в частности тиохолинфосфонат, и производные 6-метилурацила (вещества К-1ДС-2ДС-4) 3. фосфолипиды - вещества типа факторов активации тромбоцитов.
Результаты ЭПР - спектроскопических исследований мембран эритроцитов и тромбоцитов, инкубированных с растворами ФАВ, отчетливо свидетельствуют о структурных перестройках в липидной области мембраны. Так, в случае 3-хинуклидилбензилата наблюдается увеличение показателя жесткости мембраны эритроцита, т.е. она становится более структурированной и упорядоченной, в то время как под воздействием фактора активации тромбоцитов показатель жесткости мембраны эритроцита уменьшается. При этом концентрационные кривые имеют поли- и бимодальный характер, так что изменения структуры клетки фиксируются уже при сверхмалой концентрации действующего вещества - 10"15М. Похожие изменения обнаружены при изучении воздействия ФАВ на микровязкость мембраны эритроцитов, причем соответствующие дозовые зависимости сохраняют полимодальный вид.
Предполагается, что наблюдаемые изменения жесткости и микровязкости мембраны клетки обусловлены взаимодействием 3-хинуклидилбензилата с М-холинорецептором эритроцитов, о чем свидетельствует чувствительность отклика мембраны на стереоизомерию вещества. Кроме изменений в микровязкости и жесткости липидной компоненты были обнаружены существенные сдвиги в термоиндуцированных структурных переходах, вызванных действием тиохолинфосфаната.
Аналогичные исследования структурного состояния мембраны тромбоцита под воздействием изучаемых ФАВ показали, что все изучаемые вещества разупорядочивают мембрану, снижая ее жесткость, о чем свидетельствуют отрицательные отклонения параметра жесткости мембраны от контроля.
Применение метода спинового зонда для изучения структурно-динамического состояния микросомальных и плазматических мембран
В настоящее время метод спиновых зондов и меток хорошо развит и активно применяется для изучения структуры и свойств конденсированных сред [241,242], характерными представителями которых являются модельные и биологические мембраны [243-245].
В основе метода лежит анализ по спектрам ЭПР вращательной подвижности парамагнитных частиц - стабильных нитроксильных радикалов (сокращенно нитроксилов), которая, в свою очередь, определяется структурно-динамическим состоянием их микроокружения в исследуемой среде. В отличие от спиновых меток, ковалентно связывающихся с макромолекулами, спиновые зонды на основе ЖК внедряются в мембрану в качестве низкомолекулярных добавок, не приводя к существенному изменению ее свойств при соотношении зонд: липид менее 1:100 [246,247].
Характерной особенностью нитроксилов, позволяющей использовать их в качестве спиновых зондов, является наличие нитроксильной группы N-0, имеющей неспаренный электрон и экранированной метальными группами, обуславливающими стабильность радикала. Неспаренный электрон локализуется преимущественно у ядра азота, чем и обусловлен триплетный характер спектров ЭПР нитроксилов (IN = 1), однако в зависимости от полярности растворителя относительный вклад структур А и В, изображенных на рисунке 3, может меняться [248].
Неспаренный электрон в нитроксилах находится на 2рл-орбитали и, следовательно, имеет в точке ядра азота нулевую плотность. Электрон-ядерное взаимодействие в такой системе осуществляется по диполь-дипольному механизму и является анизотропным. Следует отметить, также, что в волновой функции имеется примесь s-состояния (конфигурационное взаимодействие), которое приводит к изотропному контактному взаимодействию неспаренного электрона с ядром. Таким образом, растворители, стабилизирующие структуру В и увеличивающие спиновую плотность на азоте, будут характеризоваться большим значением изотропной константы сверхтонкого взаимодействия (СТВ) Аиз0.
В данной работе в качестве параметров, отражающих структурное динамическое состояние изучаемых мембран, были рассмотрены: вязкостные характеристики при постоянной температуре 293 К, такие как: о жесткость поверхностных областей липидов ( 8А); о микровязкость глубоколежащих областей липидов ( 20А) термоиндуцированные структурные перестройки («переходы») в липидах мембраны и эффективная энергия их активации в глубоколежащих областях липидного бислоя.
В наших экспериментах в качестве спинового зонда для изучения жесткости поверхностных областей ( 8А) липидного бислоя применялся стабильный нитроксильный радикал 5-доксилстеариновая кислота (зонд Cs) (рис. 4а), а для изучения микровязкости глубоколежащих областей ( 20А) -16-доксилстеариновая кислота (зонд Сіб) (рис. 46). Зонды Cs и Сіб фирмы «Sigma» исходно представляли собой кристаллический порошок желтого цвета, который затем растворялся в спирте до концентрации 10"2М. Оптимальная концентрация зонда для введения в мембранную суспензию определялась по выходу искомого параметра на плато, так что в итоге она не превышала 6 10 5 М. Встраивание зонда осуществлялось за время, не превышающее 15 минут.
Эксперименты при постоянной температуре 293 К проводились следующим образом (схема 4). Размораживалась пробирка с исходной суспензи ей микросомальных или плазматических мембран, из которой одновременно готовились вначале две одинаковые пробы, содержащие 200 мкл мембранной суспензии и 1,3 мкл зонда Cs или С\в- В первую пробу, которую будем называть контрольной, вводилось 3,3 мкл соответствующего растворителя а-ТФ (водно-спиртовой раствор или вазелиновое масло), и после 15 минутной инкубации при комнатной температуре осуществлялась запись спектров ЭПР в заданных условиях (табл. 2) в течение 20-30 минут при температуре 293 К. Затем во вторую пробу, которую назовем опытной и которая до этого инкубировалась при комнатной температуре, вводилось 3,3 мкл раствора а-ТФ в соответствующей концентрации. После 15 минутной инкубации при комнатной температуре снимались показания ЭПР-спектрометра при тех же условиях, что и в контроле, в течение 60-70 минут. Время инкубации выбирали, руководствуясь тем, чтобы все переходные процессы в мембранной суспензии пришли к равновесию, а искомые параметры достигли стационарных значений.
Влияние а-ТФ на структурное состояние поверхностных областей микросомальных мембран клеток печени мышей in vitro
Жесткость липидного бислоя в области локализации зонда С5 ( 8А) характеризовалась величиной максимального расщепления на спектре ЭПР 2Амакс (рис. 5а и 56), которая пропорциональна параметру упорядоченности S [243], зависящему от амплитуды вращательного движения длинной оси спинового зонда, встроенного в упорядоченные области липидного бислоя. При S — 1 амплитуда отклонения большой оси эллипсоида вращения зонда от среднего направления ориентации окружающих молекул липидов минимальна, а упорядоченность системы максимальна; при S —» 0 - упорядоченность минимальна, а угол отклонения длинной оси максимален.
Искомое значение параметра 2Амакс в опыте и контроле определялось после достижения им стационарного значения (во всех экспериментах необходимое для этого время не превышало инкубации в течение 15 минут). На рис. 18 представлен типичный график, описывающий изменение во времени параметра 2Амакс зонда С5 на примере действия сс-ТФ в концентрации 5 10"5 М.
Для каждой концентрации а-ТФ было произведено от 3 до 5 параллельных измерений на мембранах, выделенных независимо друг от друга в различные времена года. Относительная случайная ошибка определения среднего значения 2Амакс не превышала 0,1%, а относительная систематическая составила 1%. Статистическая обработка данных производилась параметрическими и непараметрическими методами в программной среде Microsoft Office Excel. Эффект каждой концентрации а-ТФ на величину максимального расщепления 2Амакс на спектре ЭПР зонда Сіб в микросомальных мембранах при температуре 293 К выражался в процентах по отношению к контролю (34), и данные о них представлены на рис. 19.
Как видно из данных рис. 19, действие а-ТФ в «физиологических» концентрациях (10"4, 5 10"5 и 10"5 М), в которых он обычно действует в организме, вызывает статистически достоверное увеличение параметра 2Амакс, что говорит о возрастании жесткости поверхностных областей липидного бислоя мембран ЭР. Максимальный эффект (-3,7 %) наблюдается при действии самой большой из вводимых концентраций а-ТФ - 10"4М, дальнейшее снижение которой приводит к резкому, практически линейному уменьшению величины эффекта, достигающей нулевого значения при 10 6 М а-ТФ и не меняющейся вплоть до 10" М. Эта область отсутствия достоверных эффектов на дозовой кривой (10"6-10" М) называется «мертвой зоной». На смену ей приходит область влияния сверхнизких концентраций а-ТФ 10, 10 12, 10"13, 10"1 и 10"15 М, все эффекты которых хоть и направлены в сторону увеличения жесткости липидного бислоя, однако максимальный эффект (-1,1 %) при 10"13 и 10 14 М а-ТФ в 3 раза ниже, чем при «физиологической» концентрации 10"4 M. Действие еще более низких доз а-ТФ 10"16-10"19М не сопровождается достоверными изменениями 2Амтс, что говорит об образовании очередной «мертвой зоны» на дозовой кривой на рис. 19. Однако введение а-ТФ в так называемых «мнимых» концентрациях 10" , 10" и 10" М, при которых вероятность содержания хотя бы одной молекулы а-ТФ в мембранной суспензии близка к нулю, вызывает достоверное увеличение ( 1 %) жесткости мембраны, причем этот эффект сопоставим с изменениями, происходящими при действии а-ТФ в СМД (10"13 и 10"14М). Доза 10"20 М уникальна в том смысле, что изменения, вызванные ее введением, направлены в сторону уменьшения жесткости липидов ( 1,6%), чего не наблюдается при действии а-ТФ ни в какой-либо другой дозе изученного диапазона. Дальнейшее уменьшение концентрации вводимого а-ТФ до 10"23-10"25М не вызывает достоверных изменений жесткости поверхностных областей мембраны ЭР.
Таким образом, а-ТФ при температуре 293 К в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М), за исключением 10 20М, стабилизирует поверхностные области мембраны ЭР, увеличивая жесткость ее липидного бислоя. При этом дозовая зависимость эффекта имеет полимодальный характер, где максимумы и минимумы, разделенные «мертвыми зонами» с отсутствием достоверных изменений, наблюдаются в трех интервалах доз - области традиционных «физиологических» концентраций а-ТФ (10 4-10"9М), СМД (10"9-10"18М) и «мнимых» концентраций (10"18-10"25М).
Как уже упоминалось в разделе 3.1.1 для тс, изменение вязкостной характеристики липидного бислоя при постоянной температуре не является единственным критерием изменений, происходящих в структуре мембраны. Еще одним важным ее параметром являются представления о термоиндуци-рованных структурных перестройках («переходах») в липидах, информацию о которых в поверхностных областях липидного бислоя можно получить, анализируя температурные зависимости параметра упорядоченности S зонда С5 в соответствии с методикой, приведенной в разделе 2.4.2.
