Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние вопроса 3
1.1 Трансформация микрофлоры при производстве различных мясопродуктов 3
1.2 Роль микроорганизмов в образовании различных качественных характеристик продукта 9
1.3 Современное производство бактериальных культур для промышленных целей 15
1.4 Обоснование выбора метода сублимационного консервирования 21
1.5 Пути повышения эффективности процесса лиофилизации бактериальных культур 25
1.6 Механизмы криоповреждения микроорганизмов и их защита 28
1.7 «Пробиотики», «пребиотики», «синбиотики». Производство продуктов пробиотического действия 34
Глава 2. Схема проведения эксперимента и методы исследований 38
2.1 Методика постановки эксперимента. Характеристика объектов исследования 38
2.2 Методы исследований 41
Глава 3. Фенотипические и молекулярно-генетические характеристики микроорганизмов 60
3.1 Морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства исследуемых культур 60
3.2 Молекулярно-генетическая характеристика микроорганизмов 63
3.3 Изучение плазмидного профиля штаммов микроорганизмов 65
3.4 ПЦР - диагностика промышленно-ценных штаммов 73
Глава 4. Установление закономерностей влияния различных параметров замораживания на лиофилизацию культур микроорганизмов 82
4.1 Изучение влияния температуры замораживания 82
4.2 Подбор эффективной защитной среды и ее соотношения с бактериальной массой 87
4.3 Изучение влияния скорости замораживания на выживаемость и активность бактериальных клеток 93
4.4 Исследование влияния продолжительности предварительного замораживания на выживаемость и активность клеток после лиофилизации 100
Глава 5. Исследование влияния фазы роста клеток на их устойчивость и активность после лиофилизации 104
Глава 6. Разработка технологии синбиотического лиофилизированного бактериального препарата 112
6.1 Подбор концентрации солей различных металлов, стимулирующих рост микроорганизмов 112
6.2 Отработка режимных параметров вакуум-сублимационной сушки микробных клеток 116
6.3 Обоснование срока хранения препарата 123
Глава 7. Комплексное исследование колбас, выработанных с использованием разработанного синбиотического бактериального препарата 132
Выводы по результатам проведенных исследований 137
Библиографический список 139
Приложения 153
- Роль микроорганизмов в образовании различных качественных характеристик продукта
- Молекулярно-генетическая характеристика микроорганизмов
- Изучение влияния скорости замораживания на выживаемость и активность бактериальных клеток
- Исследование влияния фазы роста клеток на их устойчивость и активность после лиофилизации
Введение к работе
Актуальность работы. Микробиологические процессы нашли широкое распространение в различных областях народного хозяйства. Сегодня в биотехнологии видят одно из средств для преодоления продовольственных, сырьевых, энергетических и экологических проблем.
Это дополняется все возрастающими возможностями молекулярной биологии и клеточной инженерии, которые позволяют целенаправленно создавать высокопродуктивные штаммы микроорганизмов.
Производство ряда мясных продуктов, вследствие технологических особенностей, отличается длительностью и большой трудоемкостью. Поэтому в настоящее время большое значение уделяется созданию и внедрению в производство препаратов и технологий, существенно ускоряющих технологический цикл.
Исследованиями ряда ученых, в частности Рогова И. А., Билетовой Н. В., Хорольского В. В., Ганиной В. И., Крыловой В. В., Niinivaara F. P., Wegner К., Schiffner E., Hagedorn W. доказана перспективность применения стартовых культур, представляющих собой специально подобранные штаммы молочнокислых микроорганизмов и дрожжей, с целью сокращения технологического процесса и одновременного получения готового продукта со стабильными качественными показателями. В этой связи почти во всех странах мира при изготовлении сырокопченых и сыровяленых колбас применяют бактериальные препараты - жизнеспособные микроорганизмы в виде отдельных или смешанных культур.
Одним из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов является создание пробиотиков на основе микроорганизмов с заданными свойствами, оказывающих благоприятное действие на физиологические функции и биохимические реакции организма-хозяина. Применение микроорганизмов, обладающих пробиотической активностью, целесообразно в комплексе с пребиотиками - ингредиентами пищи, которые способствуют избирательной стимуляции роста и метаболической активности групп бактерий, обитающих в кишечном тракте. Смесь пробиотиков и пребиотиков объединяют в группу синбиотиков, повышающих выживаемость бактериальных добавок в кишечнике.
В настоящее время наибольшее распространение получили бактериальные препараты, выпускаемые в сухом виде, и расфасованные в соответствующие упаковочные материалы. Комбинированные многослойные материалы, такие как целлофан-фольга-полиэтилен, целлофан-полиэтилен-фольга-полиэтилен или саран-целлофан-полиэтилен-фольга-полипропилен обладают лучшими эксплуатационными и высокими барьерными свойствами.
Наиболее распространенным в микробиологической промышленности видом сушки является лиофилизация. Преимущества лиофилизации перед другими способами обезвоживания объясняются удалением влаги при низких
температурах, что практически исключает термоинактивацию продукта; лиофилизированный материал может быть с легкостью регидратирован, вследствие его пористости.
наиболее перспективным является выпуск препаратов в лиофилизированном виде. Это позволяет сохранить стабильные диагностические свойства культур в течение длительного периода времени. Кроме того, такая форма препаратов в наибольшей степени отвечает требованиям предприятий, так как обеспечивает удобство при использовании, хранении и транспортировке.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка технологии синбиотического лиофилизированного бактериального препарата для производства мясных продуктов.
В соответствии с поставленной целью в ходе работы решались следующие задачи:
изучить фенотипические и молекулярно-генетические характеристики бактериальных культур с целью их идентификации в соответствии с Международным стандартом;
изучить плазмидный профиль для отбора штаммов со стабильными промышленно-ценными свойствами;
провести ПЦР - диагностику, позволяющую в условиях промышленного производства контролировать чистоту используемой культуры и ее идентичность депонированной или запатентованной культуре;
исследовать процесс замораживания клеточной суспензии;
изучить влияние концентрации протекторных сред различного состава на устойчивость клеток микроорганизмов во время лиофилизации и последующего хранения;
подобрать концентрацию различных добавок, входящих в состав препарата, обеспечивающих выраженный эффект стимуляции роста микроорганизмов, и определить рациональные параметры вакуум-сублимационной сушки бактериальных клеток;
обосновать сроки хранения сухого бактериального препарата в зависимости от внешних условий;
провести комплексное исследование физико-химических, биохимических, микробиологических и органолептических показателей колбас, выработанных с использованием разработанного препарата микроорганизмов;
- разработать проект НД на бактериальный препарат.
Объекты исследований. Объектами исследований в данной работе являлись:
различные штаммы молочнокислых микроорганизмов В-1617 и В-1618, предварительно отнесенных к Lactobacillus plantarum, дополняющие друг друга по спектру биологической активности и проявляющие пробиотические свойства; штамм денитрифицирующих бактерий В-1619, предварительно идентифицированный как Micrococcus caseolyticus из коллекции микроорганизмов кафедры «Технология мяса и мясопродуктов» Московского государственного университета прикладной биотехнологии;
разработанный лиофилизированный бактериальный препарат, на основе композиции изучаемых штаммов и наполнителя - глюкозы в качестве пребиотика;
сырые ферментированные колбасы, изготовленные с использованием
разработанного бактериального препарата.
Методы исследований. В работе применяли следующие методы исследований: фенотипические признаки баккультур определяли стандартными общепринятыми методами.
ДНК выделяли методом Мармура с модификациями, включающими обработку ДНК проназой (Serva) после воздействия РНКазой А и центрифугирование очищенных препаратов. Определение содержания гуанин-цитозиновых пар (GC - пар) в ДНК проводили методом оптической реассоциации (с помощью кривых термической денатурации) на спектрофотометре «Pue Unicum SP 1800» при скорости нагрева 0,5С/мин и последующим расчетом по De Ley. Состав плазмид в штаммах микроорганизмов определяли методом электрофореза в агарозном геле.
ПЦР - диагностику осуществляли в многоканальном амплификаторе ДНК - «Терцик».
Определение выхода готового продукта - по методике, предложенной ВНИИМПом; определение массовой доли влаги - по ГОСТ 9793-74; белка - по ГОСТ 25179-90; жира - по ГОСТ 26183-84; хлористого натрия - по ГОСТ 9957-73; золы - методом прокаливания; величины рН - потенциометрическим методом; определение микробиологических показателей - по ГОСТ 9958-81; остаточной влажности в лиофилизированной бактериальной массе - методом высушивания при 105 С до постоянной массы; оценка органолептических показателей - по ГОСТ 9959-91; структурно-механические показатели - на универсальной испытательной машине «INSTRON»; учет микроорганизмов — по ГОСТ 10444.15 - 94; активность свертывания молока - по методике ВНИМИ; предел кислотообразоваяия - методом титрования.
Повторность экспериментов 3-5 кратная.
Научная новизна.
Определены молекулярно-генетические характеристики: содержание GC-
пар и внутриродовое сходство в полинуклеотидных последовательностях ДНК
в исследуемых штаммах молочнокислых и денитрифицирующего
микроорганизмов.
Установлено, что в клетках изученных штаммов кроме хромосомной ДНК, имеются также и внехромосомные ДНК (плазмиды), которые не утрачиваются при культивировании клеток в неблагоприятных условиях, что свидетельствует о постоянстве промышленных свойств штаммов.
Проведена идентификация и классификация микроорганизмов по
комплексу фенотипических и молекулярно - генетических признаков с учетом
Международного стандарта. Осуществлено депонирование
идентифицированных штаммов во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ГосНИИ «Генетики и селекции промышленных микроорганизмов».
Установлены закономерности влияния различных температур и скорости замораживания налиофилизацию культур Lactobacillus plantarum и Macrococcus caseolyticus.
Научно обоснован состав протекторных сред и изучена зависимость выживаемости микроорганизмов при лиофилизации от фазы роста и возраста культур.
Определена рациональная концентрация пищевых солей щелочных металлов, вносимых в состав бактериального препарата в качестве стимулятора роста клеток микроорганизмов, и обоснованы сроки хранения препарата в зависимости от внешних условий.
Практическая значимость. Изменен таксономический статус штаммов микроорганизмов в соответствии с Международной классификацией: Micrococcus caseolyticus реклассифицирован как Macrococcus caseolyticus. Для Lactobacillus plantaram таксономический статус продтвержден. Получены свидетельства об изменении таксономического статуса микроорганизмов и оформлены новые паспорта с внесенными изменениями.
Проведена ПЦР - диагностика, позволяющая в производственных условиях идентифицировать культуры микроорганизмов.
Предложено применение лиофилизированного препарата
микроорганизмов в технологии сырых ферментированных колбас без предварительного восстановления.
На основании обобщения результатов экспериментальных исследований разработан проект НД на лиофилизированный бактериальный препарат для производства мясопродуктов. В соответствии с разработанной НД выработана опытная партия бактериального препарата. В производственных условиях ООО «Рус-Агро-Люкс» апробирована технология сыровяленой колбасы с применением разработанного препарата. Изучен процесс лиофилизации биомассы микроорганизмов, который внедрен в учебный процесс для студентов, обучающихся по специальности 270900 - «Технология мяса и мясопродуктов».
Апробация работы. Результаты научной работы доложены на научно-технической конференции «Технологические аспекты комплексной переработки с/х сырья при производстве экологически безопасных пищевых продуктов общего и специального назначения» (Углич, 2002); Международной научной конференции «Живые системы и биологическая "безопасность населения» (Москва, 2002); 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); научно-технической конференции "Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство" (Воронеж, 2003); научно-технической конференции "Технологии живых систем" (Москва, 2003); пятой международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек" (Москва, 2003).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, семи глав, выводов, списка литературы, приложений. Материал изложен на 137 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 24 рисунка. Библиография представлена 142 источниками, в том числе 57 -зарубежных авторов.
Роль микроорганизмов в образовании различных качественных характеристик продукта
Одновременно с началом созревания происходят вызванные микробными экзоферментами изменения углеводов, жиров и белков мясного сырья, которые используются ими в качестве питательных веществ. При этом время начала, интенсивность и продолжительность этих процессов различные [55, 65].
Образование аромата считается очень важной функцией микробов. Существует мнение, что в образовании аромата участвует около 300 различных химических соединений. Важную роль при этом играют сравнительно быстро образующиеся продукты углеводного обмена микроорганизмов. Наряду с молочной кислотой образуются пировиноградная, винная, уксусная кислоты, этиловый спирт, ацетон, ацетальдегид, двуокись углерода и другие вещества. Они придают сырокопченой колбасе долго сохраняющийся вкус [67, 82, 85, 88, 117, 142]. К микроорганизмам, очень активно участвующим в расщеплении углеводов, относят лактобациллы и бактерии родов Micrococcus и Staphylococcus [29, 119, 119, 138, 140]. Последним приписывают способность придавать вкусу колбасы нежные кисловатые оттенки. Существует мнение, что сырокопченые колбасы с большим содержанием микрококков обладают тончайшим запахом. Нежные и даже пикантные кисловатые вкусовые оттенки считаются критерием качества многих сырокопченых колбас. Образование кисловатых вкусовых оттенков зависит от действия лактобацилл (гомо- или гетероферментативных) [82].
Если для повышения стойкости к хранению предпочтительнее жизнедеятельность гомоферментативных лактобацилл, то для образования вкуса она оказывается невыгодной, потому что появляется резко выраженный кислый вкус. При этом нельзя забывать, что при наличии гетероферментативных лактобацилл опасность одностороннего усиленного образования только одной кислоты значительно больше, чем при наличии гомоферментативных, вследствие чего могут создаваться другие нежелательные кислые вкусовые оттенки. Например, при неблагоприятных условиях под действием гетероферментативных лактобацилл образуется повышенное количество уксусной кислоты. Появляющиеся вследствие этого отклонения вкуса могут быть настолько значительными, что сырокопченая колбаса становится несъедобной. Такие отклонения встречаются сравнительно часто [7].
Последние исследования позволяют сделать вывод, что было бы неправильным проводить резкую грань между гомоферментативными и гетероферментативными лактобациллами, потому что в зависимости от внешних условий у одного и того же вида микроорганизмов могут наблюдаться изменения в характере брожения [110].
Отклонения в аромате чаще всего объясняются активностью нежелательных микроорганизмов. Например, при углеводном обмене грамотрицательные бактерии Escherichia coli и Enterobacter образуют довольно значительное количество уксусной и муравьиной кислот. Муравьиную кислоту образуют также грамотрицательные Serratia marcescens. Масляная и уксусная кислоты могут возникнуть в процессе ферментативной деятельности клостридий. Кроме того, уксусная кислота может образовываться в результате окисления этанола [55].
Доминирующая роль в формировании аромата принадлежит расщеплению жиров. Содержание свободных жирных кислот в колбасе связано с образованием ее запаха. Из жиров образуются и карбонильные соединения [92, 100, 135]. Липолитической активностью обладают прежде всего микрококки, составляющие подавляющее большинство всех липазообразующих бактерий. Считается, что в образовании аромата они играют значительную роль. Развитие их активности в значительной степени зависит от жировых субстанций. Способностью образовывать липазы обладают также бактерии рода Lactobacillus. Правда, среди них есть штаммы, которые благодаря чрезмерному образованию свободных жирных кислот могут оказывать отрицательное влияние на аромат и тем самым вызывать нежелательные изменения. Способность к липазообразованию проявляют и микроорганизмы рода Leuconostoc, тогда как у бактерий рода Pediococcus такой способности не обнаружено. Стрептококки тоже обладают активной липолитической способностью. Стафилококки, а также встречающиеся в мясе дрожжи и плесневые грибы тоже известны как липазообразующие микроорганизмы [82, 106, 119, 137 - 140].
Молекулярно-генетическая характеристика микроорганизмов
Хемотаксономические дескрипторы, в частности данные, отражающие особенности первичной структуры ДНК бактерий, имеют большую разрешающую способность. При этом анализируются нуклеотидный состав их ДНК и сходство в полинуклеотидных последовательностях ДНК (гомология ДНК). Согласно общепринятым нормам таксономической классификации штаммы одного вида при близких значениях содержания GC-пар в ДНК (допускается различие не превышающее 2-3 мол.%) характеризуются уровнем ДНК-ДНК гибридизации от 70 до 100%. Различные виды, относящиеся к одному роду, обычно по уровню гомологии занимают диапазон от 20 до 60%, для различных родов одного семейства сходство в первичной структуре ДНК не превышает 20% [53]. Более надежным критерием родового таксона является использование данных по анализу последовательности нуклеотидов в 16S РНК.
У исследуемых штаммов определяли нуклеотидный состав ДНК, который характеризуется содержанием GC-nap, и уровень гомологии ДНК методом ДНК-ДНК гибридизации между изученными и типовыми штаммами. При этом ДНК - зонды гибридизовали с соответствующими последовательностями денатурированной ДНК, входящими в состав хромосом с характерными морфологическими признаками.
Целью исследования являлась идентификация штаммов молочнокислых бактерий 31, 32 и В-6758 (АТСС 8014 - референтный штамм) предварительно отнесенных к Lactobacillus plantarum. ДНК из биомассы указанных штаммов выделена по методу Мармура, за исключением штамма В-6758 (АТСС 8014), для которого применялось растирание предварительно замороженной в жидком азоте биомассы с последующей обработкой суспензии бактерий протеиназой К и додецилсульфатом натрия.
Согласно общепринятым критериям степень очистки ДНК контролируется по соотношению Е260/Е230, свидетельствующей об удалении фракции полисахаридов (это соотношение должно находится в пределах 1,8-2,2) и Е260/Е280, указывающее на возможную примесь белков (удаление примеси белков регистрируется при соотношении выше 1,6). Результаты представлены в таблице 2.
Приведенные в таблице 2 данные свидетельствуют о высокой степени очистки полимерной ДНК и возможности ее использования для определения содержания GC-пар в ДНК и проведения последующей ДНК-ДНК гибридизации. Данные этих анализов содержатся в таблице 3.
Данные таблицы показывают, что все исследуемые штаммы имеют нуклеотидный состав в пределах 45-46 мол % GC и в то же время характеризуются высоким уровнем гомологии ДНК, превышающим 80%. Несомненно, их можно отнести к штаммам одного вида.
Согласно «Определителю бактерий» Берджи, известные представители вида Lactobacillus plantarum характеризуются содержанием GC-nap в ДНК в пределах 44-46 мол % и высоким уровнем гомологии.
Таким образом, все исследуемые коллекционные штаммы могут быть отнесены к виду Lactobacillus plantarum.
Штамм 38 был предварительно идентифицированного как Micrococcus caseolyticus. Согласно «Определителю бактерий» Берджи (1986,v.2, р. 1033), этот вид был реклассифицирован в Staphylococcus caseolyticus, так как известные виды Micrococcus имеют нуклеотидный состав от 66 до 73 мол % GC, а для "Micrococcus caseolyticus " это содержание составляет 38-39 мол %. В исследуемом коллекционном штамме содержание GC-nap составило 37,5 мол %. Таким образом, этот штамм может быть идентифицирован как Staphylococcus caseolyticus, непатогенный (согласно ежегодному альманаху Международной таксономической организации, март 2001г.). В 1998 году Kloos и др. реклассифицировали Staphylococcus caseolyticus в Macrococcus caseolyticus. Таким образом окончательно коллекционный штамм 38 был идентифицирован как Macrococcus caseolyticus.
Полученные результаты, показывают, что проведение идентификации микроорганизмов традиционно только по морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим признаком недостаточно. Для того чтобы исключить ошибки, которые могут возникнуть в процессе идентификации или для более четкой идентификации штамма следует также рассматривать и генетические характеристики, так как неправильная идентификация штаммов микроорганизмов не позволит получить продукта с заданными свойствами и характеристиками.
Применение микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности в технологии мяса и мясопродуктов обусловлено их способностью ферментировать редуцирующие сахара, формировать характерные вкус, цвет, аромат и структуру готового продукта, проявлять антагонистическую активность по отношению к санитар но-показательно и микрофлоре.
Потенциальная способность к проявлению этих свойств закодирована в генотипе бактериальной клетки в виде последовательности нуклеотидов в составе ДНК и передается от материнской клетки к дочерней. Большинство ДНК сформировано в виде единой бактериальной хромосомы.
Однако, в клетках микроорганизмов встречаются и внехромосомные генетические элементы - плазм иды (рисунок 2), которые в бактериальной клетке физически обособлены от хромосомы и способны к бесконечно долгому поддержанию и воспроизведению в такой форме [60, 61].
К настоящему времени плазмиды выявлены в бактериях многих видов, принадлежащих к родам Escherichia, Salmonella, Shigella, Aerobacter, Pseudomonas, Erwinia, Klebsiella, Bacteroides, Proteus, Serratia, Pasteurella, Alcaligenes, Haemophilus, Vibrio, Streptococcys, Staphilococcus, Streptomyces, Cauiobacter, Enterobacter, Listeria, Mycobacterium, Acinetobacter, Corynebacterium, Zymomonas, Neisseria, Bacillus, Clostridium, Yersinia, Agrobacterium. Они выявлены также в циенобактериях [60].
Размеры встречающихся в природе плазмид варьируют очень широко: от 1 до нескольких сотен тысяч нуклеотидных пар. Число копий плазмид на одну клетку строго определено и характерно для данного вида плазмид или, как говорят, для данной группы совместимости. Оно контролируется специальной системой, кодируемой плазмидой, которая определяет скорость инициации репликации, и соответственно в зависимости от группы плазмиды число копий варьирует от единицы до нескольких сотен.
В бактериальной клетке большинство плазмид находится в кольцевой ковалентно замкнутой форме. Как правило, кольцевые ковалентно замкнутые плазмиды находятся в бактериальной клетке в сверхспиральной форме, то есть эти кольцевые молекулы закручены сами на себя [60, 61]. Молекулы плазмидных ДНК, кроме того, могут обнаруживаться в виде открытых кольцевых форм. Однако, при использовании большинства методов выделения плазмид открытые кольцевые молекулы теряются [22, 60].
Плазмиды содержат генетическую информацию, которая по определению не является жизненно необходимой для бактерий-хозяев, хотя иногда они придают этим клеткам свойства, обеспечивающие их выживание в определенных условиях [61]. В частности выделяют плазмиды лекарственной резистентности, плазмиды бактериоциногении, энтеротоксигенности, гемолиза, К - антигенов, патогенности [22, 60], плазмиды биодеградации камфоры, нафталина, н — октана, салицилата, толуола и ксилола [22].
Бактериальные плазмиды способны к автономной репликации. Для своей репликации плазмиды используют репликативную машину клетки-хозяина, однако репликация плазмид происходит независимо от хромосомы. Каждая плазмида является самостоятельным репликоном, сама контролирует собственную репликацию и поддерживается в клетке в определенном, характерном для нее числе копий.
Изучение влияния скорости замораживания на выживаемость и активность бактериальных клеток
Скорость охлаждения клеток микроорганизмов является одним из важных факторов, определяющих механизм термодинамического равновесия паров в клетках, который может осуществляться двумя путями: дегидратацией клетки или внутриклеточным замораживанием. Медленное замораживание идет по первому пути, быстрое - по второму.
Скорость замораживания определяется скоростью движения фронта кристаллизации в образце. Для медленного замораживания она составляет до 2 мм/час, для быстрого -5- 30 мм/час.
Скорость замораживания, в свою очередь, зависит от способности клеток обезвоживаться, то есть от биологических свойств плазматических мембран клеток. Характер формируемых при этом кристаллов зависит главным образом от скорости охлаждения и концентрации компонентов в среде. При медленном охлаждении, как правило, формируются гексагональные формы льда, а при более быстром - кристаллы типа неправильных дендритов [17, 115, 130].
Точка замерзания воды в межклеточных пространствах и клетках составляет примерно - 1 С для дрожжей и - 2 С в бактериях. При кристаллизации внешней воды клеток внутриклеточная вода сильно переохлаждается. В такой переохлажденной внутри клеток жидкости более высокое давление паров и она обладает значительно большей энергией, чем внеклеточный лед. При дальнейшем понижении температуры давление пара будет продолжать понижаться. Такая неравновесная система будет стремиться к уравновешиванию, темпы которого зависят от скорости предварительного охлаждения. При быстром охлаждении скорость формирования устойчивых зародышей льда - центров кристаллизации будет увеличиваться по мере снижения температуры, а скорость их роста повышаться значительно медленнее. В результате очень быстрого охлаждения удается перевести воду в такое метастабильное состояние, которое характеризуется формированием центров кристаллизации без существенного роста кристаллов, т.е. жидкость переходит в так называемое стекловидное состояние. Это приводит к меньшей потере белковыми структурами клеток способности связывать воду при регидратации лиофилизированного биопрепарата [1].
При медленном охлаждении сформированные вначале центры кристаллизации вырастают, как правило, в более крупные кристаллы, прежде чем возникает возможность образования дополнительных центров кристаллизации, при этом внеклеточные кристаллы льда могут превышать размеры самих клеток. При быстром охлаждении температура обычно снижается до значений, при которых создаются условия образования множества мелких кристаллов. Таким образом, вследствие медленного охлаждения клеточной суспензии кристаллизация льда начинается во внешней среде, что приводит к прогрессирующей дегидратации и развитию крионекроза клеток. В процессе дегидратации в клетках прежде всего нарушается структурно-функциональное состояние мембранных компонентов клеток, поскольку они ассоциированы в основном с помощью слабых связей (водородных, электростатических, ионных, гидрофобных), быстро разрушающихся при замораживании. В липопротеиновых комплексах мембран обезвоженных клеток довольно быстро разрушаются гидрофобные связи, которые в обычных условиях стабилизируют ее структуру и препятствуют аномальному межмолекулярному взаимодействию. При этом нарушаются биосинтетические, энергетические и транспортные процессы в клетках, которые регулируются гидратным слоем воды, локализованным на биополимерах [1, 78].
Быстрое охлаждение клеток сопровождается возникновением внутриклеточных кристаллов, поскольку при этом клетка не успевает обезводиться. Чем выше скорость охлаждения, тем более мелкие кристаллы образуются внутри клетки. Однако очень мелкие кристаллы формируют в биомассе узкие по диаметру каналы, что замедляет процесс высушивания, так как скорость сублимации влаги ограничивается скоростью тепло- и массопереноса через пористые каналы высушиваемого препарата. Для удаления воды через такие узкие каналы необходимо приложить дополнительную тепловую энергию, что может привести к температурному повреждению микробных клеток в связи с их перегревом [2].
Для медленного замораживания характерен не только рост внеклеточного льда, но и развитие комплекса повреждающих факторов, так называемых эффектов растворенных веществ, из которых наиболее повреждающее действие оказывает изменение тоничности среды. Повышение концентрации солей и электролитов особенно в эвтектических зонах при замораживании вызывает подавление в клетке активности одних ферментов (гидрогеназ) и активацию других (липазы, каталазы, фосфолипазы). В результате низкотемпературной активации этих ферментов в клетке образуются и накапливаются продукты, оказывающие токсическое действие на белки [1, 78].
Денатурация белковых макромолекул при медленном замораживании может наступить уже в период переохлаждения при температуре от — 3 до — 5 С, так как резко снижается величина рН и повышается концентрация солей.
Таким образом, гиперконцентрационные эффекты, возникающие при замораживании клеточных суспензий, оказывают существенное влияние по крайней мере на два параметра: во-первых, на разрушение структуры вицинальной воды, поддерживающей нативную конформацию биомакромолекул, и, во-вторых, на дестабилизацию липид - липидных, липид-белковых комплексов мембран за счет разрушения структуры воды и изменения рН, что изменяет процессы протонирования в клетке.
У исследуемых культур было изучено влияние скорости предварительного замораживания на чувствительность к лиофилизации и сохранение промышленно-ценных свойств.
Клетки микроорганизмов после центрифугирования ресуспендировали в соответствующей протекторной среде в соотношении «бактериальная масса : протекторная среда» 1 : 1 и подвергали замораживанию с различной скоростью. После лиофилизации определяли устойчивость культур к критическим факторам, их активность в регидратированном состоянии по энергии (интенсивности) и пределу кислотообразования и способности к редукции нитратов. Результаты проведенных исследований позволили установить, что скорость замораживания не оказывает существенного влияния на выживаемость и стабильность свойств изучаемых штаммов микроорганизмов. Результаты исследований представлены в таблице 9.
Исследование влияния фазы роста клеток на их устойчивость и активность после лиофилизации
В сохранении жизнеспособности микроорганизмов после сублимационной сушки большую роль играют фракции подвижной и прочносвязанной воды. При переходе из одной фазы роста в другую клетки микроорганизмов претерпевают определенные структурно-морфологические перестройки, связанные прежде всего с обводненностью либо дегидратированностью тех или иных их компонентов. Результаты исследований разных фаз роста периодических культур показывают, что содержание подвижной воды в клетках после сублимации меняется как в фазе экспоненциального роста, так и в стационарной фазе. Как правило, в лаг-фазе доля подвижной воды с течением времени постепенно уменьшается, и уже в экспоненциальной фазе снижается на порядок. Переход к поздней фазе логарифмического роста сопровождается повторным увеличением фракции подвижной воды [17, 38].
Следовательно, стадия роста клетки играет весьма важную роль в реакции клетки на замораживание - высушивание, которая зависит от потери клетками связанной и прочносвязанной фракций воды при сублимационной сушке. Сохранение оптимального содержания этих фракций клетками обеспечивает, вероятно, более благоприятные условия восстановления их структурной организации при регидратации, и наоборот, удаление этих фракций устраняет механизмы репарации клеток, создает условия, необходимые для денатурации и деструкции мембранных структур [58].
Изучение разных фаз роста периодических культур молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus plantarum 31 и Lactobacillus plantarum 32 и денитрифицирующего микроорганизма Macrococcus caseolyticus 38 позволило избежать существенных повреждений клеточных структур при их лиофилизации (рисунок 17).
Бактерии выращивали в аппарате для культивирования микроорганизмов «АК-203» периодического действия. «АК-203» предназначен для обеспечения основных условий проведения процесса культивировании непатогенных дрожжевых и бактериальных микроорганизмов, находящихся в жидкой питательной среде включая и жидкие углеводороды. Аппарат «АК-203» может применяться для проведения научных микробиологических исследований в лабораторных условиях при изучении вопросов биохимии и физиологии микроорганизмов, в исследованиях микробиологической очистки сточных вод и производстве медпрепаратов, а также в пищевой и микробиологической промышленности. Ферментер укомплектован измерительными приборами и регулирующими устройствами.
Для аэрации среды при культивировании облигатных аэробов и факультативных анаэробов воздух от внешней магистрали поступает к системе ротаметров и от них через биофильтр и обратный клапан поступает в ферментер через отверстие в дне ферментера под крыльчатку перемешивающего устройства.
Регулирование температуры культуральной среды осуществляется с помощью электронного блока регулирования температуры, расположенного в приборе регулирования, термометра сопротивления и нагревателя с термометром, расположенных внутри ферментера и клапана регулирующего подачу охлаждающей воды в канале теплообменника ферментера. При уменьшении температуры от установленного значения регулятор включает нагреватель, а в случае увеличения температуры включает клапан для подачи в теплообменник ферментера охлаждающей воды.
Отбор проб культуральной среды производится с помощью проточного пробоотборника, включенного последовательно с циркуляционным насосом, управляемым пневмогенератором. При пережиме выходной трубки, внутри пробоотборника создается давление жидкости, которое открывает выходное отверстие пробоотборника, через которое в пробирку отбирается необходимое количество культуральной жидкости.
Измерение рОг в ферментере осуществляется с помощью датчика р02 и измерителя рОг.
Измерение рН жидкости осуществляется с помощью электрода измерительного, хлорсеребряного вспомогательного электрода и рН — преобразователя. Напряжение измерительного стеклянного электрода измеряется относительно электрода проточного, который предназначен для осуществления электрического контакта с контролируемым раствором.
Подача питательной среды, титрующих и пеногосящего компонентов в ферментер осуществляется с помощью четырехканального регулятора подачи расворов, четырех насосов, устройства установки расхода жидкости и четырех бутылей [6].
В ферментере объемом 3 дм был реализован глубинный динамический процесс культивирования с перемешиванием при помощи лопастно-дисковой мешалки. Процесс культивирования в аппарате «АК-203» полностью автоматизирован, что обеспечивает автоматическое поддержание заданных уровней концентраций компонентов среды и других условий.
Основными элементами комплекса «АК-203» - ЭВМ являются: ферментер с набором датчиков, измерительных и исполнительных устройств; ЭВМ со своими периферийными устройствами; устройство связи с объектом (УСО) - контроллер «АК - ЭВМ», осуществляющее сопряжение ЭВМ и ферментера; математическое обеспечение, включающее операционные системы и программы пользователя - «АК - PC Projekt».
Однако, предусмотрена возможность работы ферментационной аппаратуры как в режиме управления от ЭВМ, так и в автономном режиме.
Работа ферментера через контроллер управляется ЭВМ, имеющей соответствующее программное обеспечение. ЭВМ связана с измеряющими приборами и управляющими органами и обеспечивает автоматическую корректировку режима культивирования по мере изменения свойств культуры. Для контроля и оптимизации процесса ферментации использовались следующие параметры: температура, рН, рОг, скорость вращения перемешивающего устройства и расход пеногосящего титранта.
