Содержание к диссертации
Введение
CLASS Глава 1. Обзор литературы 1 CLASS 2
1.1. Трофические язвы и длительно незаживающие раны 12
1.2. Препараты, применяющиеся для лечения ран и трофических язв . 13
1.3. Патогенез образования патологических рубцов кожи 18
1.4. Классификация рубцов кожи 29
1.5. Современные подходы к профилактике и лечению патологических кожных рубцов 33
CLASS Глава 2. Материалы и методики исследования 3 CLASS 7
2.1. Материалы и методы экспериментальных исследований 37
2.1.1. Биохимические исследования 37
2.1.1.1. Исследуемые препараты 37
2.1.1.2. Методика определения коллагенолитической активности протеаз 38
2.1.1.3. Метод определения амилолитической активности по Каравею 41
2.2. Эксперименты, выполненные на животных 44
2.2.1.. Методики проведения экспериментальных исследований 45
2.2.1.1. Моделирование длительно незаживающей раны 45
2.2.1.2. Изучение влияния ферментов на заживление ран, образовавшихся после срезания расщепленных лоскутов кожи 45
2.2.1.3. Изучение влияния ферментов на заживление полнослойных кожных ран 47
2.2.1.4. Применение коллагеназы для отторжения ожогового струпа 49
2.3. Цитологические исследования 50
2.4. Изменение уровней микробного обсеменения в ранах 52
2.5. Материал и методы клинических исследований 53
2.5.1. Анализ лечения больных с ранами кожи 53
2.5.1.1. Характеристика клинического материала 53
2.5.1.2. Методы лечения больных с ранами кожи 55
2.5.1.3. Оценка состояния ран 56
2.5.1.4. Оценка удобства использования препаратов 57
2.5.1.5. Оценка побочных эффектов 58
2.5.2. Анализ лечения рубцов кожи 58
2.5.2.1. Характеристика клинического материала 58
2.5.2.2. Методы лечения больных с рубцами кожи 60
2.5.2.3. Оценка состояния рубцов кожи 60
2.6. Статистическая обработка результатов 62
Глава 3. Применение препаратов коллагеназы для лечения длительно незаживающих ран кожи 63
3.1. Результаты экспериментов на животных 63
3.1.1. Влияние препаратов коллагеназы на отторжение ожогового струпа . 63
3.1.2. Влияние ферментов на отторжение струпа и заживление длительно незаживающей раны 64
3.1.3. Влияние ферментов на заживление ран, образовавшихся после срезания расщепленных лоскутов кожи 64
3.1.4. Результаты лечения полнослойных кожных ран 65
3.2. Оценка клинической эффективности лечения ран, трофических язв кожи препаратами «Колладиасорб» и «Ируксол» 66
Глава 4. Применение препаратов коллагеназы для лечения патологических рубцов кожи 82
4.1. Результаты определения коллагенолитической и амилолитической активности протеаз 82
4.2. Влияние разных основ лекарственных форм на коллагенолитическую активность ферментов 86
4.3. Отработка методики контроля состояния рубцов кожи 89
4.4. Результаты клинических наблюдений при лечении патологических рубцов кожи препаратом «Поликоллагеназа-К» 93
Заключение 102
Выводы 108
Практические рекомендации 109
Список литературы по
- Трофические язвы и длительно незаживающие раны
- Материалы и методы экспериментальных исследований
- Влияние препаратов коллагеназы на отторжение ожогового струпа
- Результаты определения коллагенолитической и амилолитической активности протеаз
Введение к работе
Лечение ран относится к числу наиболее древних, но не стареющих проблем практической хирургии. Несмотря на обилие препаратов для местного лечения ожогов и ран, совершенствование методов их лечения по-прежнему остается актуальной задачей [Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990; Парамонов Б.А. и др., 2000]. В настоящее время 35-49% больных хирургического профиля составляют пациенты с гнойно-воспалительными заболеваниями [Даценко Б.М., 1995]. По данным- Министерства здравоохранения Российской Федерации, пациенты отделений гнойной хирургии составляют 5-7% от всех больных. Послеоперационные осложнения у плановых больных составляют около 1% всех оперируемых случаев. Пациенты с трофическими язвами и длительно незаживающими ранами составляют до 1,5% от всего населения, 10% от числа всех больных общехирургических стационаров [Савельев B.G., 1972].
К настоящему времени для терапии ран, ожогов и трофических язв предложено большое количество (более 1000) препаратов и методов лечения [Гостищев В.К. и др., 1996; Машковский М.Д., 2000; Парамонов Б.А. и др., 2000]. Расширение познаний о закономерностях заживления ран привело к тому, что их лечение стали проводить дифференцированно в зависимости от глубины поражения, стадии раневого процесса, локализации поражения и от ряда других факторов [Камаев М.Ф., 1989]. При этом, используются медикаментозные препараты с различным механизмом действия. Весьма важной задачей в лечении является активация отторжения некротических тканей, адсорбция токсического отделяемого раны, т.е. продуктов микробного и тканевого распада [Даценко Б.М., 1995]. Для этого целесообразно применять препараты, обладающие протеолитической активностью и сорбенты [Парамонов Б.А. и др., 2000]. В связи с тем, что коллаген в коже и других тканях представлен широко, применение ферментов с коллагенолитической активностью является обоснованным. В настоящее время наиболее широко известен препарат «Ируксол», в состав которого входит коллагеназа, получаемая из продуктов жизнедеятельности клостридий [Машковский М.Д., 2000].
Другой важной сферой применения коллагеназ является лечение патологических рубцов кожи [Парамонов Б.А. и др., 2000]. Патологические рубцы кожи возникают после ожогов и травм, а также после выполнения плановых операций [Дельвиг А.А., 1995; Малыхина Т.В., 2000; Логвинов СВ. и др., 2004; Litoux P. et al, 1986; Norris J.E., 1991; Warwick D.J, Dickson W.A., 1993]. Располагаясь на открытых участках кожи, а особенно на лице, шее, груди, патологические рубцы не только обезображивают человека, но и приводят к деформациям различных органов, что часто сопровождается нарушениями их функции, а также неприятными ощущениями [Вихриев Б.С, Бурмистров В.М., 1986; Юденич В.В, Гришкевич В.М, 1986; Озерская О.С, 2002; Логвинов СВ. и др, 2004]. Выраженность развивающихся деформаций зависит от длительности существования ран [Boecxk W. et al, 1990]. У таких пациентов существенно снижается качество жизни. В ряде случаев возникновение грубых рубцов приводит к инвалидизации и к развитию нервно-психических расстройств, вплоть до случаев тяжелой- депрессии [Лосицкая В.М, Бурьянов А.А, 1987;. Озерская О.С, 2002; Simmons D.A, 1996].
В связи с этим разработка и совершенствование методов лечения ран и патологических рубцов кожи является актуальной задачей.
Целью исследования является совершенствование методов лечения ран и; патологических рубцов кожи применением препаратов, обладающих коллагенолитической активностью.
Для достижения поставленной цели исследования были определены
следующие задачи:
1. В опытах in vitro провести сравнительную оценку коллагенолитической активности ряда протеаз.
2. Провести комплексное исследование влияния коллагеназы на течение раневого процесса и изучить клиническую эффективность раневого сорбента «Колладиосорб» и мази «Ируксол» при лечении трофических язв и ран.
3. Изучить изменения водного баланса в ткани рубцов кожи в процессе лечения препаратами коллагеназы методом KB Ч-диэлектрометрии.
4. Определить эффективность применения препаратов коллагеназы при лечении патологических рубцов кожи.
Научная новизна
1. В опытах in vitro изучены биохимические особенности действия коллагеназ различного происхождения.
2. Впервые проведена комплексная оценка влияния коллагеназ на течение раневого процесса.
3. В ходе клинических исследований изучены изменения водного баланса рубцовой ткани при воздействии коллагеназ.
Практическая ценность
1. Обоснованы показания к применению и способы применения препарата «Колладиосорб».
2. Определены показания к применению, дозировки и способы введения препаратов коллагеназы при лечении патологических рубцов кожи.
3. Установлены физические критерии эффективности проведения противорубцовой терапии.
Положения, выносимые на защиту
1. Для оценки in vitro коллагенолитической активности протеаз следует использовать методы, характеризующие интенсивность и полноту гидролиза.
2. Для лечения ран и трофических язв в I стадию раневого процесса целесообразно применять комплексные препараты, включающие коллагеназу («Колласорб», «Колладиосорб»), обеспечивающие сорбцию раневого экссудата и очистку ран от омертвевших тканей.
3. Введение в ткань патологических рубцов кожи препаратов коллагеназы приводит к разрушению избыточного коллагена и изменению соотношения в ткани белков и гликозаминогликанов, что проявляется увеличением доли структурированной («связанной») воды в ткани.
Личное участие автора в получении результатов
Личное участие автора в исследовании выразилось в определении основной идеи исследования, выработке единой методологии его вьшолнения за весть период исследовательских работ, в проведении экспериментальных и клинических исследований, статистической обработке материала и анализе результатов.
Апробация работы
Основные результаты диссертации доложены на YIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием по проблемам термических поражений (Нижний Новгород, 2004) и Международном хирургическом конгрессе «Новые технологии в хирургии (Ростов-на-Дону, 2005).
Трофические язвы и длительно незаживающие раны
Лечение ран является одной из главных проблем хирургии. Раны возникают в результате травмы, в ходе оперативных вмешательств. Отдельную проблему составляют длительно существующие раны, которые возникают в результате сосудистых нарушений и заболеваний, связанных с нарушениями обмена [Кузин М.И., Костюченок Б.А., 1990].
Пациенты с трофическими язвами различного генеза являются постоянными, порой пожизненными, посетителями поликлиник и хирургических отделений, составляя не менее 10% от числа всех больных общехирургических стационаров [Савельев B.C. и др., 1972].
Так, еще в 1954 г. S.Anning с соавторами указывал, что частота возникновения трофических язв составляет 4—5 на 1000 человек населения. Наиболее частой причиной, приводящей к развитию язв, являются весьма распространенные заболевания вен, которые встречаются у 15-20% взрослого населения. Трофические язвы могут также возникать и в других случаях: при облитерирующем эндартериите, диабетических ангиопатиях, после термических и химических ожогов, отморожений, лучевых поражений, после травм и различных заболеваний головного и спинного мозга, периферических нервов, на фоне общих заболеваний (коллагенозов, болезней обмена веществ, хронических интоксикаций, і болезнях крови и кроветворных органов и других). Как правило, патогенез трофических язв и длительно незаживающих ран сложен и включает несколько компонентов. Лечение длительно незаживающих ран преследует следующие задачи: 1) подавление инфекции в ране; 2) улучшение регионального (локального) кровообращения; 3) активацию отторжения некротических тканей; 4) адсорбцию отделяемого раны; 5) активацию обменных процессов в тканях; 6) стимуляцию репаративных процессов в ранах, в т.ч. рост грануляционной ткани и краевой эпителизации; 7) защиту растущих грануляций и неокрепшего эпителия от механической травмы и от высушивания.
В лечении такого рода ран и трофических язв до настоящего времени остается немало проблем. В повседневной клинической практике, особенно в поликлинике, врачи далеко не всегда добиваются заживления язв. Многим больным в связи с «бесперспективностью лечения» вообще отказывают в госпитализации в хирургические стационары, обрекая их на многолетние мучения и лечение в домашних условиях. Еще в 1982 году В.Л. Лукич и Л.С. Соскин указали на 30 основных методов (хирургических, медикаментозных, физиотерапевтических) лечения трофических язв. Это перечень включает многочисленные хирургические методы (операции по Линтону, Коккету, Фельдеру и др. с модификациями и дополнениями), разнообразное физиотерапевтическое лечение (магнитотерапию, ультразвук, лазеротерапию, магнито-лазерную терапию, иглорефлексотерапию, лекарственный электрофорез, оксигено-озонотерапию в различных вариантах исполнения, баротерапию, гипербарическую оксигенацию, криотерапию, вакуум - терапию, лечение в гнотобиологических установках и другие).
Препараты, применяющиеся для лечения ран и трофических язв
История лечения ран и ожогов уходит своими корнями в глубину веков. С этой целью применяли множество самых разнообразных веществ, количество которых на настоящий момент превышает 1000 [Кузин М.И., Костюченок Б.А., 1990].
В условиях специализированных стационаров лечение ожогов и ран проводят дифференцированно в зависимости от глубины поражения, стадии раневого процесса, локализации поражения и от ряда других факторов [Камаев М.Ф., 1979]. При этом последовательно используются медикаментозные препараты с различным механизмом действия [Пекарский Д.Е., 1981]. Качественный состав лекарственных форм, применяемых в лечении ран, определяется характеристиками раневого процесса (фазы, выраженности воспалительных изменений, особенностями экссудата, наличием некротических тканей), состоянием иммунитета [Monafo W., Freedman В., 1987]. По мнению М.И. Кузина и соавт. (1990), в течении раневого процесса можно выделить 3 фазы. Лекарственные средства, применяемые в I фазе (воспаления, экссудации), должны оказывать антимикробное, дегидратирующее, некролитическое и, по возможности, обезболивающее действие, т.е. способствовать подавлению микрофлоры и скорейшему очищению раны, создавая тем самым условия для последующей репарации. Местное лечение раны во второй фазе раневого процесса (регенерации) преследует цели стимуляции репаративных процессов в ране (рост грануляций, ускорение эпителизации) в сочетании с защитой раны от вторичной инфекции, подавлением вегетирующей в ране микрофлоры, противовоспалительным действием, улучшением регионарной перфузии и обменных процессов в ране [Ляпунов Н.А. и др., 1991,1995]. В Ш фазе - фазе организации рубца и эпителизации местное лечение ран должно быть направлено на завершение заживления ран и дифференцировки эпидермиса.
Материалы и методы экспериментальных исследований
Для оценки активности ферментов были использованы следующие препараты: 1) «Коллагеназа-КК» 250 ЕД, в ампуле от 200 до 300 ЕД. серия 11654317, выпуска X - 2003 г., годен до XI - 2005 г., производитель ТИБОХ ДВО РАН г. Владивосток. Молекулярная масса 560 - 830 кДа. 2) «Поликоллагеназа-К» 250 ЕД, в флаконе от 200 до 300 ЕД, серия 013256041, выпуска I - 2004 г., годен до I - 2005 г., производитель «С-Пб-Технология» г. Санкт-Петербург. Представляет собой смесь из 9 коллагеназ с молекулярной массой от 19 до 32 кДа; 3) «Коллагеназа», произведенная Clostridium hystoiiticum, серия DC 100654036, выпуска Ш - 2003 г., годен до Ш - 2005 г., производитель «Алтай-витамины» г. Екатеринург; 4) препарат «Коллализин», серия VI-10156022, выпуск X - 2003 г., годен до X - 2005 г., производитель «Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» г. Санкт-Петербург. Молекулярная масса 560 - 930 кДа [Машковский М.Д., 2000]. 5) новый препарат «Коллагеназа очищенная для косметологии», произведенная из гепатопанкреаса кальмара (называемая в последующем «Коллагеназа — X»), выпуск ГХ — 2003 г., производитель «С-Пб-Технология» г. Санкт-Петербург. 6) Сорбент раневой дренирующий биологически активный «Колладиосорб», выпуска П - 2002 г., годен до П - 2005 г., производитель «Росми», Москва. Представляет собой порошкообразное перевязочное средство на основе сшитого поливинилового спирта с включением в его структуру лекарственных препаратов - протеолитического фермента коллагеназы из гидробионтов и антисептического препарата диоксидина. 7) мазь «Ируксол», серия 028014, выпуск I - 2004 г., годен до I - 2009 г., производитель АО «ПЛИВА» Загреб, Хорватия. В состав мази входит фермент клостридиопептидаза и антибиотик широкого спектра действия хлорамфеникол. . Методика определения коллагенолитической активности протеаз
Для определения коллагенолитической активности, выражающейся в миллиграммах интактного коллагена, гидролизованного миллиграммом, фермента в единицу времени, использовали методику Bourn в модификации Стальной И.Д (1977). Данный метод характеризует качественный аспект процесса, в то же время активность, выраженная в единицах Mandl (Sigma, Cat. #С0299), представляет количественный аспект (глубину) гидролиза коллагена. Приготовление растворов
Для приготовления универсального буферного раствора смешивают в равных количествах по 0,1 мл 0,1 М раствора уксусной кислоты, 0,1 М раствора ортофосфорной кислоты, 0,1 М раствора борной кислоты. Далее рН раствора доводят добавлением 1 М раствора гидрокисида натрия до 7,2 ± 0,2. Затем последовательно добавляют по 1 мл следующие растворы: 0,2 М раствор соляной кислоты, 0,5 М раствор карбоната натрия, 0,3 М раствор трихлоруксусной кислоты.
Субстрат готовят при температуре 70 С на магнитной мешалке в виде 2 % раствора нативного коллагена на универсальном буферном растворе. Хранится в холоде с плотной крышкой не более трех суток.
Далее 0,1 - 0,5 г ферментного препарата растирают в бюксе с небольшим количеством буферного раствора; непосредственно перед определением переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят буферным раствором до метки.
Рабочий раствор Фолина готовят путем разведения основного раствора Фолина дистиллированной водой в три раза.
Готовят 0,001 М рабочий раствор тирозина путем растворения 181,2 мг чистого тирозина в 0,2 М растворе соляной кислоты в мерной колбе на 1 литр. Из этого раствора готовят разведение 0,05 мкМ, вносят 1 мл раствора тирозина, 5 мл 0,5 М раствора карбоната натрия (при перемешивании) и 1 мл рабочего раствора Фолина.
Пробы оставляют в темном месте на 20 мин для развития окраски. Спектрофотометрируют при 650 нм против контроля в кювете с длиной оптического пути 1 см.
Далее строят калибровочную кривую. На оси абсцисс отражают значения концентрации в мкМ, на оси ординат - экстинцию. По калибровочной кривой находят тирозиновый эквивалент (это экстинция, которую бы дал 1 мкМ коллагена в 1 мл стандартного раствора).
Влияние препаратов коллагеназы на отторжение ожогового струпа
При лечении полнослойных ран кожи установлено, что эпителизация полнослойных дефектов кожи происходила медленно с краев ран. Крысы в течение длительного времени находились в повязках, которые мешали их передвижению. В связи с этим часть животных частично или полностью разгрызла повязки и кольца, подшитые к краям ран. Нарушение целостности кольца приводило к контракции кожи, раны принимали неправильную форму. В таких случаях учитывать степень эпителизации было сложно. Поэтому, учитывали результаты только у тех крыс, где сохранились кольца. Необходимо отметить, что на протяжении всего срока наблюдения в ранах у животных обеих опытных групп (при условии сохранения целостности повязок) не было отмечено выраженного воспаления, сопровождающегося отделением гноя.
Эпителизация раневых дефектов при сохранности кольца во всех группах (опытных и контрольных) завершилась в одни и те же сроки - к исходу 4-й недели. Средние сроки заживления ран при использовании ферментов «Поликоллагеназа-К» и «Коллагеназа-КК» составили 28,4+1,51 и 27,6±1,59 суток, соответственно. Различия статистически недостоверны. Заживление ран контрольных участков завершилось приблизительно в те же сроки (26,3±1,57).
На основании полученных результатов сделан вывод, что оба вида коллагеназы не оказывают существенно влияния на процесс эпителизации полнослойных кожных ран.
Результаты лечения ран, трофических язв кожи препаратами «Колладиасорб», «Ируксол» представлены в табл. 10.
Анализ, основанный на полуколичественной оценке изменений в состоянии ран различного генеза при использовании исследуемых препаратов, позволил сделать следующие заключения: - «Колладиосорб» вызывает меньшее количество болезненных ощущений при наложении. Большинство больных болезненных ощущений не испытывали; - «Колладиосорб» показал лучшую адгезию к дну раны по сравнению с мазью «Ируксол». Это связано с тем, что мазь вьшолнена на жировой основе; - необходимая кратность перевязок при использовании «Ируксол» была выше, по сравнению с препаратом «Колладиосорб»; - оба препарата не оказывают выраженного влияния на рост грануляционной ткани; - оба препарата выражено стимулируют эпителизацию ран; — при применении препарата «Колладиосорб» побочных эффектов не отмечено; — рана, находящаяся под поверхностью полимеризовавшегося порошка «Колладиосорб», не высыхала, необходимость его замены при каждой перевязке отсутствовала; - «Колладиосорб» обладает способностью к сорбции раневого экссудата. Это следует из следующих фактов: набухание сорбента и некоторое увеличение его объема за счет впитывания раневого экссудата; отмечено уменьшение степени отека в ране и в ближайшем ее окружении; - в случае использования мази «Ируксол» в большинстве случаев не отметили ухудшения состояния раны. Вместе с тем, препарат несколько хуже стимулирует репаративные процессы в ране.
Сравнительную оценку проводили на группе больных с гранулирующими ранами. Площадь ран у пострадавших была разная в пределах от 50 до 70 см . Оценку проводили по формуле Л.Н. Поповой (табл. 11).
Анализ результатов лечения ран, трофических язв кожи препаратами, содержащими коллагенолитические ферменты, показал, что скорость эпителизации колеблется в широких пределах (от 2,6 до 7,7 %) и зависит от множества местных и общих факторов. Нормальным течением процесса заживления раны М.И. Кузин (1982) считает, когда суточное заживление площади раны составляет 4%. Процентное уменьшение площади язвы за сутки характеризует динамику регенеративных процессов не только в эпителии, покрывающем язву, но и отражает стадийность течения раневого процесса в подлежащих тканях. Скорость суточного заживления длительно незаживающих ран, трофических язв при лечении препаратом «Колладиосорб» по сравнению с мазью «Ируксол» указывает на выраженные преимущества первого (табл. 13). Определенные различия были отмечены также в ходе анализа мазков-отпечатков.
В ходе анализа мазков-отпечатков установили, что раневой сорбент «Колладиосорб» в значительно большей степени способствует благоприятному течению раневого процесса. У каждого конкретного больного цитологическая картина в ранах имела свои индивидуальные особенности, но направленность процесса была схожей.
Необходимо отметить, что исходное состояние ран при использовании исследуемьк препаратов было разным. В связи с этим в табл. 14—16 приводятся данные цитограмм из ран у больных с различным исходным уровнем микробного обсеменения раневых поверхностей.
Результаты определения коллагенолитической и амилолитической активности протеаз
В настоящее время в медицинской практике используется относительно мало препаратов, в состав которых входят коллагеназы. Наиболее известны препараты «Ируксол» и «Ируксол-моно», которые производятся фирмами «KNOLL» (Германия) и «PLIVA» (Хорватия). В их состав входит фермент коллагеназа (тип А) из Clostridium histolyticum. Этот фермент также назьшают клостидиопептидазой. Помимо фермента в состав препарата входит антибиотик хлорамфеникол. В современное время появились новые ферментные препараты, такие как сорбенты раневые дренирующие биологически активные «Колласорб» и «Колладиосорб». Представляют собой порошкообразные перевязочные средства на основе спштого поливинилового спирта с включением в его структуру лекарственных препаратов - протеолитического фермента коллагеназы из гидробионтов и антисептического препарата диоксидина («Колладиосорб»). Эти препараты предназначены для ферментативного очищения ран различного генеза (ожоговых, пролежней, трофических и диабетических язв и др.) от омертвевших тканей и заслужили признание врачей. Эффективность данных препаратов непосредственно зависит от коллагенолитической активности фермента, включенного в его состав.
Специфическая активность коллагеназ может быть выражена в количестве актов расщепления. В этом случае она выражается в единицах Mandl: одна единица соответствует числу образованных пептидов (N-концов), окрашенных нингидрином (эквивалентных 1 микромолю лейцина) за 5 ч при рН 7, 4 и температуре 37 С [Klimova О. et al., 1990; Easton P. et al., 1993; Grant G. A. et al., 2000].
В ходе проведенных биохимических исследований установлено (табл. 18), что наиболее высокой протеолитической активностью обладает препарат «Коллагеназа-Х». Так, активность данного препарата превышала таковую «Поликоллагеназы-К» в 2,5 раза, «Коллагеназы-КК» - в 3,9 раза, и «Коллагеназы» - в 5,3 раза, «Коллализина» - в 7,6 раза (рис. 15).
В свою очередь, протеолитическая активность «Поликоллагеназы-К» выше таковой (р 0,5) «Коллагеназы-КК» - в 1,5 раз, «Коллагеназы» - в 2,1 раза, «Коллализина» - в Зраза (рис. 15).
Помимо коллагенолитической активности изучали способность ферментов расщеплять углеводы (табл. 19). Установили, что препарат «Коллагеназа-Х» также более активна и в отношении амилазы по сравнению с другими изучаемыми нами ферментами. Так, ее активность была достоверно (р 0,5) выше активности «Поликоллагеназы-К» в 1,9 раз, «Коллагеназы-КК» - в 2,6 раза, «Коллагеназы» -в 3,0 раза, Полученные результаты могут быть использованы в качестве методического обоснования при выборе препаратов для лечения рубцовых дефектов кожи. Широко применяемый в настоящее время в клинической практике препарат «Коллализин» обладает наименьшей коллагенолитической активностью среди исследованных нами протеолитических препаратов. Обсуждение результатов
В отличие от микробных и тканевых коллагеназ - металлоферментов с высокой молекулярной массой - коллагеназа из гидробионтов представляет собой природный комплекс изоферментов с молекулярной массой от 23 до 36 кДа, проявляющих синергический эффект на различных типах субстратов. Подобный комплекс коллагеназ из различных видов крабов был получен и описан исследователями сравнительно давно [Klimova О. et al., 1990; Easton P. et al., 1993; Grant G. A. et al, 2000]. Наличие высокой коллагенолитической активности у ферментов из гидробионтов, а также отсутствие токсичных примесей и высокая стабильность делают возможным их широкое применение. Кроме того, полученный ферментный комплекс обладает высокой стабильностью в растворе, превосходящей не только стабильность известных коллагенолитических препаратов, но и большинства других протеолитических ферментов. Особо следует отметить, что механизм действия коллагеназы из гидробионтов отличается от механизма действия коллагеназ микробного происхождения. Коллагеназы микробного происхождения расщепляют тройную спираль нативного коллагена в одной специфической точке (по связи Gli-Leu или Gly-Ile). Достаточно расщепить одну из молекул тройной спирали нативного коллагена в одной точке, чтобы дестабилизировать всю спираль. При этом первоначально интактные коллагеновые фибриллы превращаются в крупные растворимые фрагменты (с внутримолекулярными перекрестными р-сшивками). Микробные коллагеназы практически не способны гидролизовать образующиеся при этом растворимые крупные фрагменты и расщепляют частично денатурированный коллаген (желатин) очень медленно [Klimova О. et al., 1990; Easton P. et al., 1993; Grant G. A. et al., 2000].
«Поликоллагеназа-К» представляет собой комплекс, проявляющий как коллагенолитическую, так и общую протеолитическую активность. Это означает, что действие ферментного комплекса не ограничено только гидролизом тройной спирали нативного коллагена, крупные фрагменты коллагеновых молекул в растворе продолжают оставаться субстратами для коллагеназы из гидробионтов и подвергаются дальнейшему гидролизу, вплоть до отдельных аминокислот. Этот процесс сопровождается уменьшением первоначального, содержания компонентов коллагена с высокой молекулярной массой и соответствующим увеличением концентрации низкомолекулярных компонентов - коротких пептидов и аминокислот [Парамонов Б.А. и др., 2000]. «Коллализина» - в 6,2 раза.
