Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Молекулярно-генетические особенности в медуллокластомах у различных возрастных групп (обзор литературы) 11
1.1. История развития представлений о медуллобластомах 11
1.2. Патогенетические теории развития медуллобластом 13
1.2.1. Сигнальные пути, регулирующие развития мозжечка и медуллобластом 14
1.2.2. Моделирование медуллобластомьт у животных 20
1.2.3. Стволовые клетки в развитии медуллобластом 21
1.3. Клинико-диагностические особенности медуллобластом 23
1.3.1. Этиология медуллобластом 23
1.3.2. Частота встречаемости медуллобластом 24
1.3.3. Клинические аспекты медуллобластом 24
1.3.4. Диагностика медуллобластом 25
1.3.5. Структура заболеваемости медуллобластомами 26
1.3.6. Локализация медуллобластом 27
1.4. Лечение медуллобластом 27
1.4.1. Паллиативное лечение медуллобластом -..29
1.4.2. Осложнения лечения медуллобластом 30
1.4.3. Контроль заболевания 31
1.5. Патоморфология медуллобластом 32
1.6. Генетические аберрации в медуллобластомах 35
1.6.1. Изохромосома 36
1.6.2. Амплификация генов 39
1.6.3. Хромосома 6 40
1.6.4. Маркеры благоприятного прогноза 40
1.6.5. Апоптоз 40
1.6.6. Маркеры неблагоприятного прогноза 42
1.7. Прогрессия медуллобластом 44
1.8. Клинико-морфологические различия между взрослыми и детскими медуллобластом 45
Глава 2. Материал и методы исследования 48
2.1. Общая характеристика клинического материала 48
2.1.1. Формирование групп для исследования 49
2.1.2. Катам нести ческие данные 53
2.2. Методы исследования 53
2.2.1. Патоморфологическое исследование 53
2.2.2. Иммуногистохимическое исследование 54
2.2.3. Тканевые микроарреи 55
2.2.4. Флуоресцентная гибридизация in situ 56
2.2.5. Сравнительная геномная гибридизация 58
2.2.6. Экспрессиоиный профайлинг 6!
2.3. Статистический анализ данных 62
Глава 3. Результаты 65
3.1. Сравнительная геномная гибридизация 66
3.1.1. Цитогенетические хромосомные аберрации во взрослой скрининговой подгруппе 67
3.1.2. Цитогенетические хромосомные аберрации в детской скрининговой подгруппе 67
3.2. Флуоресцентная гибридизация in situ 70
3.3. Экспрессиоиный профайлинг генов 73
3.4. Статистический анализ выживаемости 79
3.5. Сравнительно-сопоставительный анализ медуллобластом у взрослых и детей 84
Глава 4. Обсуждение 88
Заключение 95
Выводы 103
- Сигнальные пути, регулирующие развития мозжечка и медуллобластом
- Клинико-морфологические различия между взрослыми и детскими медуллобластом
- Цитогенетические хромосомные аберрации в детской скрининговой подгруппе
- Сравнительно-сопоставительный анализ медуллобластом у взрослых и детей
Введение к работе
Актуальность исследования
Медуллобластома (МБ) - наиболее часто встречающаяся в нейрохирургической практике высоко злокачественная опухоль головного мозга у детей, в то время как у взрослых медуллобластомы возникают относительно редко и составляют не более 4% от всех первичных опухолей головного мозга [15], [33], [164].
Медуллобластомы у детей являются относительно хорошо изученной опухолью центральной нервной системы (ЦНС), благодаря чему стало возможным разделение медуллобластом на группы риска на основании клинических и молекулярных данных [124], [172], [179]. Эти результаты исследований повлекли за собой более дифференцированный подход к лечению медуллобластом, позволяя избежать таких отдаленных осложнений, как нарушения интеллектуального развития и формирования скелета, а также эндокринных расстройств.
Имеющиеся в литературе данные, касающиеся медуллобластом у взрослых, представляют собой ретроспекгивные исследования большого количества опухолей, собранных за длительный период времени и трудно поддающихся анализу из-за разницы в терапевтических подходах [88], [129], [164], [194] либо представлены небольшими сериями больных, предлагающими в качестве прогностических маркеров клинические, гистологические и имму но гистохимические параметры [17], [33], [46], [90], [143], [206]. Сообщения о молекулярно-генетических нарушениях ограничены описанием единичных больных [102]. Редкость медуллобластом у взрослых и недостаток данных о биологии этих опухолей, затрудняют выбор терапевтической стратегии, фактически используются «детские» протоколы лечения
7 медуллобластом, обладающие значительной токсичностью для взрослых пациентов. Изучение генетических аберраций в медуллобластомах у взрослых, сравнение их с молекулярно-гепетическим профилем детских медуллобластом, понимание путей патогенеза позволит выявить новые прогностические маркеры и оптимизировать лечение нейрохирургических больных с медуллобластомами.
Цель исследования
Выявить генетические аберрации в медуллобластомах у взрослых, сравнить нарушения в геноме медуллобластом, возникающие у взрослых и детей, выявить зависящую от возраста разницу в биологии этих опухолей и предложить основанную на молекулярных маркерах схему прогноза.
Задачи исследования
Подробно описать генетические особенности в медуллобластомах у взрослых нейрохирургических больных, выявленные при исследовании на уровне тотального генома с помощью методов сравнительной геномной гибридизации (array-based Comparative Genomic Hybridization array-CGH) и экспрессионного профайлинга (Gene expression profiling).
Определить прогностическое значение различных генетических аберраций при медуллобластомах у взрослых, исследовав их связь с ' общей и безрецидивной выживаемостью. 1 ч^
Сравнить частоту и прогностическое значение различных генетических аберраций в медуллобластомах у взрослых и детей.
Внедрить алгоритм определения прогностически важных генетических аберраций в условиях патологоанатомического отделения методом флуоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence in situ hybridization) и
определение молекулярного варианта медуллобластом методом иммуногистохимического исследования.
Научная новизна
В работе впервые подробно изучены нарушения в опухолевом геноме взрослых нейрохирургических больных с медуллобластомами. Благодаря использованию сравнительной геномной гибридизации array-CGH с высокой разрешающей способностью выявлены тонкие нарушения в геноме, определены критические участки поражения на уровне отдельных генов, вовлеченных в процесс развития медуллобластом у взрослых. Изучение экспрессии различных генов методом экспрессной ного профаилинга позволило установить вовлеченные в патогенез медуллобластом у взрослых гены следующих сигнальных путей: Sonic Hedgehog, Wnt/Wingless и гены, контролирующие синаптогенез, нейрональную дифференцировку и рецепторы глютамата. Сравнение генетических нарушений в медуллобластом ах взрослых и: детей выявило- зависящие от возраста прогностические маркеры: амплификация CDK.6, добавка 17q. и потеря 10q имеют неблагоприятное прогностическое значение у взрослых больных с медуллобластомами; амплификация MYC является маркером плохого прогноза у детей. Предложена молекулярно-генетическая стратификация и внедрено определение этих маркеров иммуногистохимическим методом и флуоресцентной гибридизацией in.situ (FISH) в:" практику патологоанатомического отделения Научно-исследовательского института имени академика НЛ. Бурденко РАМН, что будет способствовать оптимизации лечения этих опухолей и позволит уменьшить токсичность лучевой терапии и химиотерапии.
Практическая значимость
Результаты работы выявили прогностически значимые генетические маркеры у больных старше 18 лет с медуллобластомами. Определение групповой принадлежности опухоли иммуногистохимическим методом и выявление прогностически значимых генетических аберраций в медуллобластомах флуоресцентной гибридизацией in situ внедрено в практику патологоанатом и ческого отделения Научно-исследовательского института нейрохирургии имени академика Н.Н. Ьурденко РАМН.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Медуллобластомы у взрослых пациентов представляют собой гетерогенную . группу опухолей, отличающихся от детских меяуллобластом.
2. Экспрессионный ирофайлинг позволил выделить три молекулярных варианта медуллобластомы у взрослых; медуллобластомы с активацией генов Sonic Hedgehog сигнального пути (группа SI IH) медуллобластомы с активацией генов Wnl/Wingless сигнального пути (группа Wnt) медуллобластомы с активацией генов, контролирующих синаптогенез, нейроналт.ную дифференцировку и рецепторыглютамата(группаD)
3. В геноме взрослых медуллобластом присутствует цитогенстическая аберрация - амплификация онкогена CDK6, почти не встречающаяся в геноме детских медуллобластом.
4. Маркерами неблагоприятного прогноза у взрослых медуллобластом являются следующие принадлежащие к группе D цитогенетическис аберрации: амплификация С1Ж6, количественные изменения на хромосоме 17 и деления хромосомы 1 Oq.
5. Делеция хромосомы 6q не имеет у взрослых такого благоприятного прогностического значения как у детей.
Апробация работы
Официальная апробация состоялась 23 сентября 2011 г. на расширенном совместном заседании проблемных комиссий «Биология и комплексное лечение внутримозговых опухолей» и «Детская нейрохирургия» в Научно-исследовательском институте нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко РАМН.
Результаты работы были обсуждены 24 августа 2011 на семинаре отделения молекулярной генетики German Cancer Research Center in the Helrnholtz Association, Heidelberg, Germany.
Публикации
По теме рабогы опубликовано 20 печатных работ, из них 8 в виде статей в журналах, рецензируемых ВЛК и 12 в виде тезисов на профильных конференциях и конгрессах.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложения. Текст изложен на 145 страницах, содержит 23 рисунка и 10 таблиц. Указатель литературы содержит ссылки на 7 отечественных и 237 зарубежных источников.
Сигнальные пути, регулирующие развития мозжечка и медуллобластом
Работы в области молекулярной генетики медуллобластом позволяют выделять и культивировать клеточные линии, изучать на экспериментальных опухолевых моделях у мышей механизмы патогенеза, опухолевой прогрессии и устойчивости к терапевтическим агентам, тестировать новые лекарственные препараты для таргетной терапии [44], [112], [180], [185], [229], [230], [240]. На животных моделях был детально изучен путь Sonic hedgehog (SHH) и установлена причинно-следсгвенная связь между инактивацией гена РТС1 и развитием развитием медуллобластомы у мышей. Ген РТС1 является рецептором для SHH и подавляет SHH-зависимые митогенные сигналы для роста клеток-предшествениц в зернистом слое мозжечка. РТС1 изначально экспрсссируется в нейрональных клетках внутреннего зернистого слоя в мозге новорожденных и в наружном зернистом слое у взрослых. Мутации гена РТС1 приводят к ослаблению его подавляющего действия на SHH и приводят к неконтролируемой пролиферации клеток-предшественниц и их трансформации. Таким образом, SHH/PTC1 сигнальный путь играет важную роль и в процессе нормального развития мозжечка и в генезе медуллобластомы. Инактивация і-ена РТС1 у гомозиготных мышей является причиной смерти в процессе эмбриогенеза из-за незаращения нейральной трубки [227], но только у 14% мышей с гетерозиготной потерей РТСН развивается медуллобластома, показывая, что так называемый «второй удар» в геноме необходим для развития опухоли [84]. Но медуллобластомы у мышей могут развиваться и при отсутствии мутации гена РТС, как и при отсутствии мутации другого гена-мишени для SHH GLI1, т.е. существуют добавочные механизмы для активации SHH сигнального пути. Также в генезе медуллобластом на животных моделях может иметь значение и хроническое повреждение ДНК при отсутствии репарации ДНК, связанной с повреждением фермента ДНК лигазы IV [131]. Но, к сожалению, результаты, полученные при изучении экспериментальных опухолевых моделей у животных не всегда уместны для человеческой меду лл об ластом ы [236].
На смоделированной у мышей медуллобластоме с активацией SHH сигнального пути через активацию Smoothened (ND2:SmoAl мыши) было выявлено, что активации SHH сигнального пути вполне достаточно для активации Notch сигнального пути с его таргетными генами Notch2 и HES5, а эффекты воздействия ингибитора Notch сигнального пути у secretase на мышей с медуллобластомой с клеточной линией D283 заключались в понижении пролиферации и повышении апоптоза, а также в- истощении CD133-иммунопозитивпой клеточной фракции, другими словами, стволово-подобные клетки головного мозга могут быть чувствительны к ингибитору Notch сигнального пути у secretase [67], [96].
Термин "стволовая клетка" был предложен для описания клеток, обладающих способностью продуцировать большое количество дочерних клеток после некоторого воздействия, приводящего к гибели клеток в результате повреждений хромосом или апоптоза, т.е. стволовые клетки обладают способностью к самовозобновлению, способны к росту и формированию нейросфер в культуре, мул ьти потен тны т.е. могут дифференцироваться в нейрональные клетки и в клетки глии и, если речь идет о стволовых (или стволово-подобных) опухолевых клетках, то способны образовывать опухоли и отвечать на ингибиторы нейрональных стволовых клеток такие как bone morphogenetic proteins (BMPs) [ 175].
В головном мозге взрослого человека имеются скопления стволовых клеток в субвенгрикулярной зоне и в субзернистом слое зубчатой извилины в гиппокампа, у мышей также найдены и изолированы на основе положительной экспрессии маркера стволовых клеток CD133 стволовые клетки, локализующиеся в белом веществе мозжечка [179]. Стволовые клетки в ассоциации с поддерживающими клетками создают специальное микроокружение, так называемые "ниши", которые определяют поведение и свойства стволовых клеток. Ниши стволовых клеток различаются по клеточному составу, структуре и локализации в различных тканях. Например, во взрослом костном мозге гемопоэтические стволовые клетки локализуются в трабекулах (остеобластическая ниша), а в головном мозге - в сосудистой нише, іде эндотелиалыше клетки регулируют возобновление стволовых клеток [97].
Концепции стволовых опухолевых клеток уже около 50 лет, но доказательства ее существования представлепы не так давно. В 1989 году НІ11 и Milas предположили, что опухоли у мышей содержат стволовые опухолевые клетки и количество этих клеток влияет на прогноз заболевания. На сегодняшний день стволовые опухолевые клетки идентифицированы в лейкозах, опухолях молочных желез, поджелудочной железы, простаты, кишечника, головы и шеи и в опухолях мозга. Более недавние исследования показали, что CD133 (рготІпІп-l) экслрессируется стволовыми клетками и уровень его экспрессии у глиом прямо пропорционален степени злокачественности опухоли. Кроме CD133 стволовые опухолевые клетки экспрессирует nestin, который активирует Notch сигнальный путь.
Некоторые исследователи показали, что сигнальные каскадные пути Notch, SHH и Wnt, «овлечешгые в патогенез медуллобластом также активны и в нишах стволовых клеток [54], [66], [97], что может говорить о том, что, возможно, медуллобластомы возникают из стволовых клеток или клеток-предшествеиниц.
Также в пользу такого происхождения медуллобластом свидетельствует, что во-первых, клетки медуллобластом сходны со стволовыми клетками микроскопически и по профилю экспрессии протеинов и РНК; во-вторых, в некоторых экспериментальных опухолевых моделях у мышей медуллобластомы, вероятнее всего, образуются из наружного зернистого слоя мозжечка; в-третьих, мультипотентные клетки со свойствами стволовых опухолеподобных клеток могут быть выделены из медуллобластом и способны образовывать нейросферы в культуре; в четвертых, нейрональные клетки-предшественницы могут формировать медуллобластомо-подобиые повреждения, когда они трансформируются онкогенами и хотя ни один из этих фактов не доказывает происхождение медуллобластомы из стволовых клеток, эти факты показывают, что это вполне возможно [54].
Популяция стволовых опухолевых клеток с одной стороны делает опухолевые клетки более устойчивыми к лучевой и химиотерапии, а с другой стороны нейрональные стволовые клетки могут использоваться в качестве клеточной системы доставки лекарственных препаратов непосредственнно в опухолевую ткань благодаря специфическим хемоаттарактантам (лигалдам в медуллобластомах и рецепторам в нейроиальиых стволовых клетках) [119], [210]. Сами стволовые опухолевые клетки могут явиться мишенью для таргетной терапии: ингибитор SHH cyclopamine истощает пул стволовых опухолевых клеток, ингибитор Notch Y-secretase обладает способностью останавливать клеточный цикл, а микроокружение стволовых опухолевых клеток может стать еще одной мишенью для терапии [97].
Клинико-морфологические различия между взрослыми и детскими медуллобластом
Рецидивы медуллобластом у детей происходят спустя два года после удаления первичной опухоли, у взрослых в среднем через три года, прогноз после рецидива у взрослых очень неблагоприятный [8], [17], [31], [32], [39], [164], [178], [192].
По данным A. Brandcs [33] и A. Korhsunov [126] быстрее рецидивируют медуллобластомы со срединной локализацией и высокозлокачественными изменениями в генотипе, в то время как латерально расположенные опухоли склонны к более поздним рецидивам после появления в их генотипе таких аберраций как амплификация генов MYC, MYCN и/или изохромосома 17q.
При неопластической трансформации клетки приобретают повышенный двигательный потенциал и способность к миграции, что играет важную роль в процессах опухолевой инвазии и метастазирования. Клетки злокачественных опухолей могут формировать цитопл аз мати чески е отростки или псевдоподии, для функционирования которых требуется быстрое изменение актинового цитоскелета с образованием актиновых соединений и специальных связывающих актин протеинов, одним из которых является fascin, обладающий способностью формировать параллельные f-актиновые пучки. Экспрессию fascin связывают с плохим прогнозом из-за ею участия в процессах инвазии и метастазирования [160].
К метастазированию склонны медуллобластомы преимущественно срединной локализации [163], миграции клеток медуллобластомы способствует повышенная экспрессия генов ERBB2 (являющегося одновременно и маркером неблагоприятного прогноза [79], особенно для детей младше 3 лет [100]), PDGFR-a, PDGFR-p, также важную роль в метастазировании играет RAS/MAPK сигнальный путь, что может являться основой для таргетной терапии ингибиторами POGFRA и RAS протеинов [78], [85], L99], [142]. Экспрессируемыс опухолевыми клетками интегрины а9 и р! в комбинации с протеином экстрацеллюлярного матрикса тенасцином обеспечивают прикрепление клеток медуллобластомы к лептоменингеальной оболочке [70]. Медуллобластомы часто распространяются по спинномозговым путям, но метастазирование за пределы ЦНС происходит в редких случаях, большинство из которых составляют дистантные метастазы по вентрикулоперитонеальному шунту [58], [215].
Более высокая тенденция к метастазированию наблюдается у детей [32]. Метастазирование процесса по оболочкам головного и спинного мозга чаще происходит у детей, метастазы в большие полушария головного мозга происходят с одинаковой частотой у детей и взрослых, метастазирование процесса за пределы ЦНС чаще возникав!4 у взрослых [192]. За пределами ЦНС медуллобластомы и у детей и у взрослых чаше всего метастазируют в кости и лимфатические узлы [8], [17], [39], [143]; легочные метастазы чаще встречаются у взрослых, а метастазы в печень — у детей [32], [193]. Метастазирование чаще возникает у мужчин [58], [193] и, возможно, связано с повышением уровня экспрессии гена LASP1 (локус 17q) [228]. Появление в метастазах анашшии говорит о том, что некоторые медуллобластомы могут подвергагься профессии, накапливать добавочные генетические аберрации (амплификации генов МУС, MYCN и/или изохромосому 17q) и сохранять способность к метастазированию после долгот периода ремиссии [58], [126].
Клинико-морфологнчсские различия между взрослыми и детскими медуллобластомами Медуллобластомы у детей и взрослых - это две различных группы заболеваний с присущими каждой группе клиническими и морфологическими особенностями Частота встречаемости — медуллобластомы у детей составляют 20-25% от всех опухолей Щ 1С, у взрослых - 1-4% от всех опухолей ЦНС Заболеваемость у детей имеет бимодальный характер — с пиками в 3-4 года и в 8-9 лет, у взрослых - мономодальный характер с пиком в 27 лет Медуллобластом ы у взрослых представляют собой спорадические опухоли, детские медуллобластомы могут развиваться как спонтанно, так и при наследственных синдромах Интервал между появлением первых признаков заболевания и установлением диагноза больше у взрослых больных Различие по полу наблюдается только у детей младшей возрастной группы (среди заболевших преобладают девочки), у детей старше 3 лет и у взрослых среди заболевших преобладают лица мужского иола Локализация опухоли у детей опухоли чаще поражают червь, у взрослых - гемисферу мозжечка Лечение - для взрослой популяции больных с медуллобластомами не существует стандартных протоколов лечения, для лечения используются детские протоколы, которые обладают повышенной токсичностью для взрослых больных с медуллобластомами Осложнения лечения - для детей характерны эндокринные расстройства, нарушения интеллекгуального развития и формирования скелета, у взрослых преобладают инфекционные осложнения и гематологическая токсичность Рецидивировал не - для детей характерны ранние рецидивы, для взрослых - поздние, возникающие после 3 лет Метастазирование — детские медуллобластомы метастазируют чаще. За пределами ЦНС детские медуллобластомы метастазируют в печень, в то время как медуллобластомы у взрослых чаще метастазируют в легкие Гистологический вариант опухоли — у детей чаще возникает классическая медуллобластома, у взрослых - десмопластическая/нодулярная Анапластический вариант медуллобластомы почти не встречается у взрослых и не имеет столь неблагоприятной прогностической значимости как у детей Медуллобластомы с повышенной нодулярностью возникают только у детей младше 3 лет Для детских медуллобдастом характерны более высокие параметры роста (пролиферативный потенциал и митотический индекс) и более низкий апоптотический индекс по сравнению со взрослыми Генетические аберрации подробно изучены только в детских медуллобластомах, на сегодняшний момент почти нет данных, касающихся генетики взрослых медуллобластом, что и послужило основной целью данной работы - изучить генетические аберрации во взрослых медуллобластомах и сравнить их с детскими опухолями.
Цитогенетические хромосомные аберрации в детской скрининговой подгруппе
Для кластерного анализа и анализа генной экспрссии данные были нормализированы с использованием the gcRMA algorithm в пакете данных the R/lMoconductor version 2.12/ 2.7 fhttp://www. bioconductor.org.)
В результате был анализирован экспрессионный уровень 18.400 транскриптомов и вариантов. Логарифмически нормализованные данные доступны в the National Center for Biotechnology Information Gene Expression Om nibus (http://www.ncbi .n 1 m.ni h .gov/ge o/)
Общая выживаемость была подсчитана от даты установления диагноза до смерти от прогрессии основного заболевания (пациенты, погибшие по другим причинам не включались в исследование) или до даты сбора последних катамнести чески х данных (1 июня 2011).
Безрецидивная выживаемость была определена как промежуток времени от даты установления диагноза до даты прогрессии заболевания или до даты смерти от прогрессии заболевания или до даты сбора последних катамнестических данных (1 июня 2011).
Для выявления генетических аберраций, позволяющих различить медуллобластомы у детей и взрослых, было проведено совместное исследование: a bootstrap resampling — множественная замена числовых показателей в разных вариациях и селекция клонов, позволяющая выявить оптимально-минимальное количество клонов для классификации. Все аутосомальные клоны от 34 образцов взрослых медуллобластом были подвергнуты процессу, который включал элиминацию клонов с заведомо известным количественным полиморфизмом согласно Database of Genomic Variants (http://proiects.tcaK.ca/variation/ргоіect.html). с неполным картированием и потерей около 20% образца.
В результате для дальнейшего анализа было отобрано 5,556 клонов. Остальные недостающие значения были анализированы с использованием системы the LOWESS scatterplot smoother [40], [41]. Для определения логарифмических соотношений была применена скрытая модель Markov. Далее были определены геномные события. Среднее от всех абсолютных отклонений, затрагивающих все хромосомы, было взято в качестве эталона экспериментальной вариабельности (геномическое «стандартное отклонение»). Добавки и потери были определены как логарифмическое соотношение (Iog2) большее (добавки) или меньшее (потери) в три раза чем стандартное отклонение. Клоны, различающиеся между детскими и взрослыми медуллобластомами были отобраны с использоваиием shrunken centroids of gene expression - метода суживающихся центроидов, предложенного Robert Tibshirani [224] и основанного на определении ближайшего прототипа (центроида).
На начальном этапе метод применялся для каждого образца, чтобы идентифицировать подходящие клоны, оцениваясь на специальной компьютерной шкале. Каждый клон маркировался как отобранный или не отобранный, Частота встречаемости того или иного клона была использована в качестве критерия для отбора клона для дальнейшего исследования. Порог встречаемости 50 был выбран в качестве критерия для определения наиболее соответствующих клонов.
Средняя продолжительность катамнсстических данных, была подсчитана по Кот [125]. Оценка выживаемости была проведена с использованием метода Kaplan-Meier. Для сравнения двух и более кривых был использован логарифмический тест. Сравнение бинарных и категоричных характеристик пациентов между возрастными группами было проведемо с использованием точного теста Fisher. Логарифмические тесты были использованы для выявления связи единичных маркеров с риском смерти от заболевания и прогрессией заболевания. Скрининговые подгруппы взрослых и детей были использованы для идентификации возможных прогностически значимых молекулярных аберраций. Первым этапом при помощи логарифмических тестов было исследовано влияние амплификации онкогенов (MYC/MYCN/CDK.6) и частых хромосомных аберраций (поражающих более 10% пациентов) на общую выживаемость. Аберрации со статистически значимыми результатами впоследствии были анализированы на валидационных (исследуемых) группах взрослых и детей. Валидационный анализ выполнялся с использованием логарифмических тестов, также для оценки совместного влияния этих маркеров и прогностически значимых клинических и гистологических факторов была использована мультивариаытыая регрессивная модель Сох. Для определения роли этих маркеров совместно с клиническими и гистологическими факторами был использован частичный вероятностный тест [92]. Результаты теста считались статистически значимыми, если р был 0.05. Прогностическая значимость клинических и молекулярных факторов оценивалась по степени риска 95%. Корреляция между ядерным накопление f$-catenin и потерей хромосомы 6q оценивалась с помощью коэффициента корреляции Yule. Гистологический диагноз «медуллобластома» был поставлен согласно критериям, описанным в классификации опухолей центральной нервной системы ВОЗ издания 2007 г. [120]. Для верификации диагноза медуллобластома было проведено иммуногистохимическое исследование с антителами к синаптофизину, нейрон специфической енолазе, глиофибриллярному кислому белку; для исключения атипической тератоидно-рабдоидной опухоли 4 -BAF47); для исключения метастатического характера опухолйч с цитокератину 7 и цитокератину 20; для исключения лимфомы к общему лейкоцитарному антигену, маркеру лимфомных клеток и предшественниц В-клеток CD10 и маркеру В-клеток CD20. Все медуллобластомы показывали неЙрональную дифференцировку (положительная экспрессия синаптофизина и нейрон специфической енолазы), в 14 случаях в исследуемой группе в опухоли определялась очаговая экспрессия GFAP, во всех случаях была выявлена тотальная ядерная экспрессия BAF47» что говорило об отсутствии делеции гена INI1; экспрессии эпителиальных и лейкоцитарных маркеров выявлено не было.
Сравнительно-сопоставительный анализ медуллобластом у взрослых и детей
Медуллобластомы у взрослых являются достаточно редкой патологией и на настоящий момент для них не существует протоколов лечения. Для лечения этих опухолей используются детские протоколы, показывающие у взрослых больных повышенную токсичность. . Исследования последних лет [32], [194], [206] демонстрируют, что взрослые и детские медуллобластомы представляют собой две отдельные группы гетерогенных опухолей с характерными особенностями биологии, но со сходными клиническими проявлениями. Исследования в области экспрессионного профайлинга генов, вовлеченных в патогенез медуллобластом позволили выявить генетическую гетерогенность этих опухолей, разделить медуллобластомы на группы согласно экспрессии генов, контролирующих клеточную пролиферацию, дифференцировку, детерминированную гибель [124], [159], [222] и показать, что в патогенезе большинства взрослых медуллобластом преобладают гены SHH группы [15], [158]. Одним из разделов этой работы являлось изучение генов, вовлеченных в патогенез взрослых медуллобластом с помощью метода экспрессионного профайлинга на скрннииговой подгруппе, состоящей из 28 пациентов. Оказалось, что самой многочисленной (50%) является группа SHH, далее следовала группа D (29%) и группа Wnt (21%). Следующим этапом результаты, полученные при анализе данных экспрессионного профайлинга, были проверены предложенным P. Northcolt et al. [158] иммуногистохимическим методом «четырех антител» на 103 взрослых пациентах. При этом было получено сходное распределение по группам - 60%, 25% и 15% соответственно группам SHH, D и Wnt. И экспресснойный профайлинг и иммуногистохимическое исследование не выявили наличия у взрослых больных с медуллобластомами группы С, с ее отличительной особенностью - амплификацией гена MYC. Активация генов SHH сигнального пути - важное событие в патогенезе большинства взрослых медуллобластом, взрослые и детские медуллобластомы SHH группы показывают похожие результаты выживаемости при существующей терапевтической стратегии. Недавно Paul A. Northcott et al. [158] сообщили о клинических и молекулярных различиях SHH группы у детей и взрослых - демонстрируя сходные генетические аберрации (делению хромосом 10q и 17р„ добавки хромосом 2 и 17q и амплификацию GLI2) взрослые больные имеют худший прогноз, а у детей чаще встречаются амплификация MYCN и потеря хромосомы 10q. Активация генов SHH сигнального пути позволяет использовать у этих больных таргетную терапию, которая демострирует эффективность препарата ингибитора SHH GDC-0449 у некоторых пациентов с упорно рецидивирующими медуллобластомами [200], a Beauchamp et al. сообщают о замедлении роста опухолевых клеток in vivo и in vitro под действием arsenic trioxide АТО, блокирующего Hedgehog/GLI путь на экспериментальных моделях [23]. Возможное добавление ингибиторов SHH сигнального пути в качестве адъювантного лечения позволит комбинировать их со снижением дозы облучения и химиотерапевтических препаратов и тем самым уменьшить токсичность существующих протоколов. Иммуногистохимическое исследование опухоли с антителом SFRP1 представляется доступным и надежным средством для отбора пациентов для адъювантной терапии ингибиторами SHH. Не менее важным представляется и активация Wnt сигнального пути, происходящая у 15-20% взрослых медуллобластом. Взрослые медуллобластомы группы Wnt рейсе показывают делецию хромосомы 6q и еще реже мутации CTNNB1 по сравнению с детскими медуллобластомами с активацией Wnt сигнального пути, основной особенностью которых является моносомия хромосомы 6. Главными отличиями взрослых медуллобластом группы Wnt, являются сочетание дслеции хромосомы 6q с другими аберрациями, в частности, с добавкой хромосомы 17q и отсутствие благоприятного прогностического значения делеции хромосомы 6q. Вероятно, группа Wnt у взрослых имеет альтернативные механизмы активации Wnt сигнального пути, потому что делеция хромосомы 6q, которая как и у детей сочетается с ядерным накоплением p-catenin, не всегда сопровождается CTNNB1 мутациями, что объясняет различия в выживаемости взрослых и детей при едином терапевтическом подходе. На экспериментальных моделях у APCMin/+ показало, что нестероидные противовоспалительные средства НСПВС, через простагландины регулируя Wnt сигнальный путь, могут индуцировать апоптоз и эффективно удалять клетки с аберрантной активацией Wnt [114], [183], что открывает новые перспективы для таргетной терапии медуллобластом группы Wnl.
Наиболее неблагоприятной в прогностическом плане является группа D, выживаемость у взрослых в этой группе значительно хуже по сравнению с детьми из той же группы и взрослыми из групп SKH и Wnt. Основными цитогенетическими аберрациями группы D у взрослых являются амплификация CDK6, количественные изменения на хромосоме 17 и делеция хромосомы 10q.
Амплификации онкогенов имеют неблагоприятную прогностическую значимость и у детей и у взрослых с медуллобластомами, отличие между детьми и взрослыми в том, что в разных возрастных группах происходит амплификация разных онкогенов: для детей характерны амплификация генов MYC или MYCN, амплификация гена CDK6 встречается во взрослых медуллобластом ах.
