Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 10
1.1. Гепатоцеллюлярные карциномы. 10
1.1.1. Факторы риска возникновения ГК. 11
1.1.1.1. Хронический вирусный гепатит. 11
1.1.1.2. Вирус гепатита В. 11
1.1.1.3. Вирус гепатита С. 14
1.1.1.4. Химические канцерогены. 16
1.1.1.5. Наследственные генетические изменения. 17
1.1.2. Этапы гепатоканцерогенеза. 17
1.1.3. Генетические основы трансформации гепатоцитов. 19
1.2. Гепатоцитарные ядерные факторы и их роль в развитии и функционировании печени. 23
1.2.1. Семейство HNF1. 23
1.2.2. Семейство С/ЕВР. 25
1.2.3. Семейство HNF3. 26
1.2.4. Семейство HNF6. 27
1.2.5. Семейство HNF4. 27
1.2.6. Регуляция ГЯФ. 28
1.2.7. ГЯФ при патологиях. 30
1.2.8. ГЯФ и гепатоканцерогенез. 31
1.3. Модель одноступенчатой прогрессии ГК мышей. 32
1.4. Трансформирующий фактор роста р. 37
1.4.1. TGFp лиганд. 37
1.4.2. Рецептор к TGFp. 42
1.4.2.1. Рецепторы к TGFp 3 типа. 42
1.4.2.2. Рецепторы к TGFp 1 и 2 типов. 43
1.4.3. Взаимодействие TGFp лиганд - рецептор. 44
1.4.4. SMAD белки. 46
1.4.5. TGFp сигнальный путь. 50
1.4.6. TGFp респонсивные гены. 51
1.4.7. Прекращение TGFp-зависимой сигнализации. 53
1.4.8. Белки, взаимодействующие с рецепторами к TGFp. 54
1.4.9. SMAD-независимая сигнализация. 55
1.4.10. TGFp сигнальный путь и канцерогенез. 57
1.4.10.1. Антиопухолевая активность TGFp. 57
1.4.10.2. Нарушения сигнального пути TGFp в опухолях. 58
1.4.103. Про-опухолевые эффекты TGFp 59
1.4.11. Эпителиально-мезенхимальный переход и TGFp. 61
1.4.11.1. Эпителиально-мезенхимальный переход. 61
1.4.11.2. Роль TGFp в эпителиально-мезенхииалыюм переходе. 63
2. Материалы и методы 65
2.1. Список использованных растворов и сред. 65
2.2. Линии перевиваемых гепатокарцином. 66
2.3. Клеточные линии. 66
2.4. Трансформация клеток К ColL 68
2.5. Выделение нуклеиновых кислот. 68
2.6. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях. 69
2.8. Тест на цитотоксичность с использованием тиазолила синего. 73
2.9. Измерение уровня активации белка р53. 74
2.10. Измерение скорости роста ГК in vitro и in vivo. 75
3. Результаты исследования 77
3.1. Модель одноступенчатой прогрессии гепатокарцином мышей. 77
3.2. Экспрессия HNF4al влияет на ростовые характеристики ГК. 78
Заключение. 119
Выводы 121
- Гепатоцитарные ядерные факторы и их роль в развитии и функционировании печени.
- Трансформирующий фактор роста р.
- Линии перевиваемых гепатокарцином.
- Экспрессия HNF4al влияет на ростовые характеристики ГК.
Гепатоцитарные ядерные факторы и их роль в развитии и функционировании печени.
Печень отвечает за поддержание постоянства состава крови, регуляцию уровня сахара в крови и глюконеогенез, детоксикацию вредных продуктов метаболизма и ксенобиотиков, в ней синтезируются многие белки плазмы крови, она также участвует в железо-гемоглобиновом обмене. Для выполнения этих функций необходима четкая регуляция синтеза десятков белков, большая часть которых синтезируется исключительно в гепатоцитах. Такая регуляция, как правило, происходит на транскрипционном уровне [28, 64, 65]. Регуляция экспрессии генов в гепатоцитах представляется сложной задачей, главную роль в которой играют гепатоцитарные ядерные факторы (ГЯФ (HNF)). ГЯФ - суперсемейсгво, в которое входят 5 семейств транскрипционных факторов (HNF1, СААТ/энхансер связывающий белок (С/ЕВР), HNF3, HNF4, HNF6), сайты связывания которых обнаружены в промоторах многих печень-специфических генов. Спектр экспрессии ГЯФ не ограничивается только печенью, они обнаружены во многих органах энтодермального происхождения, но именно в печени они представлены полностью. Помимо ГЯФ, важную роль в регуляции экспрессии печень-специфических генов, особенно в онтогенезе, играют транскрипционные факторы семейства GATA, транскрипционный фактор альфа-фетопротеина FTF и COUPF. В данном обзоре мы кратко опишем структуру и функции основных представителей всех 5 семейств ГЯФ (табл. 3). 1,2.1. Семейство HNF1. Это семейство представлено двумя членами, HNF1 и vHNFI, которые по структуре ДНК-связывающего домена могут быть отнесены к гомеобоксным белкам [66]. Помимо гомеодомена, оба члена семейства содержат POU-домен, не участвующий во взаимодействии с ДНК, но повышающий специфичность связывания [67], и 3 транс-активационных домена. Оба члена семейства узнают одну и ту же последовательность ДНК и могут связываться с ней в виде гомо- или гетеродимеров. Белки HNF1 и vHNFI характеризуются высокой степенью гомологии, особенно в ДНК-узнающеЙ части (93%) [68]. Сайты их связывания обнаружены в регуляторных районах более чем 100 гепато-специфических генов [69], в том числе сывороточного альбумина (СА), АФП, транстиретина, а-альбумина, коннексина 32 и многих других. мРНК vHNFl обнаруживается в висцеральной энтодерме желточного мешка мышей на 4,5 день развития [28]. В дальнейшем его экспрессия наблюдается в печени, почках и легких. В этих же органах с 10,5 дня развития наблюдается экспрессия HNF1, но на более низком уровне.
После рождения экспрессия обоих генов наблюдается в печени, почках, кишечнике и поджелудочной железе. Во всех этих органах, за исключением почек, HNF1 преобладает. Инактивация HNF1 у мышей приводит к замедлению роста и множественным поражениям почек, печени и поджелудочной железы. Как правило, у таких животных развивается фенилкетонурия и нарушается секреция инсулина [70]. Нокаут гена vHNFl у мышей летален из-за нарушения гаструляции и дифференцировки висцеральной энтодермы [71]. Предполагается, что vHNFl критичен для дифференцировки висцеральной энтодермы и закладки печени и почек, в то время как HNF1 нужен для поддержания дифференцированного состояния этих органов [72]. 1.2.2. Семейство С/ЕВР. В это семейство включены транс-факторы, в составе которых обнаружен ДНК- связывающий домен - bZIP, помимо него они содержат «лейциновую молнию», участвующую в димеризации, и транс-акгивационный домен. Белки этого семейства узнают общую последовательность ДНК и связываются с ней в виде гомо- или » гетеродимеров. В печени экспрессируются С/ЕВРа, С/ЕВРр и С/ЕВР5 [73]. Сайты связывания для них обнаружены в промоторах многих печеночных генов: АФП [74], xl-АТ, ТТР, СА [75], HNF3p [76] и других печеночных генов, а также в энхансере HBV [77]. мРНК С/ЕВРа впервые выявляется у мышей на тринадцатый день развития в эмбриональной печени. Во взрослом организме белок С/ЕВРа выявлен лишь в печени и жировой ткани. Транскрипты гена С/ЕВРр выявляют в сердце и печени на 14 день развития эмбриона крысы [78]. Во взрослом организме С/ЕВРр и С/ЕВР5 экспрессируются в печени, кишечнике, легких и жировой ткани [79]. Соотношение С/ЕВРа и С/ЕВРР в клетке зависит от ее пролиферативного статуса. В нормальной взрослой печени существует четкий баланс количества этих белков, но при регенерации уровень С/ЕВРа начинает быстро падать, а С/ЕВРР наоборот расти, при этом общее количество С/ЕВР практически не меняется [80]. Нокаут гена С/ЕВРа у мышей летален сразу после рождения из-за нарушения синтеза гликогена. У мышей наблюдается гипертрофия печени и гиперэкспрессия генов с-тус и c-jun [81]. Культура первичных гепатоцитов, полученная из таких мышей, характеризуется значительным ускорением пролиферации и повышением частоты спонтанной трансформации [82], что указывает на важную роль С/ЕВ Ра в поддержании дифференцированного состояния и контроле пролиферации. При инактивации гена C/EBPJ3 у мышей не наблюдается нарушений эмбрионального развития, но после рождения многие животные погибают от гипогликемии- У таких мышей снижен пролиферативный ответ на повреждающие печень воздействия и подавлена экспрессия ряда транскрипционных факторов, контролирующих рост клеток (циклинов В и Е, Egr-1 и др.) [83]. Экзогенная экспрессия С/ЕВР0 в клеточной линии поджелудочной железы приводит к индукции целого ряда гепатоцитарных маркеров и подавлению синтеза панкреатических маркеров [84]. 1.2.3. Семейство HNF3. Белки этого семейства содержат ДНК-связывающий домен типа «крылатая спираль» (forkhead-белки) [85] и 4 транс-активационных домена. Этот домен сходен с аналогичными доменами гистонов HI и Н5, что позволяет предположить участие белков семейства HNF3 в перестройке хроматина.
Белки семейства HNF3 (а, р, у) узнают одинаковую последовательность ДНК и связываются с ней в виде мономеров [86]. Они способны активировать транскрипцию ряда генов, специфичных для печени, например СА и ТТР [87, 88], al-AT [89], Апо В [90], HNF1 [91], а также HNF3a и HNF3fJ [92], образуя, таким образом, авторегуляторную петлю. На 6,5 день развития мышиного эмбриона экспрессия HNF3p наблюдается преимущественно в печени, легких, желудке и кишечнике. Чуть позже в тех же тканях обнаруживаются и два других представителя семейства HNF3a и НМРЗу- Инактивация HNF3Y не приводит к заметным нарушениям в развитии мышей [93]. Нокаут по гену HNF3a детален у мышей в течение первой недели жизни из-за нарушения гомеостаза глюкозы [94]. Инактивация гена HNF3JS ведет к гибели эмбрионов мышей на 8,5 сутки развития из-за нарушения закладки кишечной трубки и отделения зародыша от желточного мешка [95]. HNF3P играет важную роль в придании энтодермальным клеткам компетентности к принятию индуцирующего сигнала [96]. Он способствует разворачиванию конденсированного хроматина и облегчает связывание раннего энтодермального фактора GATA4 в промоторах гепатоцитарных генов [97]. Однако кондиционная инактивация гена HNF3p во взрослой печени не влияет на уровни экспрессии других ГЯФ - HNF1, HNF4a, НЖЗаиу[98]. В промоторах некоторых генов, специфичных для печени, с сайтом связывания HNF3 может связываться еще один белок. - HNF6 [99]. В состав HNF6 входит гомеобоксный домен и ДНК-связывающий домен типа CUT. Экспрессия HNF6 наблюдается начиная с 9 дня развития мышиного эмбриона в печени и зачатке нервной системы [100]. Во взрослом организме его экспрессия обнаружена в печени (как в гепатоцитах, так и в холангиоцитах), поджелудочной железе, селезенке, мозге и семенниках [101]. Инактивация HNF6 приводит к нарушению дифференцировки экзокринных клеток поджелудочной железы и развитию диабета, кроме того, у таких животных отсутствует желчный пузырь и нарушено развитие желчных протоков [101]. 1.2.5. Семейство HNF4. Из 5 известных семейств ГЯФ наибольший интерес для нас представляет семейство HNF4. Хотя лиганд, способный активировать HNF4 in vivo, не найден, по структуре их можно отнести к суперсемейству ядерных рецепторов. Как и другие белки этого типа, они содержат два ДНК связывающих домена типа «цинковые пальцы», а их С-концевой район отвечает за димеризацню и, возможно, за связывание лиганда.
Трансформирующий фактор роста р.
TGFp был открыт в 60 годах прошлого века как фактор, способствующий росту нетрансформированных крысиных фибробластов в мягком агаре. Позднее было показано, что он относится к большому суперсемейству цитокинов, ответственных за эмбриональное развитие, органогенез и дифференцировку, а также, что TGFp оказывает цитостатическое и/или проапоптотическое воздействие на многие виды эпителиальных опухолей, играет важную роль в процессах канцерогенеза и опухолевой прогрессии [134]. Суперсемейство TGFp принято подразделять на 2 подсемейства или на 9 семейств: подсемейства TGFp/активин (TGFP и активиновое семейства) и BMP/GDF (ВМР2, ВМР5, ВМРЗ, GDF5, Vgl и семейства промежуточных и дальних факторов). Члены BMP/GDF и активинового семейства играют важную роль преимущественно в эмбриогенезе, контролируя такие процессы, как гаструляция, нейрогенез, определение дорзовентральной оси, и участвуют в регуляции закладки и развития многих органов [19, 21]. В данном обзоре мы не будем касаться структуры и свойств членов семейства BMP/GDF,. а сконцентрируемся на TGFp. На сегодняшний день идентифицировано 5 генов, относящихся к описываемому семейству. Это TGFPi, TGFp2, TGFp3 TGFp4, TGFps, из них только первые 3 встречаются у млекопитающих, а 2 оставшихся гена бьши клонированы из Xenopus levis [135]. Члены этого семейства характеризуются высокой гомологией на белковом уровне (64-82%), так, TGFPi и TGFP2 различаются только 14 из 42 аминокислотными остатками в районе связывания с рецептором [21]. Многие члены семейства обладают межвидовой биактивностью, так TGFp2 человека активен в отношении мышиных клеточных линий, а TGFp2 свиньи - в отношении кроличьих клеток. В течение длительного времени исследователи полагали, что вследствие высокой гомологии членов семейства их биологические свойства идентичны. Поэтому абсолютное большинство работ было посвящено изучению функции TGFPi, типичного представителя семейства, однако данные, полученные в последнее время, указывают на существование различий в биологических эффектах, вызываемых различными членами семейства [21, 136]. Экспрессия гена каждого из членов семейства TGFp контролируется собственным промотором, что указывает на наличие независимых механизмов регуляции их транскрипции [19]. В промоторе генов TGFp2 и TGFP3 обнаружены гормон-респонсивный CREB-сайт и ТАТА-бокс, в то время как промотор TGFp і лишен ТАТА-бокса, но содержит сотни гормон-респонсивных CREB-элементов, а также сайты связывания для транс-факторов Spl и KLF6 [21,22].
Паттерн экспрессии членов семейства TGFp различается: TGFPJ является универсальным фактором, экспрессируемым почти всеми типами клеток, TGFpV и TGF03 синтезируются в ограниченном числе тканей. В норме, во взрослой крысиной печени экспрессируются все 3 представителя семейства: синусоидальные клетки и Купфферовские клетки экспрессируют высокий уровень TGF0I и незначительные количества остальных членов семейства TGFp. В звездчатых клетках экспрессируются все три TGFp гена (на очень низком уровне), а в гепатоцитах экспрессия членов семейства TGFp наблюдается, как правило, только при гепатэктомии, гепатоканцерогенезе или других стрессорных воздействиях [22, 137, 138]. При гепатэктомии наблюдается быстрое повышение экспрессии TGFp во всех типах клеток. Значительнее всего в гепатоцитах повышается уровень экспрессии TGFp2. При фиброзном перерождении уровень экспрессии повышается только в звездчатых клетках, причем для всех 3 представителей семейства TGFp [22]. Белки семейства TGFp синтезируются в виде белкового предшественника, от которого в процессе созревания отделяется сигнальный пептид и N-концевой продомен, получивший название LAP (Latentcy-Associated Protein). За отделение LAP в клетках млекопитающих отвечает субтилизин-подобная про-протеин конвертаза (SPCl/Furin или SPC4/PAGE4), Биологически активной формой TGFp является димер, состоящий из связанных между собой гидрофобными и дисульфидными связями мономеров. Характерной особенностью белков семейства TGFp является наличие структуры, называемой «цистеиновый узел», образуемой б внутрибелковыми дисульфидными связями [19]. У млекопитающих преимущественно встречаются гомодимеры, но недавно были выделены и гетеродимерные формы (TGFPi-2, TGFpi-з и др.). В комплексе с LAP димеры удерживаются нековалентными взаимодействиями и N-гликозидными связями, в таком виде TGFp секретируется в кровь шш межклеточную жидкость. Во многих типах клеток (например, в звездчатых клетках печени и гепатоцитах) синтезируется 130 кДа белок LTBP (Latent XGFp Binding Protein), соединяющийся дисульфидной связью с одним из мономеров LAP и также входящий в состав экскретируемого комплекса [139] (рис 5). Комплекс, состоящий из LAP, TGFp и LTBP с массой, равной 235 кДа, получил название большого латентного комплекса. В составе такого комплекса члены семейства TGFp биологически неактивны, но эти белки необходимы для правильного фолдинга, секреции и локализации TGFp в организме [139]. Латентный комплекс заякорен в матриксе через N-гликозидную связь белка LTBP с компонентами ВКМ. Механизм, регулирующий освобождение LAPGFp из комплекса с белком LTBP, изучен недостаточно хорошо и может значительно отличаться в разных типах тканей [139]. Считается, что в нем участвуют внеклеточные протеиназы, определяющие перестройку матрикса или способные напрямую разрушать LTBP, а также трансглутаминазы, разрушающие связь LTBP с компонентами ВКМ. Для активации цитокина необходимо освободить его из комплекса с LAP белком, в этом процессе могут участвовать внеклеточные протеазы (плазмин, ММР9) или низкий рН среды [134]. Ряд клеточных рецепторов, таких как интегрин Ctvp5 или рецептор рецептор инсулин-подобного фактора 2/рецептор маноза-б-фосфат (IGF2R/M6PR), способны связывать LAP и изменять его конформацию, что приводит к активации TGFp [20, 139]. Аналогичен механизм активации TGFP с помощью тромбоспондина 1. Этот механизм по всей видимости имеет большое значение, т.к. фенотип мышей, нокаутных по гену тромбоспондина 1 и TGFpi, очень похож [21,139].
После активации димер способен связаться с TGFP-рецепторами и активировать их, запуская тем самым каскад внутриклеточной передачи сигнала. Инактивация гена TGFP2 [136, 140] у мышей приводит к смерти сразу после рождения из-за нарушений в развитии сердечно-сосудистой системы, легких, глаза, костей позвоночника, а также массированного апоптоза. Инактивация TGFp3 [141, 142] не летальна, у таких мышей наблюдаются нарушения в развитии неба («волчья пасть») и легких. Нокаут гена TGFPi приводит к нарушениям в развитии иммунной системы (появление большого количества аутореактивных Т-лимфоцитов), инфильтрации печени и легких лейкоцитами и макрофагами, появлению множественных очагов воспаления, от которых мыши погибают в возрасте 3 недель [22, 143]. Данные об эффекте увеличения транскрипции TGFpi противоречивы. Согласно результатам Куй и со-авторов [144] мыши, с гиперэкспрессированным в кератиноцитах TGFPt, более устойчивы к индукции опухолей кожи, однако образовавшиеся опухоли кожи быстрее и чаще приобретали злокачественный фенотип. В работах группы Торгиерсона показано [145,146], что мыши с гиперэкспрессированным в гепатоцитах TGFpi, более чувствительны к гепатоканцерогенному воздействию тиоацетамида и ацитиламинофлуорена. В передаче сигнала от TGFp принимают участия 3 типа рецепторов. TGFp рецепторы (TGF0R) 1 и 2 типа относятся к классу серин/треониновых киназ и участвуют во внутриклеточной передаче сигнала, a TGFpR3 типа не имеет внутриклеточного домена, но участвует в активации латентной формы TGFp, в его накоплении и кластеризации [19]. В этот класс входят 2 мембранно-связанных протеогликана: бетагликан и эндоглин. Бетагликан состоит из белкового кора (853 а.к. - 300 кДа), несущего множество остатков гепарин сульфата и хондроитин сульфат глюкоза-амингликана. Цитоплазматическая часть бетагликана мала (43 а.к.) и лишена каких-либо известных сигнальных мотивов. Этот район не важен для связывания и презентации TGFp, и его функция не ясна [19]. Однако полученные в последнее время данные показывают, что в присутствии TGFP2 цитоплазматический конец бетагликана взаимодействует с аутофосфорилированным TGFPR2 с помощью неизвестного механизма, что приводит к активации комплекса TGFpRl/TGFpR2 [147,148].
Линии перевиваемых гепатокарцином.
Первичные ПС мыши были получены и предоставлены О.В. Морозовой. ПС индуцировали у самцов гибрида F1 линий C57BI и DBA по стандартной методике химического гепатоканцерогенеза: однократной инъекцией диэтилнитрозамина (90 мг/кг веса внутрибрюшинно) с последующей промоцией фенобарбиталом (0,5 % в питьевой воде в течение 14 месяцев). Полученные опухоли перевивали мышам F1 подкожно суспензией опухолевой ткани в ростовой среде. Образцы опухолей размером приблизительно 30 мг вырезали у свежезабитых мышей и замораживали в жидком азоте, параллельно замораживали образцы для гистологического и иммунохимического анализа. До выделения РНК или ДНК образцы хранили при температуре -70С или в жидком азоте. 2.3. Клеточные линии. 2.3,1. Эукариотические клеточные линии. Культура клеток быстрорастущей визкодифференцированной ПС, ГОЗ, была получена и любезно предоставлена Е.И. Кудрявцевой [265]. Трансфицированная вектором pLEN4S-HNF4al культура H33 HNF4al и контрольная культура НЗЗ-Puro были получены, клонированы и любезно предоставлены Н.Л. Лазаревич [266]. Пакующие клетки для ретровирусных конструкций с амфотропной специфичностью Phoenix-Ampho, клеточная линия рака простаты человека РСЗ, продуцирующая TGFpt и TGFP2 в среду культивирования, были любезна предоставлены П.М. Чумаковым. Линия СопА, содержащая вектор, экспрессирующий бета-галактозидазу под контролем р53-респонсивного района гена MDM2 [267], была любезно предоставлена А.В. Гудковым. Все клеточные линии, за исключением РСЗ, культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco), глютамина (300 мкг/мл) и антибиотика ципрофлоксацина (10 мкг/мл) в атмосфере 5% СОг при температуре 37С. Клетки линии РСЗ выращивали в среде RPMI-1640, остальные условия культивирования были идентичны. Приблизительно раз в 5-7 дней клетки обрабатывали трипсином и пересевали. Для получения кондиционированной среды (КС) ростовую среду с НЗЗ, РСЗ, клонов H33-MHTGFp2 и НЗЗ-MHGFP стерильно собирали, центрифугировали 10 мин при 5 000 об/мин и фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм, делили на аликвоты и хранили при -20 С.
Для наращивания плазмид использовали штамм E.coli XI0 Gold с пониженной способностью к рекомбинации и лишенный системы dam метилирования. Экспрессируюший ретровирусный вектор pLPCX MHPHKGFp2. содержащий миРНК к гену TGFp2 под контролем LTR вируса иммунодефицита человека и ген устойчивости к пуромицину, а также контрольный вектор, содержащий миРНК к гену GFP, были любезно предоставлены А.В. Гудковым [268]. 2.3.3. Получение клонов мышиной гепапюмы НЗЗ, содержащей миРНК TGFfi Для трансфекции пакующих клеток Phoenix-Ampho ретровирусным вектором pLPCX MnPHKGFp2 использовали стандартный кальций-фосфатный метод [269, 270]. Первые три дня после трансфекции среду, в которую продуцировался вирус, собирали, центрифугировали при 2-3 тыс. об/мин 5 минут, фильтровали через одноразовые фильтры с диаметром пор 0,45 мкм (МШіроге), разводили в 2-3 раза свежей ростовой средой и использовали для заражения клеток гепатомы НЗЗ. Заражение проводили в течение 1-2 суток, после чего клетки отмывали от среды, содержащей вирус, и переводили ва селективную среду с целью получения стабильно трансформированных клонов. Селекцию на устойчивость к пуромицину проводили на ростовой среде, содержащей 2,5 мкг/мл антибиотика. В таких условиях контрольные клетки погибали в течение 8 дней. Селекцию вели 10 дней, меняя среду каждые 3-4 дня. Из отобранных клеток были изолированы 10 уникальных клонов (H33-MHTGFp2 клоны), остальные клоны были объединены в смешанную культуру (H33-MHTGFP 2 смесь). Все клоны полученные из клеток трансформированных контрольным вектором, были также объединены в смешанную культуру (H33-MHGFP). Снижение количества секретируемого TGFP2 измеряли с помощью набора для ELISA - Quantikine-Human TGFP2 Immunoassay, R&D Systems. 2.3.3.2. Определение количества TGFjb в культуральной среде. Для измерения количества TGFP2 в культуральной среде использовали набор для EUSA - Quantikine-Human TGFp2 Immunoassay компании R&D Systems. He менее 2x10е клеток пересевали на 6 см чашку и выращивали в течение 48 часов, среду собирали, центрифугировали 10 мин при 5 000 об/мин, измеряли объем и фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Затем кондиционированную среду (КС) концентрировали с помощью концентратора MiniconS (Millipore) в 10 раз. Одновременно количество клеток подсчитывали в камере Горяева, Количество активного и общего TGFp2 в пробах измеряли в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Оптическую плотность при длине волны 450 нм измеряли с помощью планшетного ридера «Униплан» (Пикон, Россия). Полученные значения нормализовывалц на количество клеток в 1 мл среды. 2.4. Трансформация клеток Е. Coli. В работе использовали замороженные компетентные клетки E.coli, приготовленные с помощью набора для создания компетентных клеток «Z-competent E.coli transformation kit» (Zymo Research, USA). Клетки размораживали на льду, добавляли к ним 5-15 нг плазмидной ДНК и оставляли на льду на 40 минут. Затем клетки рассевали на предварительно нагретые до 37 0 чашки Петри с LB агаром, содержащим ампицнлнн в концентрации 50 мг/мл, и инкубировали в течение ночи при 37С. Бактериальные клоны отбирали и тестировали на наличие плазмиды с помощью рестрнкционного анализа плазмидной ДНК. 2.5. Выделение нуклеиновых кислот. 2.5.1. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК. Для получения препаративных количеств плазмидной ДНК клетки E.Coli, трансформированные соответствующими плазмидами, выращивали из отдельной колонии в 250 мл среды LB с добавлением ампицилина (до концентрации 50 мкг/мл) в течение ночи при интенсивном перемешивании и 37С. Затем бактерии осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 15 мин при 4С. Клеточный осадок ресуспендировали в 3 мл раствора для лизиса из набора для выделения плазмид «Wizard DNA Purification System» (Promega, USA).
Далее плазмидную ДНК выделяли в соответствии с рекомендациями производителя и элюировали с колонки в 250 мкл воды, свободной от нуклеаз. Качество полученной плазмидной ДНК проверяли с помощью фореза в агарозном геле, а концентрацию измеряли спектрофотометрически при длине волны 260 нм и рассчитывали по формуле: Концентрация ДНК (мкг/мл) = ОД2бох50хР, где Р - разведение. Полученную плазмидную ДНК хранили при -20 С. 2.5.2. Выделение суммарной клеточной РНК. Для выделения РНК из ГК замороженные образцы тканей измельчали в парах жидкого азота предварительно охлажденным гомогенизатором Поттера. Затем к полученному породжу прибавляли 0,75 мл лизис буфера из набора для выделения РНК «Wizard SV Total KNA Isolation System» (Promega, USA). При выделении РНК из культур 10 клеток лизировали в 0,75 мл лизис буфера из набора для выделения РНК «Wizard SV Total RNA Isolation System» (Promega, USA). Далее тотальную клеточную РНК выделяли в соответствии с рекомендациями производителя и элюировали с колонки в 75 мкл воды, свободной от нуклеаз. Качество полученной РНК проверяли с помощью фореза в агарозном геле, а концентрацию измеряли спектрофотометрически при длине волны 260 нм и рассчитывали по формуле: Концентрация РНК (мкг/мл) = ОДдбо ОхР, где Р - разведение. Полученную тотальную РНК хранили при -20 С. Для выделения низкомолекулярной ДНК из ПК, замороженные образцы тканей измельчали в парах жидкого азота предварительно охлажденным гомогенизатором Поттера. К полученному порошку прибавляли 0,5 мл лизис буфера, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем центрифугировали 10 минут при 14 тысяч оборотов в минуту. Супернатант переносили в новую пробирку, добавляли протеиназу К до концентрации 2,5 мкг/мл и инкубировали при 37С 1 час. Затем добавляли 1 объем изопропанола и 1/20 объема 5М NaCl, перемешивали и центрифугировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Полученный осадок растворяли в 50 мкл воды, добавляли РНКазу Н и инкубировали при 37С 1 час.. ДНК экстрагировали фенолом, а затем хлороформом, водную фракцию переносили в новую пробирку и переосаждали, после чего осадок растворяли в 10 мкл воды и анализировали в 2% агарозном геле. 2.6.
Экспрессия HNF4al влияет на ростовые характеристики ГК.
Важнейшим свойством, приобретенным ГК в ходе прогрессии в исследуемой системе, стало резкое ускорение роста опухоли in vivo, от 5-7 месяцев между перевивками для мГК, до 2 недель для 6ГК. Этот феномен может быть связан как с усилением пролиферации, так и с уменьшением уровня апоптоза. Для сравнения уровня апоптоза в мГК и 6ГК был использован метод выделения низкомолекулярной ДНК из образцов опухолей и нормальной мышиной печени. Выделенную низкомолекулярную фракцию ДНК фракционировали в агарозном геле и визуализировали с помощью окрашивания бромистым этидием. Результаты эксперимента представлены на {рис. 9). Хорошо видно, что, как в образце нормальной мышиной печени, так и в образце мГК с помощью используемого метода апоптотическая фрагментация ДНК не выявляется. Это совпадает с литературными данными об уровне апоптоза в нормальной печени, который в норме не превышает 3-4 апоптотических клеток на 10 000 нормальных [273, 274]. Такой уровень апоптоза не может быть выявлен с помощью использованного метода. В то же время, ДНК из образца 6ГК имеет паттерн расщепления около 200 п.н., характерный для деградации ДНК в процессе апоптоза. Это свидетельствует о высоком уровне апоптоза в 6ГК. При гистологическом анализе срезов 6ГК было выявлено большое количество «апоптотических телец», специфических структур, образующихся в процесе программируемой клеточной гибели, что свидетельствует о повышенном уровне апоптоза в этой опухоли. В то же время, значительное количество митозов, выявляемых в гистологических препаратах 6ГК, в отличие от мГК, свидетельствует и об усилении пролиферации в дедифференцированном варианте опухоли. Разница в скорости роста между мГК и 6ГК позволяет предположить, что уровень экспрессии HNF4al связан с ростовыми характеристиками ГК в исследуемой системе. Для проверки этой гипотезы мы использовали клеточные линии H33-HNF4ol и НЗЗ-Puro, ко-трансфицированные вектором, экспрессирующим HNF4al, и вектором, несущим устойчивость к пуромицину, или только контрольным вектором, соответственно. Мы воспользовались прямым методом определения кинетики пролиферации исследуемых культур. Для этого по 5x10 клеток каждой линии было посеяно на 6 чашек диаметром 6 см. Ежедневно количество клеток в одной из чашек подсчитывали с помошъю камеры Горяева.
Изменение количества клеток в этом случае, отражает баланс между уровнем пролиферации и апоптоза в исследуемой клеточной культуре. На рис 10 видно, что количество клеток в контрольной культуре НЗЗ-Риго в процессе культивирования увеличивается существенно быстрее, чем число клеток H33-HNF4al, и к 6 дню эксперимента превышает их в 2 раза. Уровень пролиферации H33-HNF4al и НЗЗ-Риго измеряли с помощью включения в ДНК 5-BrdU. К клеткам на 2 часа добавляли модифицированный нуклеотид, после чего препарат фиксировали и окрашивали с помощью антител к 5-BrdU. Процент окрашенных клеток, соответствующий уровню пролиферации клеточной культуры, подсчитывали под микроскопом. Клетки, экспрессирующие HNF4al, в 1,5 раза хуже включают 5-BrdU, чем контрольные клетки, трансформированные пустым вектором, (рис. 10) Таким образом, полученные данные указывают на антипролиферативный эффект экспрессии HNF4al. 3.2.3. Ре-экспрессия HNF4al снижает скорость роста 6ГК in vivo. Для проверки гипотезы об антипролиферативном эффекте HNF4al и его влиянии на скорость роста опухолей in vivo, совместно с О.В. Морозовой был поставлен следующий эксперимент. 5x10й клеток линий НЗЗ-Риго ИЛИ H33-HNF4al были инъецированы подкожно 10 конгенным мышам. Размеры опухолей измеряли три раза в неделю, результаты измерений приведены на рис 10. У мышей, которым были инъецированы клетки линии H33-HNF4al, наблюдалось значительное снижение скорости роста опухолей по сравнению с животными, инъецированными НЗЗ-Риго. В этом случае по прошествии 7 недель средний размер опухоли был менее 50 мм , в то время как у мышей, которым были инъецированы клетки контрольной линии НЗЗ-Puro, наблюдались крупные (около 17 000 мм3) опухоли. Таким образом, ре-экспрессия HNF4al в клетках дедифференцированной ГК мыши оказывает ингибирующий эффект на рост опухолей in vivo и in vitro. Механизм, с помощью которого HNF4al способен подавлять рост ГК, не ясен, но, учитывая тот факт, что HNF4al - один из важнейших печень-специфических транс-факторов, можно ожидать, что по крайней мере часть этих изменении должна происходить на транскрипционном уровне. Основываясь на этом предположении, для поиска возможных эффекторов антипролиферативной функции HNF4a мы приступили к анализу транскрипционных изменений, произошедших в ходе опухолевой прогрессии в исследуемой системе. 3.3. Сравнение уровней экспрессии генов, вовлеченных в контроль пролиферации и а по птоза, в 6ГК и мГК. 3.3,1, Гиперэкспрессия TGFfi респонсивных генов при одноступенчатой прогрессии ГК. Для изучения изменений в характере экспрессии генов, сопровождающих прогрессию ГК в исследуемой модели, Н.Л. Лазаревич [133] были проанализированы спектры экспрессии генов в мГК, 6ГК и ЮЗ по сравнению с нормальной печенью взрослой мыши с помощью гибридизации с микрочипами, содержащими кДНК 9 000 мышиных генов, изготовленными в Медицинском Колледже имени Альберта Эйнштейна Университета Ешива, Нью-Йорк, США. После компьютерного анализа полученных результатов были сформированы списки генов, экспрессия которых наиболее существенно изменилась в 6ГК и НЗЗ по сравнению с мГК и нормальной печенью мыши (табл. 5) Результаты гибридизации образцов 6ГК или мГК с микрочипами были нормализованы относительно контрольной гибридизации с кДНК нормальной печени мыши. Уровень экспрессии признавали измененным, если соотношение нормализованных сигналов при гибридизации с кДНК из 6ГК и мГК (бГК/мГК или мГК/бПС) составляло не менее 2 раз. Всего было выявлено 250 генов, экспрессия которых при прогрессии повышается, и 380 генов, экспрессия которых падает более чем в 2 раза (бГК/мПС 2 или 0,5 соответственно) [133].
Более половины наиболее значительно репрессированных генов кодирует сьюороточные белки, синтезируемые в печени, и маркеры печеночной дифференцировки. Эти результаты отражают процесс утраты дифференцировки, характерный для прогрессии ГК. В таблицу включены некоторые гены, изменение уровня экспрессии которых в 6ГК относительно мГК составило не менее чем 3,5 раза. Среди наиболее гиперэкспрессированных генов можно выделить несколько групп: транскрипционные факторы; белки, участвующие в передаче сигнала или контролирующие пролиферацию; метаболические ферменты; транспортные и адгезионные молекулы, а также ряд неохарактеризованных пока последовательностей кДНК (ESTs). Изменения экспрессии некоторых генов описаны ранее при развитии других типов опухолей: так, например, гиперэкспрессия фибронектина является частым событием в опухолях простаты. Значительная часть генов, экспрессия которых наиболее существенно повысилась в 6ГК и/или ЮЗ по сравнению с мГК (7 из 26 генов с известной функцией) оказались TGFp-индуцируемыми, что указывает на вовлеченность сигнального пути, регулируемого факторами этого семейства, в прогрессию опухолей печени. 3,3.2, Исследование спектров экспрессии TGFfi-респонсивных генов и генов, участвующих, в TGFp-зависимом сигнальном пути, методом ОТ-ПЦР. С помощью метода ОТ-ПЦР мы проверили некоторые закономерности, выявленные в ходе анализа результатов гибридизации с кДНК микрочипами. В панель были включены по два независимо полученных образца 6ГК, мГК, ЮЗ и не родственная им медленнорастущая, высокодифференцированная мышиная ПС (мГК-2). В качестве контроля использовали образцы нормальной мышиной печени. Закономерности экспрессии ряда генов были также изучены, совместно с Д.И. Флейшман, методом ОТ-ПЦР в панели независимо индуцированных ПС мышей с различным уровнем дифференцировки, в которую вошли 5 образцов высокодифференцированных медленнорастущих опухолей, 7 образцов низкодифференцированных быстрорастущих ПК и нормальная печень мыши.
