Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1. Фактор дифференцировки HLDF 9
1.1. Выделение, химический синтез, активный центр фактора 9
1.2. Противоопухолевая активность пептида HLDF -6 10
1.3. Адаптогенные, антиоксидантне и радиопротекторные свойства пептида HLDF-6 11
1.4. Влияние пептида HLDF-6 на эндогешгую антиноцицептивнуто систему. 13
1.5. ДНК-гидролизующий фрагмент HLDF-8 15
1.6. Участие фактора HLDF в процессах апоптоза 15
2. Общая характеристика системы половых стероидов 16
2.1.. Пути биосинтеза половых стероидов 16
2.2. Анаболический эффект половых стероидов, влияние андрогенов на массу тела и придаточных половых желез 20
2.3. Участие половых гормонов в регуляции поведенческих реакций, уровня агрессии и болевой чувствительности 22
2.4. Роль эстрогенов у самцов 27
2.5. Участие половых гормонов в поддержании артериального давления, симпатического и парасимпатического тонуса автономной нервной системы 29
3. Общая характеристика гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы 31
3.1. Гормоны гипоталам о-гипофизарно-адреналовой системы 31
3.2. Физиологические эффекты кортикостероидов 34
3.3. Взаимосвязь гипофизарно-адреналовой и гипофизарно-гонадной систем, половые различия в функционировании гипофизарно-адреналовой системы 37
4. Взаимосвязь системы стероидных гормонов с эндогенной антиноцицептивнои системой 39
4.1. Пути проведения болевых импульсов, механизм действия опиоидов, их метаболизм 39
4.2. Взаимосвязь опиатной системы с системой кортикостероидных гормонов.
5. Участие факторов дифференцировки и апоптоза в развитии патологий сердечно сосудистой системы 43
5.1. Апоптоз, морфологические и биохимические критерии апоптоза 43
5.2. Значение факторов дифференцировки и апоптоза при ишемических кардиальных нарушениях 46
5.3. Свободные радикалы и их участие в развитии патологий сердечнососудистой системы. 47
6. Представления о функционально непрерывной совокупности регуляторных
пептидов 48
Глава II. Материалы и методы исследования 51
1. Объект исследования 51
2. Методы исследования 51
2.1. Исследование поведения животных в тесте «открытое поле» 51
2.2. Определение уровня болевой чувствительности в тесте «горячая пластина» 52
2.3. Определение уровня агрессии у самцов мышей 52
2.4. Изучение половой активности самцов мышей 52
2.5. Гистологические и морфологические исследования 53
2.6. Количественное определение уровня стероидных гормонов в крови 53
2.7. Хирургические процедуры: гонадэктомия, гипофизэктомия, имплантация артериальных и венозных катетеров 53
2.8. Регистрация артериального давления и частоты сердечных сокращений, тестирование чувствительности барорефлекса 55
3. Протоколы исследования 56
4. Статистическая обработка результатов 59
Глава III. Результаты и обсуждение 60
1. Изучение андрогенной активности пептида HLDF-6 60
1.1. Влияние пептида HLDF-6 на поведение мышей NMRI в тесте «открытое поле» 60
1.2. Влияние пептида HLDF-6 на болевую чувствительность мышей NMRI в тесте «горячая пластина» 63
1.3. Влияние пептида HLDF-6 на половую активность у мышей NMRI 66
1.4. Влияние пептида HLDF-6 на уровень агрессивности у мышей NMRI, .67
1.5. Влияние пептида HLDF-6 на массу тела и придаточных половых желез у гонадэктомированных мышей NMRI 70
1.6. Влияние пептида HLDF-6 на гистологическое строение простаты и семенных пузырьков у гонадэктомированных мышей NMRI 73
1.7. Влияние пептида HLDF-6 на уровень тестостерона, кортикостсрона и эстрадиола в крови у мышей NMRI 76
1.8. Влияние пептида HLDF-6 на параметры системной гемодинамики у гонадэктомированных мышей NMRI при хроническом введении 79
2. Изучение адренокортикотропной активности пептида HLDF-6 80
2.1. Влияние пептида HLDF-6 на массу надпочечников у гонадэктомированных мышей NMRI 80
2.2. Влияние пептида HLDF-6 на уровень кортикостероидов в крови у гипофизэктомированных самцов и самок крыс Wistar 82
2.3. Влияние пептида HLDF-6 на массу надпочечников у гипофизэктомированных самцов и самок крыс Wistar 85
2.4. Влияние пептида HLDF-6 на поведение гипофизэктомированных крыс WistarBTeere «открытое поле» 85
2.5. Влияние пептида HLDF-6 на уровень болевой чувствительности в тесте «горячая пластина» у гипофизэктомированных крыс Wistar 87
3. Изучение гемодинамической активности пептидов HLDF 89
Выводы 109
Список литературы
- Противоопухолевая активность пептида HLDF
- Участие факторов дифференцировки и апоптоза в развитии патологий сердечно сосудистой системы
- Изучение половой активности самцов мышей
- Влияние пептида HLDF-6 на уровень кортикостероидов в крови у гипофизэктомированных самцов и самок крыс Wistar
Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование механизмов и функциональной роли процессов клеточной пролиферации и дифференцировки является одним из наиболее интенсивно развивающихся перспективных направлений современной биомедицины Всестороннее изучение этих процессов представляется важпым как для понимания фундаментальных проблем - развития систем органов, формирования их функций и механизмов специфической деятельности, так и медико-социальных проблем -старения, стресса, нервно-психических, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний Возрастающий интерес при изучении указанных аспектов привлекают белковые факторы, которые могут не только ингибировать клеточную пролиферацию, но и активировать программируемую гибель клеток. Исследование биологической активности таких факторов представляет большой интерес не только ввиду их антипролиферативных свойств, но и вероятной роли в обеспечении интегративных функций нервной, гормональной и сердечно-сусудистой систем, поскольку пептидные фрагменты, входящие в состав факторов дифференцировки могут выступать в роли регуляторных пептидов.
К числу таких факторов относится белок HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor) Он выявляется как в крови, так и в нервной системе млекопитающих и содержит в своей структуре активные пептидные фрагменты -ингибиторы пролиферации и активаторы апоптоза клеток. HLDF был выделен из культуральной среды клеток HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека, индуцированных ретиноевой кислотой, и представляет собой белковый фактор, обладающий способностью останавливать пролиферацию исходных клеток, вызывая их дифференцировку по гранулоцитарному пути (Костанян и др., 1995). В ходе изучения этого фактора были идентифицированы два активных фрагмента, входящих в его состав: октапептид HLDF-8, обладающий ДНК/РІІК-гидролизующей активностью, и гексапептид HLDF-6, обладающий дифференцирующей активностью полноразмерного фактора и проявляющий ряд иных биологических эффектов.
Проведенные ранее исследования показали, что эффекты пептида HLDF-6 in vivo проявлялись главным образом у самцов животных и были недостоверны или Рос і' : .х ":>..»! \Я
1;".';".'* і
амСиЧ
отсутствовали у самок (Гончаренко и др., 2002, Федосова и др., 2002). На основании этих данных, а также данных о способности пептида имитировать эффекты тестостерона в отношении гормонозависимых опухолей, нами быле сделано предположение о том, что пептид способен влиять на биосинтез или метаболизм мужских половых гормонов, обладая андрогенной и адренокортикотропной активностью. Кроме того, данные о вовлеченности факторов дифференцировки в развитие ишемических церебральных нарушений (Шерстнев и др., 2002) позволили предположить наличие собственной і емодинамической активности у пептидов HLDF.
Цель работы
Целью данной работы являлось изучение андрогенной, адренокортикотропной и гемодинамической активности пептидных фрагментов фактора дифференцировки HLDF.
Задачи исследования
Изучение влияния пептида HLDF-6 на уровень половых гормонов, массу тела и придаточных половых желез, а также поведенческие реакции, зависимые от уровня андрогенов у самцов мышей NMRI.
Определение роли гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы в реализации андрогенных эффектов пептида HLDF-6.
Исследование адренокортикотропной активности пептида HLDF-6 и его влияния на физиологические реакции, зависимые от уровня кортикостероидов у самцов и самок крыс Wistar.
Выявление гемодинамической активности у пептидов HLDF-6, HLDF-8, HLDF-14 и HLDF-24 из фактора дифференцировки клеточной линии HL-60.
Научная новизна работы
Впервые получены данные о наличии у пептида HLDF-6 андрогенной активности. Показано влияние пептида на морфологию придаточных поповых желез, двигательную и половую активность, уровень агрессии и степень болевой чувствительности у животных. Установлено, что данная активность связана как с изменением уровня эндогенных половых стероидов, так и путей их метаболизма Обнаружена адренокортикотропная активность пептида HLDF-6. Показано, что андрогенная активность пептида у гонадэктомированных животных связана с
активацией процессов стероидогенеза в коре надпочечников, и что действие пептида на кору надпочечников является прямым, не зависящим от гормонов гипоталамо-гипофизарной системы.
Впервые обнаружена гемодинамическая активность у пептидов из фактора дифференцировки HLDF Показана взаимосвязь структуры пептидов и их активности Продемонстрированы различия в эффектах пептидов у нормотензивных и гипертензивных животных.
Научно-практическое значение
Полученные результаты могут быть использованы при создании новых лекарственных средств, направленных на коррекцию патологий, связанных с нарушением метаболизма стероидных гормонов и патологий сердечно-сосудистой системы, а также должны учитываться в качестве побочных эффектов при создании других лекарственных препаратов на основе белковых факторов, обладающих антипролиферативной активностью
Апробация работы
Результаты работы докладывались и обсуждались на VI чтениях, посвященных памяти академика Ю.А Овчинникова (Москва-Пущино, 2002), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003); Третьей всероссийской школе-конференпии по физиологии кровообращения (Москва, 2004); XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005); а также отчетных конференциях ФИБХ РАН (Пущино, 1999 - 2004).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, 2 из них в отечественных и зарубежных журналах
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на ІЗ ^страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Материал иллюстрирован о таблицами и « рисунками. Список цитированной литературы содержит.^?/ работ.
Противоопухолевая активность пептида HLDF
Поскольку пептид HLDF-6 обладал ярко выраженными дифференцирующими и антиростовыми свойствами, было проверено его противоопухолевое действие in vivo. Для этого была получена биологическая модель, морфологически адекватная весьма распространенной человеческой онкопатологии, известной под названием синдрома Рустицкого-Калера, или миеломной болезни, относящейся к группе опухолей кроветворной ткани, или гематобластозам (Костанян и др., 2000), В ходе экспериментов на мышах было показано, что по мерс увеличения числа инъекций пептида у всех подопытных животных наблюдалось постепенное уменьшение размеров опухолей с полным распадом опухолевой ткани после 10 инъекций. У контрольных мышей в эти же сроки отмечался прогрессирующий рост опухоли, заканчивавшийся летальным исходом. В случае применения пептида HLDF-б на стадии нсобластического ростка установлено полное купирование развития онкопроцесса без возникновения рецидива в течение полугода,
Полученные в ходе дальнейших исследований поликлональные антитела против фактора дифференцировки HLDF и его фрагмента HLDF-8 обладали способностью в различной степени связываться со злокачественными и доброкачественными клетками. Было показано, что фактор дифференцировки можно использовать как иммуногистохимический маркер ранних неопластических процессов (Драницына и др., 2000). В ходе предварительных экспериментов была показана его чрезвычайно высокая эффективность по сравнению с ныне используемыми маркерами в выявлении ранних стадий неопластических трансформаций. Таким образом, еще одним перспективным направлением в изучении фактора дифференцировки является использование антител к HLDF для разработки диагностических методов по определению рака на самых ранних стадиях и внедрения этой технологии в онкохирургию.
Неспецифический характер взаимодействия HLDF-6 с биолипидами дает основания предположить, что этот пептид может изменять физико-химические свойства мембран не только клеток HL-60, но и других клеток, модифицировать чувствительность их липидного компонента к пероксидации, а также влиять на связывание различных биологически активных соединений с биомембранами. Не исключено, что подобным образом HLDF-6 может модулировать течение важных физиологических и адаптационных процессов, как на клеточном, так и на организмешюм уровне, а также изменять устойчивость биологических объектов к воздействиям, вызывающим нарушения процессов пролиферации и дифференцировки клеток или интенсификацию процессов перекисного окисления липидов в организме.
При изучении влияния пептида HLDF-6 на раннее доимплантационное развитие эмбрионов мышей in vivo было обнаружено, что пептид благотворно влияет на зародыши, находящиеся в процессе дробления, но не оказывает никакого воздействия на их дифференцировку. Эти результаты позволили предположить, что пептид может выполнять роль своеобразного фактора выживания (Сахарова и др., 2000). Для проверки этого предположения было исследовано влияние HLDF-6 и его 7-членного Туг-аналога на жизнеспособность клеток HL-60 в условиях холодового шока. Инкубация клеток линии HL-60 при пониженной температуре приводит к достоверному понижению числа жизнеспособных клеток. Известно, что в условиях холодового стресса индуцируется апоптоз клеток HL-60, сопровождающийся фрагментацией ядерной ДНК (Gregory and Milner, 1994), и избирательным окислением фосфатидилсерина, локализованного с внутренней стороны мембранного бислоя и ответственного за взаимодействие мембраны с элементами цитоскелета (Fabisiak et al., 1997). Прибавление пептида HLDF-6 в среду культивирования полностью предохраняло клетки от гибели при часовой продолжительности холодового стресса, но оказывало лишь частичный защитный эффект в случае 2-часовой инкубации клеток при пониженной температуре (Гончаренко и др., 2002). После введения в структуру пептида дополнительного остатка тирозина (пептид HLDF-Y), его протекторное влияние имело тенденцию к возрастанию.
Известно, что некоторые гистидинсодержащие пептиды могут служить своеобразными ловушками пероксильных, гидроксильных радикалов, синглетного кислорода, супероксиданиона и ряда промежуточных продуктов перекисного окисления липидов (Boldyrev et al., 1997; Дупин и др., 1987). HLDF-6 и HLDF-Y содержат в своем составе остаток гистидина. Не исключено, что они также способны нейтрализовать активные формы кислорода и ингибировать развитие процессов ПОЛ, вследствие чего повышение устойчивости клеток HL-60 к холодовому шоку может быть обусловлено не только влиянием HLDF-6 и HLDF-Y на физико-химические характеристики биомембран, но и антирадикальными и прямыми антиоксидантными эффектами этих пептидов.
Исследование способности HLDF-6 и HLDF-Y повышать устойчивость организма к стрессорным воздействиям проводили также в опытах по кратковременному переохлаждению животных. В этих экспериментах влияние HLDF-6 и HLDF-Y на стресс-реакцию организма оценивали по биохимическим показателям (содержанию адреналина, норадреналина, 11-кортикостероидов в надпочечниках и серотонина в селезенке), характеризующим состояние системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники и симпатико-адреналовой системы после холодового воздействия, вызывавшего гибель 15-20% животных в контрольной группе (Гончаренко и др., 1995). Через 40 мин после действия холода в селезенке и надпочечниках самцов животных наблюдали повышение уровня всех исследуемых биологически активных веществ, тогда как у самок крыс было отмечено лишь понижение содержания серотонина в селезенке. Эти определяемые полом различия в характере изменения содержания катехоламинов, кортикостеродов и серотонина, вероятнее всего, обусловлены различной скоростью развития стресс-реакции у самцов и самок животных. HLDF-6 достоверно не влиял на сдвиги в содержании этих биогенных веществ, вызываемые переохлаждением животных, тогда как HLDF-Y при инъекции самцам крыс за 4 часа до холодового воздействия проявлял способность нормализовать содержание биогенных аминов и кортикостероидов в тканях подопытных животных. В то же время, HLDF-Y не оказывал какого-либо заметного влияния на эти биохимические показатели у самок крыс (Гончаренко и др., 2002). Обнаруженная способность HLDF-Y сглаживать ответную реакцию системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники и симпатико-адреналовой системы организма на холодовое воздействие, а также повышать устойчивость животных к холодовому шоку свидетельствует об адаптогенной активности данного пептида.
В результате проведенной оценки противолучевой активности исследуемых пептидов было обнаружено, что под влиянием HLDF-Y одновременно с устойчивостью к действию холода повышается и радиорезистентность животных. Дальнейшее изучение на клеточном и оргапизменном уровне адаптогенных и радиопротекторных свойств синтезированных аналогов HLDF-6 имеет не только самостоятельное значение, но и представляет особый интерес в связи с перспективностью использования этих пептидов в терапии рака в качестве дополнения к средствам радио- и химиорадиотерапии (Костанян и др., 2000),
Участие факторов дифференцировки и апоптоза в развитии патологий сердечно сосудистой системы
Андрогены, оказывая выраженное анаболическое действие на обмен азота и кальция, ускоряют рост тканей у молодых животных. Это проявляется в значительном повышении синтеза ядерных ДНК и РНК в тканях-мишенях, ускорении транслокации ядерной РНК в цитоплазму и стимулирование синтеза специфических цитоплазматических рибосомальных белков. Андрогены проявляют анаболический эффект в отношении практически всех тканей и органов млекопитающих (Crowley and Matt, 1996; Hastings and Hill, 1997), причем наиболее выражен этот эффект у самого тестостерона или его ароматизированного производного - 19-нортестостерона, тогда как дигидротестостерон в большей степени проявляет андрогенные свойства, обладая слабым анаболическим действием (Fennell at al., 1992). Показано также прямое анаболическое действие тестостерона на мышечные клетки in vitro. Этот эффект был специфичным для тестостерона, поскольку эстрадиол, андростендион и дигидротестостерон не проявляли такой активности (Powers et al., 1975). В работах других авторов (Kemnltz et al., 1988) было показано, что и тестостерон и дигидротестостерон являются эффективными анаболическими гормонами.
Имеющиеся литературные данные говорят о различиях во влиянии тестостерона и его метаболитов на придаточные половые железы. Так, существует мнение, что на рост и развитие семенных пузырьков действует собственно тестостерон, а в предстательной железе основным действующим андрогеном является дигидротестостерон (Хэм и др., 1983). У кастрированных крыс заместительная терапия тестостероном предотвращала уменьшение массы простаты и семенных пузырьков, а превышение физиологических концентраций тестостерона приводило к гипертрофии этих органов (Vanderschueren et al., 2000). Известно, что в простате действие тестостерона зависит от возможности его конверсии в биоактивные метаболиты - дигидротестостерон и 17бета-эстрадиол посредством 5альфа-редуктазы и ароматазы, соответственно. ДГТ синтезируется в простате из циркулирующего в крови тестостерона при помощи фермента 5альфа-редуктазы (ЕС 1.3.99.5), который существует в двух изоформах, 5aRl и 5aR2. Обе изоформы обнаружены в простате, причем первая экспрессируется главным образом эпителиальными клетками, тогда как вторая присутствует и в эпителии и в клетках стромы (Torres et al., 2003). Экспериментальная гиперплазия простаты может вызываться хроническим (21 день) введением тестостерона (Mitra et al., 1999), тогда как ингибиторы 5альфа-редуктазы вызывают уменьшение массы простаты у интактных крыс, а также препятствуют тестостерон-зависимому восстановлению массы простаты у кастрированных крыс (Dadras et al., 2001).
С тех пор как было показано, что большинство видов опухолей простаты являются андрогензависимыми, было предложено множество видов антиандрогенной терапии для борьбы с этим недугом (Ideyama et al., 1998). Агонисты гонадотропин-релизинг гормона (ГпРГ) являются общепризнанной медицинской альтернативой орхидэктомии в лечении рака простаты ввиду их выраженной способности подавлять синтез тестикулярного тестостерона (Labrie et al., 1993). Тем не менее, ни агонисты ГнРГ, ни орхидэктомия не устраняют продукцию андрогенов надпочечниками, таких как дегидроэпиандростерон, его сульфат и андростендион. Андрогены надпочечников превращаются в тестостерон или дигидротестостерои в периферических тканях. Концентрация этих гормонов в простате достигает, соответственно, 25 % и 10 % от контрольного уровня даже после трехнедельного введения агонистов ГнРГ (Forti et al., 1989). Совместное применение агонистов ГнРГ или орхидэктомии с антиандрогенами (флутамид, нилутамид) давало больший эффект, чем применение каждого вида терапии в отдельности (Crawford et al., 1989; Labrie et al., 1993). Также было показано, что андрогены надпочечников способны активировать мутаптные андрогенные рецепторы, которые экспрессируются в андроген-зависимых опухолевых клетках простаты (Culig et al., 1993; Tan et al., 1997). Замена одного валина на метионин в андрогешюм рецепторе приводит к активации рецептора не только тестикулярными, но и надпочечпиковыми андрогенами. Такая модель активации андрогенных рецепторов может играть значительную роль в прогрессии опухолеобразования в простате. Эти данные убедительно доказывают важное значение андрогенов надпочечников в стимуляции неопластических процессов.
Действие андрогенов на половые органы и ткани, помимо отмеченных выше эффектов, вызывает увеличение в составе семенной плазмы доли богатого белком секрета семенных пузырьков (содержащего фруктозу, лимонную кислоту, аскорбиновую кислоту, холин, глицерофосфорилхолин, простагландини и протеинкиназы). Исследования, проведенные in vitro на срезах семенных пузырьков крысы, показали, что секреторный эффект тестостерона является прямым и что при этом происходит фосфорилирование цитоплазматических компонентов (Gonzales, 2001; Carpino et al., 1994; Zalata et al., 1995). Секрет находится либо в секреторных гранулах, либо в лизосомах и освобождается в среду. Содержание фруктозы в секрете семенных пузырьков увеличивается при стимуляции тестостероном; это связано с повышением активности двух ферментов - альдозоредуктазы и кеторедуктазы. Фруктоза семенной плазмы используется сперматозоидами как источник энергии. Что касается зависимости сперматогенеза от тестостерона, точная роль гормона в этом процессе не установлена. Возможно, действие тестостерона проявляется на относительно поздних стадиях сперматогенеза, поскольку в незрелых семенниках этот гормон не индуцирует сперматогенеза и, кроме того, не восстанавливает способности к образованию спермы у гипофизэктомированных животных, у которых эта функция репрессирована (Марри и др., 1993).
У самцов многих видов млекопитающих циркулирующие в крови андрогены исключительно важны для формирования полового поведения и одновременно агрессивности. Половое влечение самцов напрямую зависит от гормонального фона организма и коррелирует с уровнем тестостерона в крови (Bonilla-Jaime et al., 2003). Причем известно, что сексуальная активность у самцов зависит не только от уровня андрогенов, но и от уровня эстрогенов (Wersinger et al., 1997, Гладкова, 1999, Pettersson et al., 2001).
Увеличение уровня агрессии обычно связывают с увеличением в крови концентрации тестостерона. Однако, известно, что тестостерон стимулирует агрессивное поведение только у мышей дикого типа, тогда как не проявляет такой активности у мышей с дефицитом 5а-редуктазы (Frye et al., 2002). Поэтому наиболее вероятным андрогеном, способствующим проявлению агрессии у самцов, представляется дигидротестостерон - метаболит тестостерона, образующийся в организме посредством фермента 5а-редуктазы.
Кастрация приводит к уменьшению концентрации в крови и тканях тестостерона и его производных, что сопровождается изменениями в поведении кастрированных животных в сторону -"женского фенотипа. У таких самцов увеличено латентное время нахождения в центре арены и время груминга, тогда как количество активных передвижений и стоек резко уменьшено. Кроме того, моторную активность способны снижать ингибиторы 5а-рсдуктазы (Frye et al., 2004), что также продемонстрировано на нокаутных животных, лишенных этого фермента (Wilson, 2001). Известно, что изменение уровня женских половых гормонов также оказывает влияние на поведение животных. Так, введение эстрадиола овариэктомированным крысам и мышам приводило к усилению тревожного поведения и снижению общей локомоторпой активности (Morgan and Pfaff, 2001, 2002). Груминг также является тестостерон-зависимой формой поведения, его проявления снижены при возрастании уровня тестостерона в крови. Фактически на груминг влияет не сам тестостерон, а его активные метаболиты: ДГТ уменьшает длительность груминга, тогда как эстрогены увеличивают ее (Spruijtetal., 1992).
Изучение половой активности самцов мышей
Результаты исследования пептида HLDF-6 на массу тела и придаточных половых желез у мышей NMRI представлены на рисунке 8. У группы ложнооперированных животных, получавших NaCl, был отмечен прирост веса тела к концу эксперимента на 6,0 ± 0,8 % относительно исходного веса. У кастрированных животных в ходе эксперимента наблюдалось снижение массы тела относительно исходных показателей на 7,3 ± 0,6 % у кастратов, получавших пептид HLDF-6 и на 7,9 ± 1,0 % у кастратов, получавших NaCI. При этом статистически значимых различий между этими двумя группами животных не было выявлено, У группы ложнооперированных мышей, получавших пептид, было зарегистрировано уменьшение прироста веса тела (2,3 ± 1,2 %) по сравнению с группой ложнооперированных, получавших NaCl (6,0 ± 0,8 %).
Помимо изменения массы тела у кастрированных животных было зарегистрировано резкое снижение массы придаточных половых желез. Так, масса семенных пузырьков у кастрированных мышей, получавших NaCl, составила 0,076 ± 0,006 % от массы тела, тогда как у ложнооперированных мышей этот показатель составил 0,639 ± 0,034 % от массы тела, У кастрированных животных, получавших пептид HLDF-6, отмечалось небольшое статистически значимое увеличение массы семенных пузырьков относительно кастратов, получавших NaCl, до 0,102 ± 0,007 %. Однако, относительно контрольной группы этот показатель оставался сильно пониженным. Ведение пептида HLDF-6 ложнооперированным животным не вызвало изменений массы семенных пузырьков (0,620 ± 0,041 % от массы тела).
Масса предстательной железы также снижалась после кастрации. У группы кастрированных мышей, получавших NaCl, этот показатель был снижен до 0,069 ± 0,005 % от массы тела относительно 0,301 ± 0,017 % у ложнооперированных животных. После хронического внутрибрюшинного введения пептида HLDF-6 масса простаты у кастрированных мышей статистически значимо возрастала относительно кастратов, получавших NaCl, до 0,091 + 0,006 %. Так же как и масса семенных пузырьков, масса предстательной железы у животных, получавших пептид, не достигала контрольных значений. Ведение пептида HLDF-6 ложнооперированным животным, также как и в случае семенных пузырьков, не приводило к возрастанию массы простаты (0,284 ± 0,009 % от массы тела).
Таким образом, нами было зарегистрировано снижение массы тела, простаты и семенных пузырьков у кастрированных животных относительно ложнооперированных животных. Введение пептида HLDF-6 кастрированным мышам приводило к достоверному увеличению массы придаточных половых желез, которое, однако, не достигало контрольного уровня. Кроме того, исходя из изменений массы тела, следует заключить, что пептид HLDF-6 не проявлял анаболического эффекта у кастратов, а у ложнооперированных животных даже вызывал уменьшение прироста веса тела.
Андрогены проявляют анаболический эффект в отношении практически всех тканей и органов млекопитающих, причем наиболее выражен этот эффект у самого тестостерона или его эротизированного производного - 19-нортестостерона, тогда как дигидротестостерон в большей степени проявляет андрогенные свойства, обладая слабым анаболическим действием (Fennell at al., 1992). Показано также прямое анаболическое действие тестостерона на мышечные клетки in vitro. Этот эффект был специфичным для тестостерона, поскольку эстрадиол, андростендион и дигидротестостерон не проявляли такой активности. (Powers et al., 1975). В работах других авторов (Kemnitz et al., 1988) было показано, что и тестостерон и дигидротестостерон являются эффективными анаболическими гормонами. Поскольку у исследуемого пептида анаболические свойства не были выражены, то следует предположить, что пептид HLDF-6 либо не влияет на продукцию эндогенных анаболических стероидов, либо их эффекты маскируются другими стероидными гормонами, обладающими катаболическими эффектами.
В наших экспериментах пептид HLDF-б вызывал увеличение массы простаты и семенных пузырьков у кастрированных мышей. Таким эффектом могут обладать препараты тестостерона. У кастрированных крыс заместительная терапия тестостероном предотвращала уменьшение массы простаты и семенных пузырьков, а превышение физиологических концентраций тестостерона приводило к гипертрофии этих органов (Vanderschueren et al., 2000). Поэтому, на основании наших результатов можно предположить, что исследуемый пептид способен повышать продукцию эндогенного тестостерона. о4 0,8-і
Морфологические различия в тканях семенных пузырьков и предстательной железы отражены на рисунке 9. Секреторный эпителий семенных пузырьков мышей контрольной группы (ложнооперированные животные, получавшие NaCl) имеет типичный цилиндрический вид, ядро расположено у базальной поверхности клетки, в цитоплазме краевой части видны светлые округлые гранулы секрета. После кастрации эпителий переходит в кубическую форму, ядро оказывается в середине клетки, гранулы секрета не выявляются. Эпителиоциты семенных пузырьков кастрированных мышей, получавших пептид HLDF-6, представляют собой промежуточную стадию между контролем и кубическим эпителием кастратов. Клетки имеют несколько вытянутую форму, ядро находится в базальной части, в цитоплазме выявляются немногочисленные светлые гранулы. Морфологических изменений в тканях семенных пузырьков у ложнооперированных мышей, получавших пептид, не наблюдалось.
В ткани предстательной железы после кастрации нарастает количество апоптотических телец, мелких округлых клеток со светлой цитоплазмой и темным, компактным, часто фрагментированным ядром. На фоне введения HLDF-6 кастрированным животным количество апоптотических телец визуально оставалось прежним. Также не было отмечено визуальных отклонений от нормы у ложнооперированных животных, получавших пептид.
Морфологические изменения в тканях были также оценены количественно. Как видно из рисунка 10, высота секреторных эпнтелиоцитов семенных пузырьков у кастрированных животных снижалась до 8,1 ± 0,8 мкм по сравнению с 12,5 ± 1,1 мкм у ложнооперированных животных. На фоне применения HLDF-6 наблюдалась тенденцию к нормализации этого параметра. У кастрированных животных, получавших пептид HLDF-6, высота эпителия семенных пузырьков составила 10,0 ± 0,8 мкм, у ложнооперированных, получавших пептид - 12,2 + 1,1 мкм,
Влияние пептида HLDF-6 на уровень кортикостероидов в крови у гипофизэктомированных самцов и самок крыс Wistar
Проведенные ранее исследования показали, что эффекты пептида HLDF-6 in vivo проявлялись главным образом у самцов животных и были недостоверны или отсутствовали у самок, несмотря на то, что экспрессия HLDF показана у животных обоих полов (Гончаренко и др., 2002). На основании этих данных, а также данных о способности пептида имитировать эффекты тестостерона в отношении гормопозависимых опухолей, нами было сделано предположение о том, что пептид способен влиять на биосинтез или метаболизм мужских половых гормонов, или же способен модулировать эффекты половых гормонов в отношении клеток-мишеней. Поэтому одним из этапов нашего исследования являлось изучение андрогенной активности пептида HLDF-6.
Наши исследования, проведенные на гонадэктомированных животных с исходно низким уровнем тестостерона, показали, что под действием пептида восстанавливаются лишь некоторые андрогензависимые функции организма, и что эффекты пептида зависят от исходного уровня половых гормонов, различаясь у кастрированных и ложнооперированных животных. Это говорит о возможном влиянии пептида не только на биосинтез тестостерона, но и на дальнейшее превращение его в активные метаболиты.
Как известно, эффекты тестостерона и его производных заключаются не только во влиянии на развитие и функцию половых желез, но и в анаболических эффектах в отношении скелетно-мышечной, сердечно-сосудистой и других систем, а присутствие андро генных рецепторов в ЦНС обусловливает влияние тестостерона не только половое поведение, но и на уровень агрессии, двигательную и исследовательскую активность, уровень тревожности, а также болевую чувствительность. Кроме того, известно, что многие андрогензависимые функции регулируются не самим тестостероном, а его более активными метаболитами; например, мужское половое поведение регулируется не только тестостероном, но и эстрадиолом, а на уровень агрессии влияет главным образом ДГТ (Wersinger et al., 1997, Гладкова, 1999, Pettersson et al., 2001, Frye et al., 2002).
Прежде всего, в наших экспериментах было отмечено изменение уровня биологически активных стероидов в крови. Как и ожидалось, кастрация приводила к значительному снижению уровня тестостерона, при неизменном уровне кортикостерона и эстрадиола. Пептид HLDF-6 увеличивал уровень тестостерона и кортикостерона как у кастрированных, так и ложнооперированных мышей. Однако уровень эстрадиола увеличивался только у кастрированных животных. У самцов основная продукция циркулирующего в крови тестостерона приходится на клетки Лейдига семенников и незначительная часть - на сетчатую зону коры надпочечников. Иная ситуация наблюдается у кастрированных животных: единственной стероидогенной тканью у них является кора надпочечников, поэтому наблюдаемое нами повышение уровня тестостерона у кастратов является следствием активации процессов стероидогенеза в коре надпочечников. Подтверждением этому является возрастание под действием пептида уровня кортикостерона - основного глюкокортикоида у мышей (Harvey et al., 1994). Однако у ложнооперированных самцов столь значительное повышение уровня тестостерона нельзя отнести только за счет коры надпочечников; вероятно пептид способен влиять в той же мере и на клетки Лейдига семенников. Эстрадиол также является одним их основных метаболитов тестостерона. Около 15 % циркулирующего в крови самцов эстрадиола тестикулярного происхождения, тогда как остальная часть образуется в результате ароматизации тестостерона в периферических тканях, главным образом простате, костном мозге и некоторых отделах головного мозга (Simpson et al., 1999; Hutchison et al., 1997; Schlinger and Arnold, 1993). Наблюдаемое увеличение уровня эстрадиола у кастрированных мышей может быть следствием активации ароматазной активности в периферических тканях. Мы также предполагаем, что существует какой-то фактор тестикулярного происхождения, препятствующий активации ароматазы и возрастанию уровня эстрадиола у ложнооперированых животных.
Изменение уровня половых гормонов неизбежно влечет за собой изменение андрогензависимых функций, прежде всего полового поведения (Batty, 1978; Morley, 2003; Bonilla-Jaime et al., 2003), У кастрированных самцов мы наблюдали резкое снижение сексуальной активности вследствие значительного снижения уровня тестостерона. Пептид повышал уровень тестостерона, и следствием этого являлось увеличение половой активности самцов как в кастрированной, так и в ложнооперированной группах.
В отличие от половой активности, уровень агрессии регулируется главным образом не самим тестостероном, а его активным метаболитом -дигидротестостероном, который образуется в периферических тканях в результате активности 5альфа-редуктазы (Frye et al., 2002; Gravance et al., 1996). Пептид снижал агрессивность ложнооперированных самцов и не влиял на уже сниженный уровень агрессии у кастратов. Аналогичным эффектом обладают ингибиторы 5альфа-редуктазы. Поскольку наш пептид продемонстрировал противоположные эффекты в отношении полового поведения и уровня агрессии, то можно заключить, что пептид способен оказывать влияние на метаболизм тестостерона посредством угнетения активности 5альфа-редуктазы при одновременной активации биосинтеза тестостерона.
Другим параметром, зависящим от уровня тестостерона, является степень болевой чувствительности. Показана связь тестостерона с серотониновой частью антиноцицептивной системы. Было показано возрастание экстрацеллюлярной концентрации серотонина в задних рогах поясничного отдела спинного мозга крыс после кастрации или после введения флутамида. Наоборот, повышение уровня тестостерона в крови и ликворе ассоциируется со снижением концентрации серотонина и, как результат, понижением болевого порога. (Nayebi et al., 2004). Наши наблюдения находятся в соответствии с литературными данными; кастрация вызывает анальгезию, тогда как применение пептида восстанавливает уровень болевой чувствительности в результате стимуляции пептидом HLDF-6 стероидогенеза и повышения уровня тестостерона.
Кастрация приводит к уменьшению концентрации в крови и тканях тестостерона и его производных, что сопровождается изменениями в поведении кастрированных животных в сторону женского фенотипа (Svensson et al., 2003). У таких самцов увеличено латентное время нахождения в центре арены и время груминга, тогда как количество активных передвижений и стоек резко уменьшено. Грум инг является тестостерон-зависимой формой поведения, его проявления снижены при возрастании уровня тестостерона в крови. Фактически на груминг влияет не сам тестостерон, а его активные метаболиты: ДГТ уменьшает длительность груминга, тогда как эстрогены увеличивают ее (Spruijt et al., 1992).
