Содержание к диссертации
Глава I. ВВЕДЕНИЕ 6
I» Актуальность темы б
2. Цели и задачи исследования 7
3. Научная новизна 9
4. Научная и практическая значимость 10
Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1. Методы дифференциации сестринских хроматид (ДСХ) и выявление GX0 12
1.1. Метод авторадиографии 12
1.2. Дифференциальная окраска галогензвмещенных сестринских хроматид 12
1.3.. Механизмы дифференциальной окраски сестринских хроматид 16
1.4. Другие методы обнаружения СХО 17
1.5. Выявление СХО, образовавшихся в разных циклах 17
2. Данные о структуре и механизме репликации хромосом,
полученные с помощью ДСХ и анализа СХО 18
2.1. Данные, полученные с использованием метода авто радиографии 18
2.1.1. Полуконсервативное удвоение хромосом 18
2.1.2. Соотношение частот одиночных и близнецовых СХО 19
2.1.3. Изометки 20
2.1.4. Неслучайное распределение старого и нового генетического материала 21
2.2. Данные, полученные с использованием метода дифференциальной окраски
2.2.1. Соотношение частот СХО, сформировавшихся в разных циклах 21
2.2.2. Изоокрашивание (изометки) 23
2.2.3. Неслучайное распределение генетического материала 24
2.2.4. Существование участков со встречной полярностью 25
2.2.5. Распределение СХО по длине хромосом и по клеткам , 25
3. Природа СХО 26
3.1. Спонтанный уровень СХО , 26
3.1.1. Спонтанный уровень и индукция СХО % тимидином 27
3.1.2. Спонтанный уровень и индукция СХО 5-БДУ 27
3.1.2.1. Экстраполяция кривой зависимости частоты СХО от концентрации 5-БДУ 28
3.1.2.2. Определение спонтанного уровня из частот СХО, сформировавшихся в разных циклах 29
3.2. Первичные повреждения, лежащие в основе СХО 31
3.2.1. Алкилирование ДНК , 31
3.2.2. Пиримидиновые димеры 32
3.2.3. Однонитевые разрывы 33
3.2.4. Отдаленные эффекты при индукции СХО 33
3.3. Биологический смысл СХО 34
4. СХО как тест-система на мутагенную активность 35
5. Исследование механизмов радиационного поражения клеток с помощью метода дифференциальной окраски - 4 Стр.
5.1. Сенсибилизирующее действие 5-БДУ 37
5.2. Влияние радиации на выход СХО 41
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИ 48
1. Объект исследования , 48
2. Культивирование клеток и приготовление препаратов 48
3. Дифференциальная окраска препаратов 49
4. Используемые виды излучения и дозиметрия 49
5. Метод учета структурных изменений хромосом и статистические методы 51
Глава 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ 52
1. Выявление одиночных и близнецовых СХО 52
1.1. Культивирование клеток 53
1.2. Гипотонизация и фиксация 56
1.3. Дифференциальная окраска препаратов 56
1.4. Эффективность метода непосредственной фиксации клеток на ростовой поверхности 57
2. Оценка числа ложных близнецовых СХО в сестринских клетках 59
3. Сохранение пространственной ориентации хромосом в процессе деления клеток 67
3.1. Логическое обоснование эксперимента 67
3.2. Экспериментальные данные 71
3.3. Следствия из неслучайного распределения генетического материала 72
4. Перспективы использования метода фиксации клеток
на ростовой поверхности - 5 Стр.
5. Зависимость выхода СХО от концентрации 5-БДУ и спонтанный уровень СХО 75
6. Индукция СХО радиацией разных энергий 81
7. Радио-чувствительность хроматид, содержащих две или одну включившие 5-БДУ полинуклеотидные цепи 86
8. Влияние 5-БДУ на абсолютное и относительное изменение числа СХО 90
Глава 5. ЗАКДТНЕНИЕ 95
ВЫВОДЫ 101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1
Введение к работе
Структурные изменения хромосом являются важным показателем степени поражения клеток мутагенами и канцерогенами. До недавнего времени исследовали почти исключительно аберрации хромосом-структурные изменения, многие из которых приводят к репродуктивной гибели клеток /Н.В.Лучник, I968;Tremp,I98I; Nagasawa, Little , 1981). Появление в середине 70-х годов методики дифференциальной окраски 5-бромдезоксиуридин (5-БДУ)-замещенных сестринских хроматид /Wolff , Perry, 1974/ открыло возможности для выявления с болыюй точностью реципрокных обменов между сестринскими хроматидами (СХО) - структурных изменений, не нарушающих морфологических признаков хромосом и связанных с нелетальной реакцией клеток на действие мутагенов /Nagasawa , Little, 1981/. Методика обнаружения СХО оказалась сравнительно простой и нетрудоемкой, что способствовало быстрому росту числа работ, посвященных изучению этого феномена. В исследованиях влияния химических мутагенов на индукцию структурных изменений хромосом было обнаружено, что действие этих веществ вызывает большее увеличение частоты СХО по сравнению с аберрациями, а при действии радиации происходит более значительное увеличение выхода аберраций по сравнению с GX0 /Perry , Evans, 1975/. Поскольку выход СХО оказался значительно более высоким при действии химических агентов по сравнению с радиацией, исследований индукции СХО при действии на клетки радиации почти не проводили. Достаточно сказать, что к началу настоящего исследования существовало всего две работы о влиянии радиации на выход СХО /perry , Evans, 1975; Solomon, Bobrov , 1975/, содержащих небольшой материал. Однако СХО являются одним из эффектов радиации и тот факт, что радиация относительно слабо индуцирует СХО, не может служить основанием для игнорирования этого направления исследований. Закономерности образования СХО представляют значительный интерес для радиобиологии, с одной стороны, поскольку способствуют формированию более полной картины действия радиации на клетку, с другой стороны, информация о строении хромосом, получаемая на основе анализа СХО, может в значительной степени прояснить радиационные механизмы образования других структурных изменений. Кроме того, применяемый для выявления СХО метод дифференциальной окраски может быть непосредственно использован для выяснения механизмов индукции аберраций хромосом при действии радиации, поскольку позволяет отличать дифференциально-меченный 5-БДУ генетический материал и исследовать относительную радио-чувствительность разнозамешенного генетического материала с большой точностью при эквивалентных условиях облучения» Как уже отмечалось, аберрации хромосом и СХО имеют разное значение для последующей судьбы клеток и, кроме того, считают, что механизм их образования различен /Latt , 1981/, поэтому параллельное исследование этих структурных изменений может дать информацию как о сходстве и различии первичных изменений, лежащих в основе СХО и аберраций, так и о возможных путях реализации этих первичных повреждений
