Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Тромбогенный риск при эссенциальной артериальной гипертензии у детей (обзор литературы) 16
1.1. Современное представление о тромбофилиях 16
1.2. Система гемостаза и артериальная гипертензия у детей 30
1.3. Гены-участники гемостатических реакций и фолатного обмена 45
Глава 2. Методы и материалы исследования .58
2.1. Методы исследования 58
2.1.1. Клинико-анамнестический метод (особенности онтогенеза) 58
2.1.1.1. Скрининговая оценка генеалогического анамнеза .58
2.1.1.2. Акушерско-биологический анамнез .59
2.1.2. Физикальный метод .60
2.1.3. Функциональные и ультразвуковые методы 62
2.1.3.1. Электрокардиографическое исследование 62
2.1.3.2. Суточное мониторирование артериального давления 62
2.1.3.3. Эхогардиографическое исследование 63
2.1.4. Лабораторные методы 64
2.1.4.1. Исследование сосудисто-тромбоцитарного гемостаза 64
2.1.4.2. Исследование коагуляционного гемостаза 65
2.1.4.3. Исследование факторов свертывания крови .66
2.1.4.4. Исследование физиологических антикоагулянтов 66
2.1.4.5. Исследование фибринолиза .67
2.1.4.6. Исследования на наличие антифосфолипидного синдрома 67
2.1.4.7. Молекулярно-генетический метод .68
2.1.5. Методы статистического анализа .68
2.2. Материалы исследования 69
Результаты исследования и их обсуждение
Глава 3. Особенности онтогенеза детей с эссенциальной артериальной гипертензией, имеющих повышенный риск развития тромбозов 75
3.1. Скрининговая оценка генеалогического анамнеза у детей с эссенциальной артериальной гипертензией, имеющих повышенный риск развития тромбозов .75
3.2. Оценка акушерско-биологического анамнеза у детей с эссенциальной артериальной гипертензией .83
3.2.1. Социально-биологические факторы риска у обследованных детей с эссенциальной артериальной гипертензией 83
3.2.2. Особенности акушерско-гинекологического анамнеза у матерей обследованных детей с эссенциальной артериальной гипертензией .85
3.3. Адаптация обследованных детей с эссенциальной артериальной гипертензией к рождению и к условиям внеутробной жизни 91
Глава 4. Клиническая характеристика обследованных детей .100
Глава 5. Особенности нарушений в системе гемостаза у детей, имеющих повышенный риск развития тромбозов при эссенциальной артериальной гипертензии .107
5.1. Особенности параметров сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у обследованных детей 107
5.2. Особенности скрининговых параметров коагуляционного гемостаза у обследованных детей 115
5.3. Исследование факторов свертывания крови внутреннего (ФVIII, ФIX, ФXI, ФXII), внешнего (ФVII) и общего (ФX, ФV, ФII) путей активации коагуляционного гемостаза у обследованных детей .119
5.4. Особенности системы физиологических антикоагулянтов у обследованных детей .125
5.5. Особенности фибринолиза у обследованных детей 128
5.6. Оценка тестов на наличие антифосфолипидных антител у обследованных детей 130
Глава 6. Генетические маркеры тромбогенного риска у детей с эссенциальной артериальной гипертензией .133
6.1. Гены-участники гемостатических реакций и фолатного обмена у детей с эссенциальной артериальной гипертензией 133
6.1.1. Анализ частотных характеристик полиморфизма G20210A гена-кандидата FII 134
6.1.2. Анализ частотных характеристик полиморфизма R506Q гена-кандидата FV 136
6.1.3. Частотные характеристики полиморфизма R353Q гена-кандидата FVII и анализ ассоциации FVII с параметрами гемостаза 138
6.1.4. Распределение частот генотипов и аллелей гена-кандидата PAI-1 и анализ его ассоциации с параметрами гемостаза 142
6.1.5. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизмов Т677С и А1298С гена-кандидата MTHFR и анализ его ассоциации с параметрами гемостаза .147
6.1.6. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма A66G гена-кандидата MTRR и анализ его ассоциации с параметрами гемостаза 157 6.2. Анализ аутогенетических механизмов тромбофилических состояний у детей с эссенциальной артериальной гипертензии .163
Глава 7. Выявление ранних маркеров тромбогенного риска у детей с эссенциальной артериальной гипертензией .169
аключение .177
Выводы 191
Практические рекомендации 193 Приложения 195
- Гены-участники гемостатических реакций и фолатного обмена
- Скрининговая оценка генеалогического анамнеза у детей с эссенциальной артериальной гипертензией, имеющих повышенный риск развития тромбозов
- Особенности параметров сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у обследованных детей
- Частотные характеристики полиморфизма R353Q гена-кандидата FVII и анализ ассоциации FVII с параметрами гемостаза
Введение к работе
Актуальность проблемы
Тромбозы, равно как и эссенциальная артериальная гипертензия (ЭАГ), несмотря на значительные успехи современной медицины, занимают одно из доминирующих мест в патологии человека и являются основными причинами смерти взрослого населения Земли [Автандилов А.Г., 2003; Баркаган З.С., Момот А.П., 2006; ВОЗ, 2012; Guo F., Di H., Zhang W. et al., 2012].
Частота тромбозов в популяции высока и составляет 1 случай на 1000 человек [Баркаган З.С., 2006; ВОЗ, 2012], а ЭАГ - 40% взрослого населения [Кобалава Ж.Д. и др. 2009; Оганов Р.Г., Тимофеева Т.Н., Колтунов И.Е., 2011]. Россия имеет один из самых высоких показателей смертности от инсультов в мире, при этом в России люди моложе 45 лет с инсультами составляют 5-15% [Баркаган З.С., 2006; Варавская Ю.В., ЦывкинаЛ.П., 2007]. В большинстве работ, посвященных ишемическому инсульту, анализируется роль ЭАГ в развитии этого осложнения [Скворцова В.И., 2006; Суслина З.А., 2008].
При этом, проблема ЭАГ, как и тромбоза важна и для педиатрии, поскольку ЭАГ существенно «помолодела» за последние десятилетия, а проблемы ранних тромботических эпизодов в детском и подростковом возрасте имеют отчетливую тенденцию к росту в течение последних лет [Долгих В.В., 2004; Леонтьева И.В., 2006; Момот А.П., 2006; Подчерняева Н.С., 2006; Кисляк О.А., 2007]. Частота встречаемости ЭАГ среди детей и подростков является высокой и составляет 4,8-18,0% [Леонтьева И.В., 2006; Кисляк О.А., 2007; Долгих В.В., Колесникова Л.И., 2008], а тромбозов - 5,3 случая на 10 000 детей, при этом в половине случаев инсульты имеют ишемическую природу [Подчерняева Н.С., 2006; Чупрова А.В., 2007; Nowak-Gotti U. et al., 2008; Rosner B. et al., 2009].
Важными факторами возникновения тромботических осложнений при ЭАГ, согласно современным представлениям, являются нарушения в системе гемостаза [Гантимурова О. Г., 2005; Вострикова Н.В., 2012; Hamm C.W., Bassand J.P. et al., 2011].
В настоящее время изучению системы гемостаза при ЭАГ у взрослых
посвящено значительное количество исследований, что во многом
способствовало снижению частоты осложнений данной патологии в общей
популяции [Бокарев И.Н., Крамарева В.Н., Ена Я.М. 2011; Вострикова Н.В.,
Мамаев А.Н., Фёдоров Д.В., 2012; Din-Dzietham R., Liu Y., Bielo M.V., 2007]. В
педиатрии научно-исследовательские работы в этом направлении, к
сожалению, крайне малочисленны [Нефедова Ж.В., 2007; Чупрова А.В., 2007;
Строгий В.В., 2011; Стуров В.Г., 2011; Lurbe E., 2009], существенно
отличаются по методическому уровню, часто имеют противоречивый характер и, как правило, фрагментарны. Остаются не до конца изученными особенности онтогенеза у детей с ЭАГ, имеющих повышенный риск развития тромбозов (ПРРТ). Важность оценки молекулярно-генетических маркеров системы гемостаза при ЭАГ не вызывает сомнения, однако, данные об особенностях распространенности генов-участников гемостатических реакций и фолатного
обмена в детской популяции немногочисленны, а данные об их взаимосвязи с параметрами гемостаза отсутствуют [Строзенко Л.А., Момот А.П., Лобанов Ю.Ф. и др., 2012; Spiroski I. et al., 2008; Trabetti E., 2008].
Важность проблемы ЭАГ у детей, связанной с высокой
распространенностью заболевания, большим риском его трансформации в
гипертоническую болезнь и возникновением тромботических осложнений,
недостаточной изученностью системы гемостаза, отсутствием данных о
взаимосвязи генов-участников гемостатических реакций и фолатного обмена с
показателями гемостаза не вызывает сомнения и послужила поводом для
проведения комплексной оценки тромбогенного риска при ЭАГ у детей для
выделения группы тромбогенного риска, своевременной первичной
тромбопрофилактики.
Работа выполнена в рамках двух гос. бюджетных тем: «Закономерности формирования артериальной гипертензии у детей и подростков разных этнических групп в зависимости от средовых воздействий» (гос. регистрационный номер № 01200609986) и «Кардиометаболические нарушения у детей и подростков как патогенетическая основа формирования высокого кардиоваскулярного риска» (гос. регистрационный номер № 01201282419).
Все вышеизложенное определило основную цель и задачи настоящего исследования.
Цель работы: комплексная оценка наследственно-биологических,
клинико-лабораторных и молекулярно-генетических показателей для
выявления ранних маркеров тромбогенного риска при ЭАГ у детей.
Для достижения данной цели нами последовательно решались следующие задачи:
-
Изучить особенности онтогенеза детей, имеющих повышенный риск развития тромбозов при эссенциальной артериальной гипертензии.
-
Выявить особенности нарушений в системе гемостаза у детей, имеющих повышенный риск развития тромбозов при эссенциальной артериальной гипертензии.
-
Провести сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфных генов-участников гемостатических реакций (FII, FV, FVII, PAI-1) и фолатного обмена (MTHFR, MTRR) у здоровых детей и у пациентов с эссенциальной артериальной гипертензией без нарушений и с нарушениями в системе гемостаза.
-
Изучить ассоциации полиморфизмов генов-участников гемостатических реакций и фолатного обмена с показателями гемостаза, а также описать межгенные взаимодействия и их роль в формировании гемостаза.
-
На основе изученных наследственно-биологических, клинико-лабораторных и молекулярно-генетических показателей выявить ранние маркеры тромбогенного риска у детей с эссенциальной артериальной гипертензией.
Научная новизна
Впервые определены онтогенетические особенности детей с ЭАГ,
имеющих повышенный риск развития тромбозов. Установлено, что у детей с
ЭАГ, имеющих повышенный риск развития тромбозов, чаще наблюдаются
отягощенный тромботический генеалогический анамнез (раннее развитие
тромбозов) у родственников по отцовской и обеим линиям родства в сочетании
с наследственной отягощенностью по ЭАГ. Выявлено, что в биологическом
анамнезе у детей с ЭАГ, имеющих повышенный риск развития тромбозов,
отмечается повышенный риск в социальном анамнезе (курение матери),
осложненное течение перинатального периода (угроза прерывания
беременности во II половине у матери, поздний гестоз у матери, хроническая внутриутробная гипоксия плода), на фоне которого отмечено развитие гипотрофического варианта задержки внутриутробного развития и других морфофункциональных отклонений высокого риска (группа здоровья II Б) у новорожденных детей.
При комплексном исследовании системы гемостаза выявлены особенности
гемостатических нарушений у детей при ЭАГ, имеющих повышенный риск
развития тромбозов: гиперагрегационный синдром тромбоцитов, увеличение
активности и содержания фактора Виллебранда, повышение концентрации
фибриногена, тромбинемия. Установлено, что у детей с ЭАГ одновременно со
свертывающей системой активируется фибринолитическая система
(увеличивается активность плазминогена).
Получены новые данные об особенностях структуры генофонда детского
населения Восточной Сибири по генам FII, FV, FVII, PAI, MTHFR, MTRR.
Установлена ассоциация аллельных вариантов генов-участников
гемостатических реакций и фолатного обмена с параметрами гемостаза у детей–европеоидов с ЭАГ.
Впервые на основе изучения наследственно-биологических, клинико-лабораторных и молекулярно-генетических показателей при помощи дискриминантного анализа выявлены ранние маркеры тромбогенного риска у детей с ЭАГ.
Теоретическая и практическая значимость работы
Выявленные нарушения в онтогенезе детей с ЭАГ, имеющих повышенный риск развития тромбозов, могут быть учтены при формировании диспансерной группы по тромбогенному риску у пациентов у детей с ЭАГ.
Установленные особенности нарушений в системе гемостаза у детей, имеющих повышенный риск развития тромбозов при ЭАГ, позволяют использовать полученные результаты для более раннего выявления тромбогенного риска при ЭАГ у детей.
Установлены данные о распространенности генотипов и аллелей полиморфных генов-участников гемостатических реакций и фолатного обмена у детей с ЭАГ.
Полученные данные об ассоциации полиморфных вариантов генов FII, FV, FVII, PAI, MTHFR, MTRR дополняют фундаментальные знания о генетическом компоненте гемостаза и могут быть использованы в учебном процессе ВУЗов биологического и медицинского профиля. Новые данные, касающиеся ассоциации полиморфных вариантов генов FII, FV, FVII, PAI, MTHFR, MTRR с параметрами гемостаза, могут быть учтены при организации лечебно-профилактических мероприятий и формировании групп риска развития тромбозов у пациентов с сердечно-сосудистой патологией.
По результатам дискриминантного анализа совокупности вероятных факторов тромбогенного риска выявлены ранние маркеры тромбогенного риска у детей с ЭАГ, которые позволяют выделить отдельную группу детей с повышенным риском развития тромбозов при ЭАГ для проведения первичной тромбопрофилактики. Построенная статистическая модель дает возможность с достоверностью 88,2% отнести пациента с ЭАГ к группе повышенного риска развития тромбозов. Практическая ценность результатов, полученных при дискриминантном анализе, заключается в том, что из 45 вероятных маркеров тромбогенного риска, отобранных в результате сравнительного анализа из начальных 86, установлено 10 наиболее информативных, то есть тех, которые могут быть предложены для использования в рутинной клинической практике, что является экономически выгодным.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Онтогенетические особенности детей с ЭАГ, имеющих повышенный риск развития тромбозов: отягощенный тромботический генеалогический анамнез (раннее развитие тромбозов) у родственников по отцовской и обеим линиям родства в сочетании с наследственной отягощенностью по ЭАГ, повышенный риск в социальном анамнезе (курение матери), осложненное течение перинатального периода (угроза прерывания беременности во II половине у матери, поздний гестоз у матери, хроническая внутриутробная гипоксия плода), развитие гипотрофического варианта задержки внутриутробного развития, преобладание морфофункциональных отклонений высокого риска (группа здоровья II Б) у новорожденных детей.
-
У детей с ЭАГ, имеющих повышенный риск развития тромбозов, имеются нарушения в системе гемостаза, которые проявляются гиперагрегационным синдромом тромбоцитов, увеличением активности и содержания фактора Виллебранда, повышением концентрации фибриногена, тромбинемией. У детей с ЭАГ одновременно со свертывающей системой активируется фибринолитическая система (увеличивается активность плазминогена).
-
Вариабельность показателей системы гемостаза у пациентов с ЭАГ генетически детерминировна, в том числе межгенными комбинациями генов-участников гемостатических реакций и фолатного обмена. Аллельные варианты генов FVII, PAI, MTHFR, MTRR у детей-европеоидов с ЭАГ ассоциированы с параметрами гемостаза.
4. Ранними маркерами тромбогенного риска у детей с ЭАГ являются:
индуцированная агрегация тромбоцитов с АДФ, коллагеном, арахидоновой кислотой, ристоцетином, концентрация фибриногена, уровень РФМК, активность плазминогена, содержание фактора Виллебранда, полиморфизм С677Т гена MTHFR, отягощенность тромботического генеалогического анамнеза по отцовской линии.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на VII Российском
конгрессе «Современные технологии в педиатрии и хирургии» (Москва, 2008);
XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в
медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта, 2010); VII
Всероссийской научно-практической конференции с международным
участием «Молекулярная диагностика – 2010» (Москва, 2010); XV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011); Международной конференции «Фундаментальная медицина: от скальпеля – к геному, протеому и липидому» (Казань, 2011); XIII Всероссийском научно-образовательном форуме «Кардиология 2012» (Москва, 2012); XVI конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2012); VI Российском форуме «Здоровье детей: профилактика и терапия социально-значимых заболеваний. Санкт-Петербург – 2012» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Кардиоваскулярная профилактика и реабилитация 2012» (Барнаул, 2012), XIV Конгрессе Российского общества холтеровского мониторирования и неинвазивной электрофизиологии и VI Всероссийском конгрессе «Клиническая электрокардиология» (Москва, 2013).
Результаты исследований внедрены в Клинике ФГБУ «НЦ ПЗС И РЧ» СО РАМН, Ивано-Матренинской городской детской клинической больнице г. Иркутска, лечебных учреждениях г. Улан-Удэ и г. Читы, в учебном процессе кафедры педиатрии факультета повышения квалификации и профессиональной подготовки специалистов ГБОУ «Иркутский государственный медицинский университет».
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, в том числе 12 статей в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертации
Гены-участники гемостатических реакций и фолатного обмена
Известно, что болезни с наследственной предрасположенностью возникают у людей с соответствующим генотипом (сочетание «предрасполагающих» аллелей) при провоцирующем действии факторов среды [Баранов В.С. и соавт., 2003; Вашукова Е.С. и соавт., 2008; Favorov A.V., Andreewski T.V., Sudomoina M.A. et al., 2005]. Кроме моногенных наследственных заболеваний, обусловленных мутациями в одном определенном для каждого заболевания гене, значительное число болезней являются, так называемыми, сложно наследуемыми или мультифакториальными (наследственно предрасположенные, многофакторные, «Сomplex genetic disorders») - это большая и нозологически разнообразная группа болезней, развитие которых определяется взаимодействием множества причин - как генетических, так и обусловленных средой [Бочков Н.П., 2004; Nooraudah A.R. et al., 2004]. На сегодняшний день накоплено большое количество данных о роли генетических факторов в этиологии наследственных и мультифакториальных заболеваний. Причинами поломок и искажения программы индивидуального развития могут быть мутации, когда вероятность заболеваний близка к 100% (наследственные болезни), или генетический полиморфизм, когда вероятность развития болезни зависит от сочетания функционально неполноценных генов – предрасположенности и состояния неблагоприятных факторов внешней среды [Баранов В.С. и соавт., 2009; Favorov A.V., Andreewski T.V., Sudomoina M.A. et al., 2005].
В настоящее время, благодаря многочисленным популяционным исследованиям, стало ясно, что ТФ является мультифакториальным и полигенным патологическим состоянием [Баркаган З.С., 2001; Воробьев А.И., 2007; Момот А.П., 2011; Robetorye R.S., Tormene D., Simioni P., Prandoni P. et al., 2002]. Лица с несколькими генетическими факторами риска развития тромботических осложнений или комбинацией генетических и приобретенных факторов имеют больший риск, чем индивидуумы с одним наследственным нарушением гемостаза [Баранов В.С. и соавт., 2009].
При наследственных ТФ вклад генетических факторов является весьма существенным. Прослеживается семейное накопление этих заболеваний, и среди родственников больного частота этих состояний превышает среднюю в популяции [Баранов В.С. и соавт., 2003; Бочков Н.П., 2004; Nooraudah A.R. et al., 2004]. В патогенезе наследственных форм ТФ представлены генетические дефекты всех звеньев системы гемостаза. Повышенная наследственная склонность к тромбообразованию может быть обусловлена мутациями в генах, кодирующих коагуляционные факторы, антикоагулянтную и фибринолитическую системы, гликопротеины тромбоцитарных рецепторов и ферменты, участвующих в обмене ГЦ [Баранов В.С. и др., 2003; Вашукова Е.С. и соавт., 2008; Cattaneo M., 2003].
По данным литературы, к настоящему времени выявлено более 1500 различных генетических дефектов при ТФ [Вашукова Е.С., Глотов А.С., Канаева М.Д. и др., 2011]. В многочисленных исследовательских работах выявлены наиболее часто встречающиеся наследственные формы ТФ: Лейденовская аномалия (резистентность ФV к активированному ПС, АРС-резистентность, FV-Лейден), полиморфизм гена протромбина G20210А, дефицит АТ-III, дефицит ПС, дефицит ПS, ГГЦ [Баркаган З.С. и др., 2004; Романова А.Ф., Выговская Я.И., Логинский В.Е. и др., 2006].
Наиболее часто встречающимся наследственным дефектом, приводящим к ТФ, является Лейденовская аномалия (резистентность ФV к активированному ПС, АПС-резистентность, FVLeiden) [Воробьёва Н.М., Хасанова З.Б., Коновалова Н.В. и др., 2010; Kujovich J.L., 2011]. По данным многочисленных популяционных исследований у представителей европейской расы частота Лейденовской аномалии составляет 3 - 8% [Калашникова Е.А., Кокаровцева С.Н., Коваленко Т.Ф. и др., 2006; Castoldi E., Brugge J.M., Nicolaes G.A. et al., 2004]. FVLeiden редко встречается среди жителей Азии, Африки и Южной Америки. Обнаруживается у 50% больных с наследственными ТФ, 20% - c первым эпизодом тромбоза и у 60% - с тромбозами [Simioni P., Castoldi E., Lunghi B. et al., 2005; Arsov T., Miladinova D., Spiroski M., 2006]. Частота встречаемости носительства FVLeiden при венозных тромбозах значительно превышает таковую в популяции и составляет от 15 до 60% [Simioni P., Castoldi E., Lunghi B. et al., 2005; Arsov T., Miladinova D., Spiroski M., 2006]. Гетерозиготная форма увеличивает риск развития тромбоза в 3-7 раз, а гомозиготная – в 80 раз [Чучин М.Ю., 2005; Folsom A.R., Cushman M., Tsai M.Y. et al., 2002]. Гомозиготные формы, как правило, несовместимы с жизнью (гибель наступает внутриутробно или в первые дни жизни). В подавляющем большинстве речь идет о гетерозиготном носительстве, а гомозиготное - встречается редко (0,1%) [Воронина Е.Н., 2004; Чучин М.Ю., 2005]. При сочетании Лейденовской аномалии с другими ТФ: дефицитом ПС, ПS, ГГЦ, приобретенными ТФ риск развития тромбоза увеличивается в 10-40 раз [Чучин М.Ю., 2005; Folsom A.R. et al., 2002]. Первый тромботический эпизод обычно развивается в возрасте 10 лет и старше. Однако данная мутация очень часто регистрируется при тромботическом эпизоде у новорожденного и грудного ребенка [Duran R., Biner B., Demir M. et al., 2005]. Ген FV локализован на хромосоме 1 (1q24.2) [Naess I.A., Christiansen S.C., Romundstad P.R. et al., 2007; Dahlback B., 2008]. У пациентов с АПС резистентностью имеется точковая мутация FV. Следствием указанной мутации FV является повреждение системы ПС. Замена гуанина на аденин в положении 1691 в гене FV приводит к замене аминокислоты аргинина на глутамин в положении 506 (Arg506Gln), сответствующем главному сайту специфического расщепления ФV, осуществляемого естественным антикоагулянтом - активированным ПС. В результате мутации замедляется деградация ФVа, стабилизируется протромбиназный комплекс (ФX+ФV+Са+фосфолипиды), отмечается увеличение скорости образования тромбина, вследствие чего могут усиливаться прокоагулянтные свойства крови, может развиться резистентность активированного ПС.
Прокоагулянтное действие ФV может быть усилено за счет активации ингибитора фибринолиза тромбином. Кроме того, выступая в роли кофактора при расщеплении ФVIII (ФVIIIа) в реакции с активированным ПС, ФV может замедлять деградацию ФVIIIа [Вашукова Е.С. и др., 2011; Van Stralen K.J. et al., 2008]. Как зарубежными, так и российскими исследователями показано, что FVLeiden определяет состояние резистентности активированного ПС в 90-95% случаев [Шейдина А.М., Сироткина О.В., Пчелина С.Н. и др., 2005; Gadelha T., Roldan V., Lecumberri R. et al., 2010; Shaheen K., Alraies M.C., Alraies A.H. et al., 2012].
Также установлено, что Лейденовская аномалия является не только фактором риска развития венозных тромбозов, но и ИМ, ИИ [Ehrenforth S., Nemes L., Mannhalter C. et al., 2004].
В развитии ТФ важную роль играет полиморфизм G20210А в гене протромбина (FII). Наследование осуществляется по аутосомно доминантному типу. Распространенность гетерозиготной формы составляет 2-3% в общей популяции и 6,2% у больных с венозными тромбозами [Козловская Н.Л., 2003; Калашникова Е.А., Кокаровцева С.Н., Коваленко Т.Ф. и др., 2006]. Полиморфизм G20210А протромбина чаще обнаруживается у жителей Средиземноморья и несколько реже среди населения Северной Европы. В популяциях коренных жителей Азии и Африки полиморфизм гена протромбина, так же как и аномалия Лейдена, практически не встречается [Капустин С.И., 2007]. Гетерозиготная форма увеличивает риск развития тромбоза в 3-5 раз. Клинически ее можно заподозрить по постоянно высокому уровню протромбина в плазме (у 87% носителей превышает 115%). Мутация G20210А сопряжена с высоким риском не только венозных, но и артериальных тромбозов с развитием ИИ и ИМ у молодых пациентов [Kyrle P.A., Minar E., Bialonczyk C. et al., 2004].
Ген локализован на хромосоме 11 (11p11.2) [Naess I.A., Christiansen S.C., Romundstad P.R. et al., 2007; Rosendaal F.R., Reitsma P.H., 2009]. Мутация протромбина G20210А локализована в 3 -концевой нетранслируемой области гена и характеризуется заменой нуклеотида гуанина на аденин в позиции 20210. Механизм прокоагулянтного действия данного полиморфизма связан с усилением синтеза протромбина у носителей аллели G20210А вследствие увеличения стабильности мРНК фактора II и/или повышения эффективности ее трансляции [Вашукова Е.С., Глотов А.С., Иващенко Т.Э. и др., 2008]. Полиморфизм G20210А в гене протромбина сопряжен с высоким риском не только венозных, но и артериальных тромбозов, с развитием ИИ и ИМ у молодых пациентов [Kyrle P.A., Minar E., Bialonczyk C. et al., 2004]. Одну из ключевых ролей в коагуляционном гемостазе играет ФVII. Распространенность полиморфного варианта гена FVII в европейской популяции составляет 10-20% [Mo X., Hao Y., Yang X. et al., 2011]. Выявлено, что наследственные дефекты гена FVII (локус 13q34) могут увеличивать/уменьшать риск тромбозов за счет повышения/снижения концентрации фактора в несколько раз у носителей различных генетических вариантов [Smith N. L., Chen M.H., Dehghan A. et al., 2010; Criado-Garca J., Fuentes F., Cruzeno C.et al., 2011]. Концентрация и активность ФVII прямо коррелирует с развитием ИМ и частотой летальных исходов от него [Ruddock V., Meade T.W., 1994]. При этом, высокое содержание ФVII сопровождается значительным повышением риска тромботических осложнений на фоне гормональной терапии, особенно в сочетании с курением, ожирением и сахарным диабетом. Существуют также полиморфные варианты гена FVII, значительно снижающие риск тромбообразования [Андреенко Е.Ю., 2010]. Одним из таких вариантов является полиморфизм гена FVII по каталитическому региону (R353Q), связанный с замещением гуанина на аденин в позиции 353, что приводит к замене аргинина на глютамин в цепочке белка, и оказывающий протективный эффект в отношении развития тромбоза [Кисляк О.А., 2007]. Установлено, что наиболее распространенный в популяции генотип R/R является фактором риска тромбоза, а полиморфные варианты R/Q и Q/Q значительно уменьшает данный риск за счет снижения концентрации и активности FVII (примерно на 25% при носительстве R/Q, на 50% – при носительстве Q/Q по сравнению с обычными носителями варианта R/R) [Ogawa M., Abe S., Biro S. et al., 2004]. В работе Е.Ю. Андреенко (2010) установлено, что у больных с ранним развитием ИБС в сравнении со здоровыми лицами частота генотипа Q/Q меньше в 8,4 раза, что подтверждает протективный эффект данного генотипа в отношении развития тромбоза.
Скрининговая оценка генеалогического анамнеза у детей с эссенциальной артериальной гипертензией, имеющих повышенный риск развития тромбозов
Тромбозы и ЭАГ, равно как и другие, социально-значимые распространенные болезни, относят к самой обширной группе многофакторных заболеваний (МФЗ) - болезням с наследственной предрасположенностью. Общая концептуальная модель причин возникновения и развития МФЗ включает взаимодействие генетических, эпигенетических, средовых и стохастических факторов (рис. 3.1). Генетический контроль развития болезни можно объяснить аддитивным действием множества генов или основным влиянием одного из них и модифицирующим действием остальных на клинические признаки заболевания [Пузырев В.П., 2012]. Важным фактором развития и прогрессирования ЭАГ, согласно современным представлениям, являются нарушения в системе гемостаза [Гантимурова О.Г., 2005; Бокарев И.Н., 2011]. Однако, возможный вклад полиморфных генов-участников гемостатических реакций и фолатного обмена в увеличение риска развития тромбозов при ЭАГ у детей к настоящему времени окончательно не установлен [Carod-Artal F.J., 2005]. Необходимо отметить, что человеческий геном, по всей видимости, плохо адаптирован, свидетельством чего является омоложение многих МФЗ в условиях глобальных изменений окружающей среды [Пузырев В.Л., 2012]. Известно, что выявление наследственной этиологии распространенных заболеваний, в том числе ЭАГ и тромбозов, можно условно разделить на: индивидуально-семейный уровень (генеалогия), уровень популяции (эпидемиология) и генома (геномика), тесно взаимосвязанных. Для изучения генеалогии нами в родословную было включено три поколения с наиболее полным исследованием ее по восходящему, нисходящему и боковым направлениям. В родословную, в наших исследованиях, были включены два признака (болезни) - ЭАГ и тромбозы.
Генеалогический анамнез собирался с целью установления у родственников I-ой, II-ой, III-ей степени родства ГБ, подъемов АД, случаев раннего наступления ИМ, ИИ, тромбоза глубоких или поверхностных вен, внезапной смерти, смерти в молодом возрасте в семьях детей с ЭАГ в зависимости от наличия или отсутствия ПРРТ.
Наследственная отягощенность по ЭАГ обследованных детей представлена в таблице 3.1.
Исследования показали, что у 6 (15,0%) детей I-ой, 31 (47,7%) – II-ой и 77 (73,3%) - III-ей группы имеется наследственная отягощенность по ЭАГ (2=41,37 и р=0,00001 при сравнении всех групп и 2=10,31 и р=0,001 при сравнении III и II группы). Таким образом, имеет место повышение степени наследственной отягощенности по ЭАГ от I-ой к III-ей группе исследования, причем в семьях, в которых болен один из родителей преобладает вариант с больной матерью (I группа – 3 (7,5%), II группа – 24 (36,9%), III группа – 44 (41,9%)) (2=15,73 и р=0,0001 при сравнении всех групп).
Для скрининговой количественной оценки отягощенности генеалогического анамнеза используют скрининговый количественный показатель - индекс отягощенности (ИО).
Формула, по которой определяют ИО, а также интерпретация скринингового количественного показателя представлена в соответствующей главе 2, разделе 2.1.
Наследственная отягощенность по ЭАГ в зависимости от линий наследования представлена на рисунке 3.2.
Наследственная отягощенность по ЭАГ у обследованных детей в зависимости от линий отягощенности (%).
Примечание: - р2 0,05 при сравнении с I группой; # - р2 0,05 при сравнении со II группой.
Исследования показали, что в семьях детей III группы родственники II-ой и реже III-ей линии родства в 102 (97,1%) случах имели «гипертонический» анамнез.
ИО генеалогического анамнеза по ЭАГ был выше у детей с ЭАГ в отличие от группы контроля и составил в I, II и III группах 0,19±0,12, 0,47±0,07 и 0,76±0,18 соответственно (р=0,01). При сравнительном анализе значимые различия были выявлены между I и III, а также II и III группами (p=0,01 и p=0,02 соответственно).
При этом, во II и III группах встречаемость неотягощенного генеалогического анамнеза была ниже (34 (52,3%) и 28 (26,7%) соответственно), чем в I группе (34 (85,0%)) (2=10,21, р=0,001 - при сравнении со II группой, 2=37,92, р=0,00001 при сравнении с III группой) (рис. 3.3). Среди всех групп данный показатель был наименьшим у детей с ЭАГ с ПРРТ (2=10,31, р=0,001 при сравнении II и III групп).
Особенности параметров сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у обследованных детей
В настоящее время многими исследователями установлено, что развитие и формирование ЭАГ сопровождается закономерным усилением внутрисосудистой активации тромбоцитов, что позволяет говорить наличии о гиперагрегационного синдрома при данной патологии [Жук М.Ю., 2003; Мингазетдинова Л.Н., 2004; Нефедова Ж.В., 2007; Чупрова В.Г., 2007; Стуров В.Г., Соболева М.К., 2011]. Как известно, гиперагрегационный синдром тромбоцитов является тромбофилическим состоянием, которое приводит к частому возникновению тромботических осложнений [Баркаган З.С., Момот А.П., 2006; Воробьев А.И., 2005].
Первоначально нами проводилась оценка количества тромбоцитов. Количество тромбоцитов в I, II и III исследуемых группах находилось в пределах референтных значений и составило 276,9±20,5хЮ9/л, 280,Ш9,1хЮ9/л и 278,5±19,5хЮ9/л соответственно.
Следующим этапом работы было исследование индуцированной агрегации тромбоцитов (скорости и степени агрегации) с АДФ, адреналином, коллагеном, арахидоновой кислотой и ристоцетином. При исследовании агрегации с данными индукторами у детей с ЭАГ была констатирована активация агрегации тромбоцитов. Полученные результаты скорости и степени агрегации тромбоцитов с различными индукторами представлены в таблице 5.1. - рМ-и 0,05 при сравнении с контролем; - рМ_и 0,01 при сравнении с контролем; - рМ-и 0,001 при сравнении с контролем; - рМ-и 0,0001 при сравнении с контролем; - рМ_и 0,05 при сравнении с показателями II группы; ##- рМ-и 0,01 при сравнении с показателями II группы; ш- рМ-и 0,001 при сравнении с показателями II группы; - рМ-и 0,00001 при сравнении с показателями II группы.
Как видно из таблицы 5.1, у всех детей из I и II групп показатели степепени агрегации тромбоцитов со всеми исследуемыми индукторами находились в пределах референтных значений. Сравнительный анализ средних значений показателей индуцированной агрегации у детей III и I группы позволил выявить статистически значимые различия. Так, у детей III группы степень агрегации с АДФ, адреналином, коллагеном, арахидоновой кислотой и ристоцетином была увеличена и значимо отличалась от аналогичного показателя у здоровых детей на 6,3%, 6,5%, 7,2%, 8,9% и 14,5% (р=0,0003, р=0,03, р=0,008, р=0,00001 и р=0,0007 соответственно). При этом, наиболее значимым было повышение чувствительности к таким физиологическим индукторам агрегации, как арахидоновая кислота, АДФ и ристоцетин. Таким образом, в III группе детей степень агрегации с АДФ, адреналином, коллагеном, арахидонатом и ристоцетином была выше и значимо отличалась от данных показателей в I группе.
Кроме этого, значимые межгрупповые различия были определены при попарном сравнении детей III и II группы. У детей III группы степень агрегации с АДФ, адреналином, коллагеном, арахидоновой кислотой и ристоцетином была значимо выше и отличалась от данных показателей группы детей II группы на 6,6%, 8,0%, 5,4%, 12,6% и 10,3% соответственно (р=0,00001, р=0,004, р=0,02, р=0,00001 и р=0,003 соответственно). Наиболее значимым было повышение чувствительности к таким физиологическим индукторам агрегации, как АДФ, арахидоновая кислота, и ристоцетин. Таким образом, в III группе детей степень агрегации практически со всеми исследуемыми индукторами была выше и значимо отличалась от аналогичных показателей во II группе.
Пациенты III группы имели статистически незначимую тенденцию к более высокой скорости агрегации с коллагеном, арахидоновой кислотой и ристоцетином, чем у здоровых (р=0,48, р=0,11 и р=0,44 соответственно), и также незначимую тенденцию к большей скорости агрегации с АДФ, арахидоновой кислотой и ристоцетином, чем в группе обследованных II группы (р=0,05, р=0,51 и р=0,66 соответственно). У пациентов II группы отмечалось статистически значимое снижение скорости агрегации с АДФ по сравнению с контролем (р=0,04).
При этом, в III группе исследования увеличение степени агрегации с АДФ ( 80,0%) (95% ДИ: 77,12-80,0) отмечено у 28 (26,7%), адреналином ( 80,0%) (95% ДИ: 76,01 до 80,02) – у 57 (54,3%), коллагеном ( 90,0%) (95% ДИ: 79,83 до 84,79) – у 13 (12,4%), арахидоновой кислотой ( 80,0%) (95% ДИ: 71,03 до 80,03) – у 65 (61,9%) и ристоцетином ( 90,0%) (95% ДИ: 74,37 до 82,87) – у 35 (33,3%) пациентов (р=0,00001 в сравнении с I и II группой).
Кроме этого, в III группе исследования было зафиксировано увеличение скорости агрегации с АДФ ( 70,0%) (95% ДИ: 62,24 до 66,17) у 7 (6,7%), адреналином ( 50,0%) (95% ДИ: 36,01 до 41,96) – у 7 (6,7%), коллагеном ( 80,0%) (95% ДИ: 63,51 до 69,73) – у 1 (1,0%), арахидоновой кислотой ( 70,0%) (95% ДИ: 64,23 до 70,0) –у 12 (11,4%) и ристоцетином ( 70,0%) (95% ДИ: 46,20 до 54,42) – у 12 (11,4%) пациентов (р=0,00001 в сравнении с I и II группой).
У 1 (1,0%) ребенка из II группы отмечалось снижение степени агрегации с АДФ (р=0,00001 при сравнении с I и III группой). У детей I группы изменений показателей агрегации выявлено не было.
Таким образом, статистически значимое увеличение степени индуцированной агрегации с АДФ, адреналином, коллагеном, арахидоновой кислотой и ристоцетином у большинства детей с ЭАГ и ПРРТ свидетельствует о гиперагрегации тромбоцитов. Данные нарушения, вероятно, связаны с более длительным течением ЭАГ у детей III группы, которое было установлено нами ранее, и, следовательно, более длительной гемодинамической травмой эндотелия сосудов, что закономерно сопровождается сменой их антитромботического потенциала на тромбогенный. Обращает на себя внимание то, что одним из наиболее значимых было повышение чувствительности к такому физиологическому индуктору агрегации, как ристоцетин, что является признаком повышения в плазме крови фактора Виллебранда (ФВ) и ДЭ. Подобные данные приводят другие исследователи. Так, по данным W.B. Kennel (1987) при АГ выявлено повышение спонтанной агрегации тромбоцитов. В ряде исследований было показано, что тромбоциты при ГБ имеют повышенную чувствительность к АДФ и арахидоновой кислоте [Lechi C., 1989]. M.E.C. Dockrell (1999) установил, что у молодых людей повышение АД положительно коррелирует с адреналин-агрегацией. Л.Н.
Мингазетдинова и коллеги (2004) сообщают о повышеннойристомицининдуцированной агрегации у взрослых больных АГ. В ранней работе Ж.В. Нефедовой (2007) и в более позднем исследовании Ж.В. Нефедовой, В.Г. Стурова, М.К. Соболевой (2011) показано, что у детей и подростков независимо от генеза АГ наблюдается внутрисосудистая активация кровяных пластинок в ответ на АДФ, адреналин, коллаген. A.B. Чупрова и соавт. (2007) наблюдали активацию агрегации тромбоцитов при различных формах АГ у детей.
Активация тромбоцитов может быть вызвана повреждением эндотелиальной выстилки сосудов и экранированием коллагена, повышением в плазме крови ФВ, др. [Момот А.П., 2011]. При повреждении эндотелия обнажается субэндотелий, который увеличивает связывание с ФВ. Это приводит к связыванию ФВ с рецептором GPIb/IX тромбоцитов и адгезии последних. Тромбоциты же могут связываться непосредственно с коллагеном с помощью своих рецепторов. Все это способствует тому, что изменяются свойства GPIIb/IIIа мембраны тромбоцитов, которые увеличивают связывание с ФВ и фибриногеном, возникает агрегация тромбоцитов [Алексеев Н.А., 2009; Момот А.П., 2011].
Тромбоциты одни из первых взаимодействуют с поврежденным эндотелием. При ДЭ наблюдается дисбаланс между факторами, обеспечивающими местные процессы гемостаза, пролиферации, миграции клеток крови в сосудистую стенку и сосудистый тонус. Как упоминалось выше известно, что одним из основных маркеров ДЭ является ФВ [Момот А.П., 2006; Петрищев Н.Н., 2007; Kolde H.J., 2001]. По данным А.П. Момот (2006) для пациентов с высоким риском возникновения артериального тромбоза (ГБ, др.) помимо наличия активации сосудисто-тромбоцитарного гемостаза следует определять прямые свидетели ДЭ, в том числе ФВ. Нами были исследованы ристоцетин-кофакторная активность ФВ и содержание антигена ФВ в плазме детей с ЭАГ и ПРРТ. Ill Сравнительный анализ средних значений показателей ФВ у детей с ЭАГ и здоровых позволил установить статистически значимые различия (табл. 5.2). При проведении попарного сравнительного анализа было определено, что в группе детей с ЭАГ и ПРРТ показатели активности и содержания ФВ были статистически значимо выше аналогичных показателей в контрольной группе (р=0,007 и р=0,00001 соответственно) и в группе детей с ЭАГ без ПРРТ (р=0,00009 и р=0,00001 соответственно).
Частотные характеристики полиморфизма R353Q гена-кандидата FVII и анализ ассоциации FVII с параметрами гемостаза
Ген FVII, играющий ключевую роль во внешнем пути коагуляционного гемостаза, расположен на длинном плече 13-й хромосомы (13q34). Как правило, разнообразие в уровнях FVII обусловлены двумя распространенными разновидностями вариантов гена FVII: R353Q и 5 F7 [Кисляк О.А., 2007]. Фактором ПРРТ является носительство дикого аллеля R полиморфизма R353Q гена FVII. В свою очередь минорная мутация (аллель Q), оказывает атромботическое действие, связанное с уменьшением содержания и активности FVII в крови [Mo X et al., 2011]. 138 В нашем исследовании значимых различий в распределении генотипов и аллелей полиморфизма R353Q гена FVII не выявлено. Генотип R/R в I А, II А и III А группах был выявлен у 30 (75,0%), 48 (80,0%) и 51(89,5%) подростка (2=1,88, р=0,39), генотип R/Q – у 8 (20,0%), 11 (18,3%) и 6 (10,5%) детей соответственно (2=0,68, р=0,71). Гомозиготный генотип Q/Q выявлен у 2 (5,0%) детей из I А группы и у 1 (1,7%) – из II А группы (р=0,35). Частота дикого аллеля R, наиболее распространенного в популяции и увеличивающего ПРРТ за счет повышенного синтеза Ф7, в III А группе была незначимо выше (94,7%), чем в I А и II А группах (85,0% и 89,2% соответственно) (2=1,62, р=0,44). Частота встречаемости аллеля Q, оказывающего протективный эффект в отношении развития ПРРТ [Ogawa M. et al., 2004] составила 15,0%, 10,8% и 5,3% соответственно (2=1,62, р=0,44).
Распределение генотипов и частот аллелей гена FVII во всех группах соответствовало ожидаемому согласно равновесию Харди-Вайнберга в популяционной выборке (табл. 6.3).
Таким образом, при попарном сравнении частот генотипов и аллелей полиморфизма R353Q гена FVII у детей группы контроля и у детей с ЭАГ статистически значимых различий не выявлено.
Далее нами проведен анализ различий активности изучаемых показателей гемостаза у детей – носителей разных генотипов полиморфизма R353Q гена FVII группы контроля и у пациентов с ЭАГ. В связи с отсутствием статически значимых различий частотных характеристик, дети с ЭАГ без ПРРТ и с ПРРТ объединены нами в одну группу. Выявлены статически значимые различия фактора свертывания ФVII (рис. 6.1).
Активность фактора свертывания крови ФVII у детей с ЭАГ, являющихся носителями разных генотипов полиморфизма R353Q гена FVII
Если в группе контроля нами не выявлено различий активности фактора свертывания крови ФVII у детей-носителей разных генотипов, то среди пациентов носители дикого R-аллеля имели достоверно выше активность фактора свертывания ФVII, чем носители Q-аллеля (р=0,02). С помощью GLM-анализа подтверждена взаимосвязь изучаемых параметров:
Активность фактора свертывания VII=83,375+B2,
при этом В2=14,288, если FVII (R353Q) = RR, при других вариантах генотипов (RQ, QQ) В2 = 0. Статистическая значимость модели F=11,424, p 0,001. Общий вклад всех переменных на независимую = 10,8%.
Более того, выявлены различия содержания фактора свертывания ФII у пациентов – носителей разных генотипов, при этом у носителей гомозиготного генотипа RR активность данного показателя была достоверно выше, чем у носителей гетерозиготного генотипа RQ (рис. 6.2).
Активность фактора свертывания крови ФII у детей с ЭАГ, являющихся носителями разных генотипов полиморфизма R353Q гена FVII
Следовательно, аллель R следует считать рисковым в отношении ранней реализации тромбогенного риска у лиц молодого возраста.
Распределение частот генотипов и аллелей гена-кандидата PAI-1 и анализ его ассоциации с параметрами гемостаза
В организме существует мощная система ингибиторов фибринолиза. Присутствующие в плазме и сыворотке крови ингибиторы фибринолиза можно разделить на антиплазмины и ингибиторы активаторов плазминогена (действующие против стрептокиназы, урокиназы и тканевого активатора плазминогена). PAI-1 является основным ингибитором тканевого активатора плазминогена и урокиназы. Продуцируется эндотелиальными клетками, клетками гладких мышц, мегакариоцитами и мезотелиальными клетками; депонируется в тромбоцитах в неактивной форме. Его продукция (и последующее ингибирование лизиса сгустка) стимулируется тромбином, трансформирующим фактором роста бета, тромбоцитарным фактором роста, интерлейкином-1, ФНО-альфа, инсулиноподобным фактором роста, глюкокортикоидами и эндотоксином. Активированный ПC ингибирует выделенный из эндотелиальных клеток PAI-1 и тем самым стимулирует лизис сгустка. Основная функция PAI-1 – ограничить фибринолитическую активность местом расположения гемостатической пробки за счет ингибирования тканевого активатора плазминогена. Таким образом, на месте повреждения активированные тромбоциты выделяют избыточное количество PAI-1, предотвращая преждевременный лизис фибрина. Повышение уровня PAI-1 связано с увеличением риска тромбозов [Гончар А.Л., Моссэ И.Б., Иванов А.А. и др., 2009]. Синтез и деградация PAI-1 генетически детерминированы.
В настоящее время широко изучается роль полиморфизма -675 4G/5G гена PAI-1 в снижении фибринолитической активности крови. Сущность полиморфизма 4G/5G заключается в следующем: в промоторной 675 области гена PAI-1 есть участок, который может содержать последовательность либо из 4-х оснований гуанина (4G), либо из 5 оснований гуанина (5G). У носителей аллеля 4G концентрация PAI-1 выше, чем у носителей аллеля 5G, что приводит к повышенному риску тромбообразования.
Нами изучены частотные характеристики полиморфизма -675 4G/5G гена PAI-1 (табл. 6.4). Нами показано, что делетированный 4G-аллель изученного полиморфизма чаще встречался в III А группе (11 (19,3%) и 26 (45,6%) детей соответственно), а гомозиготный генотип 5G/5G у них встречался меньше в сравнении с другими группами (20 (35,1%) детей), однако данные различия не достигали статической значимости. У детей II А группы генотип 4G/4G выявлен в 10 (16,7%) случаях, 5G/4G – в 23 (38,3%), 5G/5G – в 27 (45,0%) случаях. У здоровых детей у 20 (50,0%) установлен нормальный генотип 5G/5G, а измененные генотипы 5G/4G и 4G/4G - у 16 (40,0%) и 4 (10,0%) детей соответственно. Значимых различий в распределении генотипов 5G/5G, 5G/4G и 4G/4G между группами исследования не выявлено (2=2,35, р=0,31, 2=0,68, р=0,71 и 2=1,56, р=0,50 соответственно). Частота встречаемости аллелей 5G и 4G составила 70,0% и 30,0% у здоровых детей, 64,2% и 35,8% - у детей с ЭАГ без ПРРТ, 57,9% и 42,1% - у детей с ЭАГ с ПРРТ соответственно (2=1,23, р=0,54).
