Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
1. Идентификация фактора PEDF в различных типах клеток 9
1.1. Идентификация PEDF в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза человека 9
1.2. Идентификация PEDF (ЕРС-1) в культуре легочных фибробластов. Зависимость уровня экспрессии PKDF от возраста клеточной культуры 12
1.3. Идентификация PEDF мыши (каспина - коллаген-связывающего серпина) 15
2. Особенности структуры PEDF и кодирующего его гена 16
2.1. Установление первичной структуры PEDF человека и его кДНК 16
2.2. Принадлежность PEDF к семейству нсингибиторных серпинов 18
2.3. Наличие в PEDF связи, высокочувствительной к действию сериновых протеиназ 20
2.4. Асимметричное расположение положительных и отрицательных зарядов в молекуле PEDF. Кристаллическая структура PEDF 22
2.5. Строение и свойства гена^е^человека 25
2.6. Распространенность и эволюционная консервативность фактора PEDF 26
2.7. Рекомбинантный PEDF 28
3. Дифференцирующее действие PEDF и его влияние на метаболизм 29
3.1. Дифференцирующее действие PEDF на эмбриональные ткани. Влияние PEDF на метаболизм глиальных клеток 30
3.2. Дифференцирующее действие PEDF на опухолевые клетки 32
3.3. Влияние PEDF на накопление меланина и активность тирозиназы в клетках пигментного эпителия сетчатки глаза 33
4. Нейропротекторное действие PEDF 34
4.1. Протекторное действие PEDF на нейроны сетчатки глаза 35
4.2. Протекторное действие PEDF на гранулярные клетки мозжечка крыс 36
4.3. Протекторное действие PEDF на нейроны гиппокампа 38
4.4. Протекторное действие PEDF на двигательные нейроны спинного мозга 39
5. Антиангиогенное действие PEDF 40
5.1. Корреляция уровня PEDF и VEGF с ангиогенсзом в сетчатке. Влияние содержания кислорода в окружающей среде на экспрессию PEDF 41
5.2. Изменения уровня PEDF при зрительных патологиях, связанных с избыточным ангиогенезом 43
5.3. Возможные механизмы антиангиогенного действия PEDF 46
6. Взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами PEDF.
2 Результаты и обсуждение 53
1. Идентификация гомологичных фрагментов молекул факторов HLDF и PEDF, отвечающих за их дифференцирующее действие на клетки HL-60 и эктодерму эмбрионов Xenopus laevis на стадии ранней гаструлы 54
1.1. Структурная гомология фрагментов молекул факторов HLDF и PEDF. Сравнительное изучение дифференцирующего действия факторов HLDF и PEDF на клетки линии HL-60 54
1.2. Сравнительное изучение индукционного действия факторов HLDF и PEDF, а также пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на эктодерму эмбрионов X. laevis 60
2. Сравнительное изучение протекторного действия пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на нейроны червя мозжечка крыс и клетки линии HL-60 при индуцированной химической гипоксии 63
2.1. Протекторное действие пептидов на клетки червя мозжечка крыс. Восстановление под действием пептидов поведенческих реакций, нарушаемых при химической гипоксии червя мозжечка 64
2.2. Влияние пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на выживаемость клеток линии HL-60 при индуцируемой химической гипоксии 71
3. Изучение молекулярных механизмов действия пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на клетки линии HL-60 73
3.1. Определение характера взаимодействия пептидов с клетками. Влияние пептидов на подвижность липидов в мембранных системах 73
3.2. Влияние пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на активность аденилатциклазы в клетках линии HL-60 и выделенных клеточных мембранах 75
3.3. Влияние пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на активность фосфатидилинозитол-слецифической фосфолипазы С 80
4. Компьютерное моделирование пространственной структуры PEDF. Регуляторная роль протеолиза связи L- Т в молекуле PEDF 84
5. Роль фактора PEDF в индукционном действии стекловидного тела глаза быка на эктодерму эмбрионов Xenopus laevis 90
3 Экспериментальная часть 95
1. Материалы 96
1.1. Реактивы 96
1.2. Сорбенты 97
1.3. Протеолитические ферменты 98
1.4. Факторы дифференцировки, антитела, клеточные линии 98
1.5. Буферные растворы 98
1.6. Растворы для индукции дифференцировки эмбрионов Xenopus laevis и гистологической обработки тканей 99
2. Методы 101
2.1. Культивирование клеток линии HL-60 101
2.2. Определение дифференцирующей активности 101
2.3. Исчерпывающий гидролиз белков смесью трипсина и а-химотрипсина 102
2.4. Синтез пептидов 102
2.5. Дополнительная хроматографическая очистка синтезированных пептидов 102
2.6. Индукция дифференцировки эктодермы эмбрионов Xenopus laevis на стадии ранней гаструл ы 103
2.7. Гистологическая обработка дифференцированной эктодермы Xenopus laevis 104
2.8. Содержание экспериментальных животных 104
2.9. Изучение влияния пептидов на поведенческие реакции крыс, зависимые от функций червя мозжечка 104
2.10. Определение количества гиперхромных клеток Пуркиньс червя мозжечка крьіс 106
2.11. Определение количества жизнеспособных клеток HL-60 методом МТТ-теста 107
2.12. Радиолигандный анализ 107
2.13. Получение липосом, содержащих флуоресцентный зонд 108
2.14. Изучение влияния пептидов на анизотропию поляризации флуоресценции зондавлипосомах 108
2.15. Хроническая морфинизация клеток HL-60 109
2.16. Выделение и солюбилшация мембран клеток HL-60 109
2.17. Изучение влияния пептидов на активность аденилатциклазы в клетках HL-60 и препарате выделенных мембран клеток HL-60 110
2.18. Определение количества цАМФ в пробах 111
2.19. Определение внутриклеточной концентрации инозитолмоно- и дифосфатов в клетках линии HL-60 111
2.20. Выделение стекловидного тела глаза быка 112
2.21. Измерение концентрации белка методом Бредфорд 112
2.22. Определение N-концевых аминокислотных последовательностей 113
2.23. SDS-'злектрофорез белков в поли акри ламидном геле 113
2.24. Компьютерное моделирование пространственной структуры молекулы PEDF ИЗ
2.25. Статистическая обработка экспериментальных результатов 114
Выводы 116
- Идентификация PEDF (ЕРС-1) в культуре легочных фибробластов. Зависимость уровня экспрессии PKDF от возраста клеточной культуры
- Дифференцирующее действие PEDF на эмбриональные ткани. Влияние PEDF на метаболизм глиальных клеток
- Изменения уровня PEDF при зрительных патологиях, связанных с избыточным ангиогенезом
- Сравнительное изучение индукционного действия факторов HLDF и PEDF, а также пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на эктодерму эмбрионов X. laevis
Введение к работе
Одной из актуальных проблем современной биоорганической химии является поиск и структурно-функциональные исследования новых белковых факторов дифференцировки. Нарушение процессов нормального созревания клеток и их превращения в дифференцированные, функционально активные формы является ключевой стадией патогенеза многих злокачественных новообразований. Вещества, индуцирующие дифференцировку клеток, находят широкое применение в терапии опухолей как сами по себе, так и в сочетании с цитостатиками - агентами, вызывающими гибель делящихся клеток.
Как правило, белковые факторы дифференцировки представляют собой относительно крупные молекулы. Для (Многих из них помимо способности индуцировать дифференцировку клеток показано наличие целого ряда других биологических активностей. К таким многофункциональным факторам дифференцировки относятся факторы HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor) и PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor).
Фактор HLDF с молекулярной массой 8,2 кДа ингибирует пролиферацию клеток промиелоцитарной лейкемической линии человека HL-60 и индуцирует их дифференцировку в зрелые гранул оциты, а также повышает выживаемость клеток этой линии при различных повреждающих воздействиях. Фактор PEDF с молекулярной массой 50,1 кДа является фактором дифференцировки опухолевых клеточных линий нейронального происхождения и эмбриональных нейронов. Он также обладает нейропротекторным и аитиангиогенным действием, является регулятором клеточного цикла и апоптоза. При сравнительном компьютерном анализе первичных структур факторов HLDF и PEDF были обнаружены гомологичные области молекул этих факторов; данная область фактора HLDF содержит фрагмент, отвечающий за его дифференцирующее и протекторное действие.
Установление взаимосвязи структурных особенностей белка и его функциональных характеристик имеет принципиальное значение для понимания молекулярных механизмов его функционирования. Перспективным подходом для изучения белков с широким спектром активностей является исследование их коротких фрагментов, обладающих биологической активностью.
Данная работа является частью структурно-функциональных исследований, проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, направленных на изучение механизмов действия фактора дифференцировки HLDF и пептида HLDF-6, соответствующего фрагменту молекулы HLDF 41TGENHR4t , обеспечивающему его дифференцирующую активность, а также гомологичных белков и их фрагментов.
Целью данной работы явилось сравнительное изучение функциональной роли гомологичных фрагментов молекул факторов HLDF и PEDF при их действии на различные биологические объекты.
Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю, кандидату химических наук И.А. Костанян и заведующему лабораторией белков гормональной регуляции, члену-корреспонденту РАН В.М, Липкину за постоянное внимание к данной работе и помощь в ее проведении, а также кандидату химических наук И.Д. Артамонову, кандидатам биологических наук О.Н. Голубевой и З.И. Сторожевой за помощь, поддержку и ценные советы в работе. Автор также признателен кандидату химических наук И.Л. Родионову за синтез пептидов.
Идентификация PEDF (ЕРС-1) в культуре легочных фибробластов. Зависимость уровня экспрессии PKDF от возраста клеточной культуры
Независимо от Tombranink и др., выделивших PEDF из культуральной среды клеток ПЭ [1,2,9], этот фактор был идентифицирован группой ученых под руководством R. Pignolo [13-16], изучавшей процессы клеточного старения на культуре легочных фибробластоподобньтх клеток человека линии WI-38. Эти клетки сохраняют способность к делению ограниченное число циклов, с каждым последующим циклом возрастает продолжительность фазы Gi. В конечном итоге они полностью утрачивают способность к синтезу ДНК, переходя в состояние «репликативного старения» [17]. При перенесении клеток WI-38 в среду без сыворотки они входят в состояние «ростового запрета» - фазу покоя Go- В клетках, прошедших менее 50% репликативных циклов, введенных в фазу Go, уровень экспрессии одной из мРПК размером 1,4 тыс. п.о. оказался примерно в 100 раз выше, чем в клетках той же линии, прошедших более 95% репликативных циклов. Соответствующую кДНК авторы назвали ЕРС-1 (Early Population-doubling-Ievel cDNA - кДНК, специфическая для клеточных популяций ранних генераций). При ее сравнении с данными со структурами уже имеющихся генов в геномной библиотеке оказалось, что она полностью идентична кДНК PEDF. Аминокислотные последовательности PEDF и белка, транслируемого с мРНК ЕРС-1, также оказались идентичными [13]. На стадии экспоненциального роста клеток экспрессия мРНК ЕРС-1 значительно ниже, чем в фазе Go, и практически не зависит от возраста культуры. При вводе клеток ранних генераций в фазу Go путем помещения в среду без сыворотки или увеличения плотности клеточной культуры наблюдается резкое возрастание уровня мРНК ЕРС-1, а при обратном входе клеток в цикл - его снижение. Суммарное количество мРНК ЕРС-1, продуцируемое клеточной популяцией, тем меньше, чем больший процент клеток в момент анализа находится в S-фазе. Количество секретируемого клетками белка ЕРС-1 также увеличивается при их переходе в состояние «ростового запрета»; в случае же клеток поздних генераций оно незначительно мало независимо от стадии цикла [13]. Поэтому продукт экспрессии ЕРС-1, т.е. PEDF, был определен как один из специфических маркеров фазы Go для фибробластоподобных клеток человека. При введении в клетки линии WI-38 специфических ингибиторов внутриклеточной фосфатидилинозитол-3-киназы они переходят в состояние, подобное «репликативному старению» - происходит остановка цикла в фазе Gi, а не Go, что сопровождается падением уровня экспрессии мРНК ЕРС-1 [14].
Позднее было установлено, что уровень транскрипции гена ЕРС-1 в клетках WI-38 не изменяется при клеточном старении или входе клеток в фазу Go. Различия в уровнях мРПК и экспрессируемого белка наблюдаются за счет посттранскрипционной регуляции на уровне процессипга незрелой РНК и изменения стабильности мРНК ЕРС-1 в клетке [15]. При переходе клеток, находящихся в состоянии «ростового запрета», в активно пролиферирующее состояние происходит быстрая деградация мРНК ЕРС-1, причем время ее «полужизни» оказывается более чем вдвое меньшим, чем при добавлении в клетку в фазе Go ингибиторов синтеза мРНК. Добавление же в клетку ингибиторов синтеза белка одновременно с ее выходом из фазы Go стабилизирует мРНК ЕРС-1. Эти факты свидетельствуют о специфической деградации данной мРНК определенным белком, синтез которого стимулируется входом клетки в пролиферирующее состояние. О существовании мРНК-связывающих факторов, способных к дестабилизации определенных видов мРНК, к настоящему времени известно [18], но для мРНК ЕРС-1 такой фактор пока что не идентифицирован. Кроме того, по предположению авторов [15], при выходе клеток из фазы Gn снижается скорость сплайсинга незрелой РНК ЕРС-1, из-за чего нарушается ее стабильность, Предполагаемой функцией ЕРС-1 в фибробластоподобных клетках является регуляция их перехода в фазу Gn. При добавлении рекомбинантного безіка ЕРС-1 к популяции клеток WI-38 ранней генерации, находящейся в фазе логарифмического роста, их способность к переходу в S-фазу заметно снижается. В то же время введение специфических антител против ЕРС-1 в культуру клеток ранней генерации, находящейся в фазе Go, повышает их способность к синтезу ДНК [16]. Подобная зависимость количества сскретируемого PEDF от возраста культуры характерна также для клеток ПЭ. Высокий уровень продукции PEDF наблюдается лишь в клетках первых двух генераций, затем идет постепенное снижение, и к восьмой-десятой генерации продукция PEDF полностью прекращается. Соответствующим образом меняется уровень экспрессии мРНК PEDF. Старение культуры клеток ПЭ сопровождается изменением их морфологии и снижением скорости пролиферации; после 10-й генерации клетки полностью утрачивают способность отвечать ускорением пролиферации на добавление в среду компонентов сыворотки [19]. Известно, что клетки ПЭ млекопитающих находятся в пролиферирующем состоянии только до рождения, в постнатальный период они существуют в фазе Go [20]. Можно предположить, что подобно клеткам WI-38, находящимся в данной фазе, они вырабатывают значительное количество PEDF в течение всей жизни.
Было установлено, что возрастное повышение риска опухолевой трансформации эпителиальных клеток эндометрия человека коррелирует с уменьшением экспрессии PEDF стромальными фибробластами эндометрия (ESF -endometrial stromal fibroblasts) [21]. Уровень мРНК и секреция PEDF клетками ESF, подобно клеткам ПЭ и W1-38, резко снижается при клеточном старении, а с возрастом человека, по данным Martin et al. [22], ускоряется старение его клеток, т.е., уменьшается процент клеток, находящихся в состоянии «ранней генерации». Вместе с тем было показано антипролиферативное влияние PEDF на различные клеточные линии, выделенные из опухоли эндометрия; данный эффект оказался зависимым от концентрации и времени действия PEDF. Уровень же собственной мРНК PEDF во всех этих линиях, а также в нетрансформированных эпителиальных клетках эндометрия, довольно незначительный [21]. Таким образом, пролиферация эпителиальных клеток эндометрия подвержена паракринному влиянию соседних с ними клеток ESF. Существуют и другие факторы, се третируемые ESF и останавливающие рост клеточных линий, выделенных из опухолей эндометрия, такие как IL-la и TGF-pi [23], однако их экспрессия клетками ESF мало зависит от возраста. 1.3. Идентификация PEDF мыши (каспина - коллаген-связывающего серпнна). Kozaki et al. [24] исследовали способность секреторных продуктов культуры клеток линии colon26 аденокарциномьг ободочной кишки мыши связываться с элементами экстрацеллюлярного матрикса. Одним т таких продуктов оказался белок с молекулярным весом 45 к Да, принадлежащий к семейству серпинов - ингибиторов сериновых протеиназ (SERPIN - SERine Protease INhibitor), имеющий высокое сродство к коллагену типа I, и в меньшей степени - к коллагену типа III. С другими элементами матрикса - коллагенами типов II, Г/, фибронектином, ламинином, и др. данный серпин не связывался. Авторы дали ему название «каспин» (caspin - Collagen-Associated serPIN). Была установлена структура кДНК и аминокислотная последовательность каспина. Полипептидная цепь содержит 417 аминокислотных остатков. Среди всех белков, гомологичных каспину, наиболее близким к нему оказался человеческий PEDF (ЕРС-1); степень гомологии нуклеотидных последовательностей кДНК и аминокислотных последовательностей белков составляет 82.7 и 85,6%, соответственно. По причине столь значительного сходства авторы утверждают, что каспин является мышиным аналогом PEDF [24]. Независимо Singh et. al. [25] клонировали PEDF мыши из геномной библиотеки кДНК печени мыши с использованием кДНК PEDF человека в качестве зонда. Первичная структура PEDF мыши, представленная в данной статье, совпадает со структурой каспина за исключением четырех замен в положениях 126, 127, 136 и 145.
Дифференцирующее действие PEDF на эмбриональные ткани. Влияние PEDF на метаболизм глиальных клеток
Houenou et al. [59] показали дифференцирующее действие PEDF in vitro на культуре незрелых двигательных нейронов спинного мозга, вьщелснных из эмбрионов цыплят в возрасте 5,5 суток. Препараты человеческого и бычьего PEDF при действии на нейроны провоцировали рост длинных нервных отростков; при действии на них одной из «укороченных» форм человеческого PEDF (остатки 44D-264T) наблюдался рост как длинных, так и коротких (вторичных) отростков. PEDF является основным фактором, обеспечивающим нормальный морфогенез и метаболизм фоторецепторных и глиальных клеток при эмбриональном развитии сетчатки глаза. В работах Jablonski et. al. [60, 62] приведены результаты экспериментов на культивируемых глазах эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis, в сетчатках которых был удален слой ПЭ. Глаза выделяли на той стадии эмбриогенеза, когда ПЭ уже в полной мере выполнял свои функции, а фоторецепторы находились на стадии формирования. При отсутствии ПЭ формирующиеся фоторецепторы имели нарушенную морфологию, в слое внутренних сегментов имелись «дыры». Экспрессия олеина в фоторецепторах была понижена (70% от контроля), его локализация нарушена. Клетки Мюллера, составляющие глиальную ткань, были атрофичными, в них наблюдалось пониженное содержание глутаминсинтетазы и повышенное содержание глиального фибриллярного кислого белка GFAP (glial fibrillary acidic protein), являющегося своеобразным маркером стресса. Межклеточные контакты между глией и внутренними сегментами фоторецепторов были нарушены. В контрольных глазах, где ПЭ не удаляли, фоторецепторы и глиальные клетки имели нормальную морфологию и метаболизм. При культивировании выделенных глаз с удаленньгм ПЭ в присутствии 50 нг/мл PEDF морфология развивающихся фоторецепторов и глиальных клеток была нормальной, уровень экспрессии специфических белков был близок к контролю (т.е., в глазах, культивируемых при наличии слоя ПЭ). Однако «дыры» в слое внутренних сегментов присутствовали, и число межклеточных контактов не достигало уровня контроля. Все восстановительные эффекты PEDF блокировались специфическими антителами частично или полностью в зависимости от разведения сыворотки. Эти данные свидетельствуют о том, что именно PEDF является фактором ПЭ, обеспечивающим нормальное развитие фото рецепторов в эмбриогенезе [60, 62]. Влиянию PEDF на морфологию, метаболизм и пролиферацию глиальных клеток посвящена более ранняя публикация Sugita et al. [63]. Добавление PEDF к культуре микроглиальных клеток, выделенных из головного мозга крысят в возрасте 2 суток, провоцирует их морфологические изменения.
В контрольной группе эти клетки имеют вытянутую или палочкообразную форму с большим числом отростков; под действием PEDF (2,3 нМ) в течение 24 часов они уменьшаются в размерах и округляются, а отростки значительно укорачиваются. При этом в клетках повышается активность митохондриапьных дегидрогеназ и кислых фосфатаз. PEDF практически полностью ингибирует пролиферацию микроглиапьных клеток, вызываемую стимуляцией грануло цит-макрофагальным колонестимулируюшим фактором (ГМ-КСФ). Выше было подробно описано дифференцирующее и антипролиферативное влияние PEDF на клетки рстинобластомы Y-79 [1, 9], Crawford et al. [61] изучили комплекс противоопухолевых действий PEDF на нейробластому. Эта опухоль является гетерогенной популяцией, включающей в себя малигнизированные нейробласты, ганглиальные клетки, Шванновские клетки и эндотелиальные клетки, формирующие сосуды. Развитие нейробластомы у пациентов часто бывает совершенно непредсказуемым: она способна спонтанно исчезать или же быстро, скачкообразно прогрессировать [64, 65]. Клинический прогноз бывает тем лучше, чем больше в популяции дифференцированных нейронов и Шванновских клеток. Известно, что культуральная среда последних обладает противоопухолевыми свойствами [66]. Чем больше общая степень дифференцированное нейробластомы и чем выше в ней процент Шванновских клеток, тем сильнее иммуноїгистохимическая реактивность с антителами на PEDF. Именно PEDF, являющийся секреторным продуктом Шванновских клеток, определяет противоопухолевые свойства их культуральной среды. Он оказывает на опухоль комплексное действие, включающее три эффекта: 1) вызывает дифференцировку нейробластов, 2) действует как антиангиогенный агент, вызывая апоптотическую гибель эндотелиальных клеток; 3} поддерживает жизнедеятельность и стимулирует рост Шванновских и зрелых ганглиозных клеток, которые, в свою очередь, начинают секретировать большие его количества - имеет место положительная обратная связь. Схема аутокринного и паракринного действия PEDF на различные составляющие нейробластомы представлена на рис. 2. Таким образом, клинические факты «непредсказуемого» быстрого исчезновения нейробластомы объясняются значительным повышением концентрации PEDF, секретируемого главным образом Шванновскими клетками [61]. Секретируемый клетками пигментного эпителия PEDF оказывает на них аутокринное действие. Malchiodi-Albedi et al. [20] показали его эффекты на культуру сетчаток, выделенных из новорожденных крыс-альбиносов.
По сравнению с животными дикого типа в клетках ПЭ таких крыс нарушен фенотип и пигментация. На 7-9 день культивирования сетчаток эпителиальные клетки составляли не более 10% популяции. Они были маленькие, вакуолизированные, со втянутой цитоплазмой, число гранул пигмента было крайне невелико. Такие клетки не проявляли способности к адгезии и формированию контактов как между собой, так и с клетками нейрального происхождения, присутствующими в культуре. При добавлении к такой культуре PEDF клетки Г1Э увеличивались в размерах, становились полигональными, уплощенными, с большим количеством равномерно распределенной цитоплазмы и образовывали межклеточные контакты. В клетках присутствовало много крупных пигментных гранул -меланосом. Следовательно, PEDF стимулирует синтез и накопление меланина в клетках ПЭ. О важности меланина в развитии сетчаточных нейронов свидетельствует тот факт, что все млекопитающие-альбиносы, независимо от причин альбинизма, имеют те или иные нарушения передачи зрительного сигнала [67]. Действительно, по данным Abul-Hassan et. al. [68], активность промотора гена тирозиназы - фермента, ответственного за синтез меланина - повышается в культуральных клетках ПЭ под действием PEDF, а также bFGF, холерного токсина и свободного тирозина. 4. Нейропротекторное действие PEDF. Нейропротскторное действие PEDF было показано на фоторецепторных клетках сетчатки [69, 70], гранулярных клетках мозжечка крыс [71-73], двигательных нейронах спинного мозга [56, 59], нейронах гиппокампа [74]. Впервые нейропротекторное действие PEDF было показано на дифференцированных нейронах, образовавшихся из клеток рстинобластомы линии Y-79 под его же влиянием. Такие нейроны, живущие в культуре и имеющие контакт с подложкой, при отсутствии в среде PEDF живут 11-15 дней, после чего открепляются от подложки и погибают вследствие апоптоза. При добавлении в среду 50 нг/мл PEDF или же 50% культуральной среды клеток ПЭ плода человека, нейроны живут до 35-40 дней, сохраняя свой фенотип [75]. Для поддержания жизни фоторецепторных клеток сетчатки во взрослом организме in vivo также необходим PEDF [19]. Работа Cayouetle et al. [69] посвящена влиянию PEDF на жизнеспособность фоторецепторов при наследуемых патологиях сетчатки, ведущих к их апоптотической гибели. При аутосомно-рецессивной дегенерации сетчатки (патологии rd) у мышей происходит массированный апоптоз фоторецепторов в течение первых 6 недель жизни. В основе этой патологии лежит нонсенс-мутация гена {3-фосфодиэстеразы. При инъекции таким мышам в возрасте 14 дней PEDF внутрь стекловидного тела число выживших фоторенепторов заметно возрастает, о чем можно судить по увеличению толщины сетчатки по сравнению с контролем, особенно наружного ядерного слоя. Мутация в гене периферина вызывает замедленную дегенерацию сетчатки (патология rds) - происходит апоптоз фоторецепторов в течение длительного времени, 100%-пая гибель наступает в возрасте 1 года. После инъекции PEDF мышам с данной патологией заметного увеличения толщины сетчатки визуально не наблюдалось, но число апоптотических фоторецепторов было на 20-40% меньше, чем в контроле.
Изменения уровня PEDF при зрительных патологиях, связанных с избыточным ангиогенезом
Наиболее распространенными причинами ослабления и потери зрения являются патологии, связанные с избыточным ангиогенезом в сетчатке: возрастная дегенерация сетчатки, ретинопатия недоношенных детей и диабетическая ретинопатия. Скорость образования сосудов в сетчатке зависит от соотношения VEGF/PEDF, поэтому логично предположить, что при данных патологиях уровень PEDF в сетчатке и ее окружении понижен, а уровень VEGF повышен. Так, при активной диабетической ретинопатии концентрация PEDF в стекловидном теле составляет 0,85 мкг/мл, в то время как в контрольных образцах -1,71 мкг/мл; при неактивной форме ретинопатии, при которой ангиогенез заторможен - 1,59 мкг/мл. Уровень VEGF при активной и неактивной ретинопатии составляет 2,54 и 0,395 нг/мл, соответственно [98]. При возрастной дегенерации сетчатки уровень PEDF в стекловидном теле понижен в 6 раз. Следует отметить, что снижение уровня PEDF не всегда ведет к дегенерации сетчатки - если в самой сетчатке не имеется повреждений, которые могли бы привести к бесконтрольному поступлению ангио генных факторов извне, избыточный ангиогенез при недостатке PEDF не происходит [99]. Одним из эффективных методов терапии заболеваний, связанных с избыточным сосудообразованием в сетчатке, является рассеянная лазерная фотокоагуляция. Механизм терапевтического воздействия пока что не изучен. Как показали Ogata et al. [100] на крысах, через 6 часов после фотокоагуляции наблюдается повышение уровня PEDF в 27,5 раз, которое сохраняется довольно длительное время; через 2 недели после сеанса уровень PEDF вдиое выше, чем в контрольной группе. При фотокоагуляции культуры клеток ПЭ человека наблюдается незначительное повышения уровня секретируемого ими PEDF. Semkova et al. [101] предложили новый эффективный метод терапии возрастной дегенерации сетчатки.
Клетки пигментного эпителия зрачка пациента трансформируют аденовирусным вектором, экспрессируюшим PEDF, затем трансплантируют тому же пациенту на место поврежденного ПЭ сетчатки. ПЭ зрачка является анатомическим продолжением ПЭ сетчатки, однако количество PEDF, секретируемое клетками ПЭ сетчатки, более чем в 100 раз превышает его количество, секретируемое тем же числом клеток ПЭ зрачка, В результате описанной авторами трансформации клеток ПЭ зрачка аденовирусным вектором секреция PEDF возрастает более чем в 200 раз. In vitro, культу ральпая среда таких клеток ингибирует VEGF-стимулмрованную пролиферацию и хемотаксис капиллярных эндотелиальных клеток, а также препятствует формированию ими трубочек образующихся сосудов. In vivo, трансплантация модифицированного ПЭ зрачка на место ПЭ сетчатки у крыс предотвращает дегенерацию сетчатки при гипоксии, хороидальной неоваскуляризацик, а также при искусственно спровоцированном патологическом состоянии, подобном возрастной дегенерации сетчатки. В первых двух случаях избыточный ангиогенез возвращается к нормальному уровню, в последнем случае поддерживается жизнедеятельность фоторецепторов и нормальный уровень экспрессии ими родопсина. Данные эффекты сохраняются на протяжении нескольких месяцев жизни крыс [101]. Подобные исследования с использованием аденовирусного вектора, стабильно экспрессирующего PEDF, проведены Raisler et at. [102]. Новорожденным мышам в 1-й день жизни делали однократную внутриглазную инъекцию аденовирусных частиц; с 7-го по 12-й день жизни такие животные содержались в условиях гипероксигенации с последующим возвращением в нормальную атмосферу, как описано выше [94, 96, 97]. Избыточный ангиогенез в сетчатке был в значительной мере подавлен, количество эндотелиальных клеток на срезах глаз было в 4 раза меньше, чем в контрольных глазах, не обработанных вектором. Использование генетического материала, экспрессирующего PEDF, является терапевтическим методом длительного воздействия; так, при его введении в глаза крыс уровень PEDF, необходимый для подавления избыточного ангиогенеза, сохраняется на протяжении, по крайней мере, 21 месяца. Wang et al. [ЮЗ] предложили использование генетического материала, экспрсссирующего PEDF, в противоопухолевой терапии. При инъекциях аденовирусных частиц, экспрессирующих PEDF, в карциномы мышей различного происхождения их рост подавлялся вследствие угнетения образования микрососудов. Эти данные были получены при микроскопическом анализе структуры опухолей. Как отмечают авторы, PEDF не влияет на пролиферацию эндотелиальных клеток, однако он обладает сильным отрицательным хемотаксисом в отношении данных клеток и препятствует образованию из них сосудоподобных структур. 5.3. Возможные механизмы антиангиогенного действия PEDF. Стенки кровеносных сосудов образованы эндотелиальными клетками. При изучении механизма антиангиогенного действия PEDF в первую очередь представляет интерес выяснение его влияния на клетки этого типа. Ангиогенные факторы обладают положительным хемотаксисом в отношении эндотслиальных клеток.
По данным Dawson et. al. [94], PEDF ингибирует их хемотаксис под влиянием всех исследованных ангиогенных факторов - VEGF, PDGF, 1L-8 и других. Ингибирование хемотаксиса специфично в отношении эндотелиальных и микроваскулярных клеток; на хемотаксис легочных фибробластов, гладкомышечпых клеток аорты, кератииоцитов и нейтрофилов PEDF не влияет. Stellmach et al. [96] в вышеописанных экспериментах с мышами, содержавшимися 5 дней в условиях гипероксигенации. а также на культуре эндотелиальных клеток сосудов показали, что причиной антиангиогенного эффекта PEDF является апоптоз эндотелиальных клеток. Из литературных данных известно, что другие антиангиогенные агенты - ангиостатин, эндостатин, тромбоспондин-1, также индуцируют их апоптоз [104-106]. Характерной особенностью PEDF является селективное антиангиогенное влияние: препятствуя образованию новых сосудов, он не разрушает уже существующие [107]. Причиной такого избирательного эффекта является инициация апоптоза, опосредованная Fas-лигандом [108]. При взаимодействии Fas-лиганда с Fas-рецептором (CD95) происходит апоггтоз клетки, экспрессирующей данный рецептор, что было хорошо изучено на примере апоптоза иммунных клеток в поврежденных тканях [109]. Ангиогенные агенты обладают положительным хемотаксисом в отношении эндотелиальных клеток. В то же время они стимулируют экспрессию последними ряда антиапоптотических молекул, повышающих их жизнеспособность [ПО], а также Fas-рецепторов. PEDF индуцирует выработку Fas-лигандов эндотелиальными клетками, что при наличии достаточной плотности Fas-рецепторов ведет к Fas-индуцированному апоптозу (рис. 3) [108]. Таким образом, ангиогенные агенты, привлекая эндотелиальные клетки и делая их более жизнеспособными, в то же время повышают их восприимчивость к действию PEDF. В сформированных сосудах клетки эндотелия находятся в состоянии «ростового запрета» и плотном контакте друг с другом, они гораздо менее восприимчивы к действию VEGF [111]. Экспрессия Fas-рецепторов в них снижена [112], что делает их защищенными от апоптотического действия PEDF. Интересно отметить тот факт, что PEDF стимулирует апоптоз эндотелиальных клеток и в то же время предотвращает апоптоз различных клеток нейрального происхождения. Должно быть, в этих случаях его действие реализуется по разным, не связанным между собой механизмам. В то же время Hutchings et. al. [113] показали, что и на эндотелиальные клетки разных фенотипов PEDF способен оказывать противоположное по характеру действие. Эндотелиальные клетки сетчатки быка (BREC - bovine retinal endothelial cells), культивируемые в среде с VEGF (BREC/V), отличаются по ряду признаков от культивируемых без VEGF (BREC/0). В частности, клетки BREC/V при помещении в трехмерные коллагеновые гели формируют тубулярные структуры. Пролиферация клеток BREC/0 ингибируется PEDF. В противоположность тому, PEDF стимулирует пролиферацию клеток BREC/V; в большей степени этот эффект наблюдается в присутствии VEGF и FGFj. Такое действие опосредовано МАР-киназами р42/р44: в клетках BREC/V происходит фосфорилирование этих киназ под действием PEDF и VEGF, причем их действие синерпічно; в клетках BREC/0 PEDF препятствует фосфорилированию киназ под действием VEGF.
Сравнительное изучение индукционного действия факторов HLDF и PEDF, а также пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на эктодерму эмбрионов X. laevis
Спектр мишеней действия факторов дифференцировки включает в себя, прежде всего, эмбриональные, стволовые и опухолевые клетки. Широко используемой моделью для изучения дифференцирующего действия различных агентов на эмбриональные ткани является препарированная эктодерма эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis на стадии ранней гаструлы (ЭРГ), на которой она наиболее восприимчива к действию различных индукторов дифференцировки [122]. При наличии внешних индукционных (т.е., дифференцирующих) воздействий эксплантаты ЭРГ могут трансформироваться в различные ткани как эктодермального, так и мезодерм ал ьного происхождения; при их отсутствии из эксплантатов ЭРГ формируется атипичный эпидермис. Нами было изучено индукционное действие факторов HLDF и PEDF, а также синтетических пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на ЭРГ. Фактор HLDF, как и пептид HLDF-6, вызывал образование в эктодерме клеток крови (Рис. 6, а,6). Фактор PEDF главным образом индуцировал формирование морфологически очерченных нервных образований (Рис. 6, в, г). На рис. 6, в показан зачаток сетчатки глаза; на рис. 6, г - зачаток спинного мозга. Наряду с этими образованиями в эксплантатах присутствовало небольшое количество клеток крови. Под действием пептида PEDF-6 в ЭРГ образовывались только мезенхимы ые клетки - фибробласты; нервные ткани и кровь этим пептидом не индуцировались (рис. 6, д), В контрольной группе эксплантатов, как и ожидалось, формировался атипичный эпидермис {рис. 6, е). Фактор PEDF индуцирует дифференцировку ЭРГ одновременно по двум направлениям - в нервные ткани и клетки крови. Согласно литературным данным, дифференцировка нейрональиых клеточных линий в зрелые нейроны под действием PEDF обеспечивается фрагментом молекулы PEDF 78V-121T, достаточно удаленным от фрагмента PEDF-6 в первичной структуре [115, 117] (рис. 4), а дифференцирующее действие на клетки HL-60, являющиеся предшественниками клеток крови, согласно нашим результатам, обеспечивает фрагмент TQVEHR , Логично предположить, что данный фрагмент молекулы отвечает за индукцию образования в ЭРГ клеток крови, в то время как индукция формирования нервных тканей обусловлена наличием в полипептидной цепи PEDF фрагмента 78V-I21T, Однако пептид PEDF-6 индуцирует образование мезенхимы, а не клеток крови.
Вероятно, для индукции образования в ЭРГ клеток крови необходима определенная конформация фрагмента 354TQVEHR359, которая существует в составе полноразмерной молекулы фактора, т.е., отличная от той, которую имеет пептид PEDF-6. 2. Сравнительное изучение протекторного действия пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на нейроны червя мозжечка крыс и клетки линии HL-60 при индуцированной химической гипоксии. Факторы HLDF и PEDF выполняют в живых организмах не только дифференцирующие, но и защитные функции. Они поддерживают жизнедеятельность и функциональную активность различных тканей при целом ряде неблагоприятных физических и химических воздействий. Протекторное действие пептида HLDF-6 было показано на клетках HL-60 при холодовом шоке [120]. Протекторное действие фактора PEDF на нейрональные ткани, согласно литературным данным, обеспечивается фрагментом молекулы 78V-I21T, расположенным в ее JV-концевой части [117]. Однако, принимая во внимание структурную гомологию фрагмента молекулы HLDF 4ITGENHR46, соответствующего пептиду HLDF-6, и фрагмента PEDF TQVEHR , можно предположить, что последний также может определять протекторные свойства PEDF в отношении определенных типов клеток. В данной работе исследовано протекторное действие пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на клетки Пуркинье червя мозжечка крыс, а также клетки линии HL-60 при индуцированной химической гипоксии. В качестве агента, вызывающего гипоксию, использовался азид натрия - агент, блокирующий ферменты дыхательной цепи митохондрий, в частности, цитохромоксидазу С [123]. 2.1. Протекторное действие пептидов на клетки червя мозжечка крыс. Восстановление под действием пептидов поведенческих реакций, нарушаемых при химической гипоксии червя мозжечка. Червь мозжечка (vermis cerebelli) - серединный отдел мозжечка, расположенный между его полушариями. Червь мозжечка участвует в реализации ряда реакций на уровне поведения, в частности, формирования условного обстановочного страха, вкусового отвращения и неофобии, а также долговременного угашения акустической стартл-реакции (АСР), т.е. уменьшения выраженности реакции животных на внезапные звуковые стимулы вследствие привыкания [124-127]. У нормальных животных определенную часть клеток Пуркинье червя мозжечка составляют гиперхромные клетки, которые соответствуют «темным» или осмиофильным нейронам при электронно-микроскопических исследованиях [128]. По мнению большинства исследователей, гиперхромные нейроны имеют сниженную функциональную активность. Соотношение гиперхромных и нормохромных клеток Пуркинье в черве мозжечка представляет интегративпый показатель, характеризующий функциональное состояние нервной системы. Процент гиперхромных клеток возрастает при гипоксии, белково-энергетической недостаточности, повышенной физической нагрузке. При введении животным веществ, активирующих энергетические ресурсы клеток мозга, он может снижаться [129, 130].
Экспериментальным крысам осуществляли внутричерепные инъекции растворов различного состава с непосредственным нанесением на червь мозжечка: 1) раствора азида натрия в физиологическом растворе (10 3 М); 2) раствора азида натрия в той же концентрации, содержащего пептид HLDF-6(10 M); 3) раствора азида натрия, содержащего пептид PEDF-6 (10 М); 4) чистого физиологического раствора (контрольная группа). Объем наносимых растворов - 5 мкл на крысу. При химической гипоксии червя, индуцируемой азидом натрия, процент гиперхромных клеток Пуркинье на гистологических срезах червя увеличивался по сравнению с контрольной группой животных. Для гиперхромных клеток характерно потемнение цитоплазмы, уплотнение ядер, конденсация хроматина в ядрах (Рис. 7). При нанесении на червь раствора азида натрия, содержащего один из пептидов HLDF-6 или PEDF-6, количество гиперхромных клеток оказывалось меньшим по сравнению с группой животных, которым наносили только азид натрия, но большим, чем в контрольной группе (Табл. 3). Следовательно, оба пептида обладают защитным действием па клетки Пуркинье - способны в определенной степени поддерживать их функционально активное состояние в условиях гипоксии. На поведенческом уровне нами изучено влияние химической гипоксии червя мозжечка, а также восстановительное действие пептидов на следующие реакции: 1) формирование условного обстановочного страха; 2) долговременное угашение АСР. Отсутствие или нарушение проявления данных реакций свидетельствует о повреждении червя мозжечка [124, 125]. Эксперименты проводились в специальной камере, находящейся в звукоизолированном помещении. Схема экспериментальной установки представлена на рис. 8. Степень условного обстановочного страха оценивали по продолжительности периода «замирания», т.е., полной неподвижности животного при помещении в экспериментальную камеру с фоновым шумом (внезапной смене обстановки). АСР является комплексной формой активациоиного ответа организма на внезапный интенсивный звуковой стимул. Одним из компонентов АСР является резкое разгибание (экстензия) конечностей в течение 0,1 сек после стимула, по силе которого оценивается амплитуда (выраженность) двигательной составляющей АСР. Первичные испытания, включающие в себя помещение животных в экспериментальную камеру с последующим предъявлением 10 звуковых импульсов, проводили через 5 суток после нанесения па червь мозжечка тестируемых препаратов. Через 24 часа проводили повторные испытания. У контрольной группы животных (в норме) при повторных испытаниях период «замирания» увеличивался вследствие сформировавшегося обстановочного страха, а амплитуда АСР снижалась в результате долговременного угашения.
![Синтез и изучение структуры каликс[4]резорцинов, модифицированных различными азотсодержащими фрагментами](/i/i/4234/289020.png "Синтез и изучение структуры каликс[4]резорцинов, модифицированных различными азотсодержащими фрагментами Шаталова Нина Игоревна")
