Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 8
1.1. Перемещающиеся элементы генома 8
1.1.2. Ретроэлемепты 9
1.1.1.1. LTR-Ретротранепозоны 10
1.1.2. Ретровирусы 12
1.1.3. Эндогенные ретровирусы 12
1.1.3.1. Строение эндогенных ретровирусов человека 13
1.1.3.2. Происхождение эндогенных ретровирусов 15
1.1.3.3. Классификация эндогенных ретровирусов 17
1.1.3.4. Представленность и распределение ERV в геноме человека 19
1.1.3.5. Участие HERV в нормальных и патофизиологических процессах, протекающих в клетке 22
1.3.1.1. Участие ERV в эмбриогенезе и развитии плаценты 24
1.1.3.1. Различия в структуре LTR, влияющие на их транскрипционную активность... 26
1.1.3.2. Эндогенные и экзогенные факторы, влияющие на экспрессию HERV 30
1.1.3.3. Влияние эндогенных ретровирусов и одиночных LTR на функционирование генома человека 33
1.1.4. Ретровирусные регуляторы экспрессии генов в геноме человека, как возможные факторы его эволюции 41
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 45
2.1. Материалы 45
2.1.1. Оборудование 45
2.1.2. Расходные материалы 46
2.1.3. Реактивы и ферменты 46
2.1.4. Буферные и концентрированные растворы 47
2.1.5. Препараты геномной ДНК. 48
2.1.6. Ткани. 49
2.1.6. Штаммы, культуры, плазмиды 51
2.1.1. Праймеры, последовательность нуклеотидов 52
2.2. Методы 53
2.2.1. Выделение РІЖ. 53
2.2.1.1. Подготовка тканей 53
2.2.1.2. Подготовка клеток 53
2.2.1.3. Выделение РНК 54
2.2.1.4. Определение концентрации РНК 55
2.2.1.3.Анализ выделенной РЫК методом гель-электрофореза 55
2.2.1.6. Обработка препарата РНК ДНКазой 55
2.2.2. Синтез первых цепей кДНК'на матрице суммарной РНК. 56
2.2.3. Выделение ДНК. 57
2.2.3.1. Выделение плазмидной ДНК 57
2.2.3.2. Выделение высокомолекулярной ДНК 57
2.2.4. Очистка олигонуклеотидных праймеров 58
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (PCR) 59
2.2.5.1. Стандартная пропись PCR-амшшфикации 59
2.2.5.2. RT-PCR-амплифшеациг 60
2.2.5.3. Приготовление матрицы для PCR из суспензии клеток 60
2.2.6. Электрофорез в агарозном геле 61
2.2.7. Определение концентрации фрагментов ДНК. 61
2.2.8. Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и PCR фрагментов на автоматическом секвенаторе 61
2.2.9. Трансформация Е. coll 61
2.2.10. Рестрикция и лавирование 62
2.2.10.1. Аналитическая рестрикция выделенных плазмид 62
2.2.10.2. Препаративная рестрикция, выделение и очистка плазмид и фрагментов ДНК. 63
2.2.10.3. Лигирование 63
2.2.11. Культивирование клеток 64
2.2.12. Трансфекция клеток. 64
2.2.13. Позитивно-негативная селекция 65
2.2.14. Получение клеточного лизата. 65
2.2.15. Определение количества белка 66
2.2.16. Определение флуоресценции EGFP в клеточныхлизатах. 66
2.2.17. Определение активности люциферазы 66
2.2.18. 5 'RACE (Rapid Amplification of 5 'cDNA Ends) 67
2.2.19. Программное обеспечение 69
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Теоретическое обоснование работы и экспериментальные задачи 71
3.2. Анализ транскрипта, содержащего в своем составе LTR HERV-K 72
3.3. PCR-анализ локусов, различающихся по присутствию LTR HERV-K 74
3.4. Филогенетический анализ представителей подсемейства KIAA1245 генома человека 75
3.5. Определение возраста интеграции LTR в предковую последовательность LTR-содержащих генов 76
3.6. Сравнение последовательностей представителей подсемейства К1АА1245 различных приматов 78
3.7. Анализ транскрипции генов подсемейства КІАА1245 80
3.7.1. Анализ транскрипции генов подсемейства К1АА1245 в нормальных тканях человека 81
3.7.2. Анализ транскрипции генов подсемейства К1АА1245 в опухолевых тканях человека и трансформированных клеточных линиях 82
3.7.3. Анализ транскрипции генов подсемейства К1АА1245 в эмбриональных тканях человека 83
3.7.4. Анализ транскрипции LTR-содержащих генов подсемейства КІАА1245 85
3.7.5. Вклад каждого из LTR-содержаіцих генов в общую транскрипцию 90
3.8. Экспериментальное подтверждение энхансерной активности исследуемого LTR . 91
3.9. Роль LTR в транскрипции генов подсемейства КІАА1245 95
3.9.1. Расположение генов на хромосомах 95
3.9.2. Анализ регуляторних последовательностей в промоторных областях генов 96
3.9.3. Метилирование промоторных областей генов 97
3.10. Анализ промоторной активности исследуемого LTR HERV-K 99
3.11. Определение промоторной активности исследуемого LTR in vitro 104
Выводы 108
Список литературы 109
- Участие HERV в нормальных и патофизиологических процессах, протекающих в клетке
- Влияние эндогенных ретровирусов и одиночных LTR на функционирование генома человека
- Сравнение последовательностей представителей подсемейства К1АА1245 различных приматов
- Экспериментальное подтверждение энхансерной активности исследуемого LTR
Введение к работе
Около половины генома человека состоит из повторяющихся элементов [1], большинство из которых ретроэлементы (РЭ) - мобильные элементы, распространяющиеся в геноме клетки-хозяина с помощью ретротранспозиции, процесса, заключающегося в обратной транскрипции генома РЭ и реинтеграции синтезированной кДНК в геном клетки-хозяина.
Среди ретроэлементов на долю разных семейств HERV и одиночных LTR приходится около 8% генома человека [2], причем преобладают одиночные полеоразмерные LTR. Их появление в геноме можно объяснить рекомбинацией между 5' LTR и 3' LTR полноразмерного провируса, вследствие чего на месте его интеграции остается одиночный LTR. Для семейства HTDV/HERV-K предполагаемое число одиночных LTR составляет несколько тысяч копий на геном [3-11].
При интеграции в геном мобильные элементы могут нарушать экспрессию каких-либо генов, способны изменять регуляторные участки генов, участвовать в процессах репарации ДНК и сплайсинге, в перестройке хроматина и т.д. Будучи мобильными переносчиками транскрипционных регуляторных элементов, РЭ могут влиять на экспрессию генов клетки-хозяина, предоставляя им различные регуляторные последовательности, входящие в их состав. Потенциальная возможность влиять на регуляцию генов, особенно генов, вовлеченных в эмбриональное развитие, делает РЭ подходящими кандидатами на участие в процессах видообразования. У молодых в эволюционном отношении генов, например таких, как гены, вовлеченные в иммунитет или гены ответа на внешние раздражители, мРНК значительно обогащены РЭ по сравнению с мРНК высоко консервативных генов, задействованных в развитии или обмене веществ [12]. Внедрение LTR рядом с каким-либо геном может к имеющейся тканеспецифичности экспрессии добавить способность экспрессироваться еще в одной ткани, где продукт гена оказывается выгодным по той или иной причине. Однако, очень сложно доказать, что ген приобретает новую регуляторную
особенность именно благодаря интеграции ретроэлемента, а не благодаря сопутствующим событиям, которые находятся вне поля зрения исследователя. Одним из путей, способным решить эту проблему, может быть сравнительный анализ транскрипции членов одного и того же семейства генов, которые были недавно дуплицированы в процессе эволюции. Будучи близкими по структуре, такие гены могут различаться по интеграции ретроэлементов. В этом случае гены, в одних и тех же клетках с одним и тем же набором транскрипционных факторов и других модуляторов их активности, могут различаться своим функциональным поведением в зависимости от присутствия в их составе РЭ.
Настоящая работа посвящена изучению влияния интеграции LTR HERV-K на регуляцию экспрессии генов человека и является частью комплексных исследований, проводимых Лабораторией Структуры и Функций Генов Человека, посвященных влиянию повторяющихся элементов на функционирование геномов человека и других видов приматов.
В процессе проведения данной работы впервые было найдено и описано семейство генов, некоторые члены которого различаются между собой интеграцией LTR HERV-K в один из интронов. Среди данного семейства выделяется подсемейство, представляющее собой уникальную природную модель, поскольку в него входят гены, практически идентичные по структуре, но различные по присутствию LTR HERV-K. Это позволило провести сравнение транскрипционной активности LTR-содержащих и LTR-ие содержащих генов в одних и тех же условиях
На этой модели мы показали, что:
гены данного подсемейства не транскрибируются во взрослых тканях человека, а транскрибируются только в человеческих эмбриональных и опухолевых тканях, а также в культурах клеток человека;
транскрибируются только LTR-содержащие гены изучаемого подсемейства;
- транскрипционная активность LTR-ne содержащих генов не была детектирована;
В экспериментах in vitro была показана тканеспецифичная энхансерная активность LTR, входящего в состав подсемейства, а также его промоторный потенциал.
Достоверность полученных результатов была подтверждена всеми необходимыми контролями.
Таким образом, мы показали, что присутствие LTR играет важную роль в регуляции транскрипционной активности подсемейства генов KIAA1245, причем такое воздействие па транскрипцию генов происходит в одинаковых внутриклеточных условиях.
Участие HERV в нормальных и патофизиологических процессах, протекающих в клетке
Транскрипция ERV была показана во многих тканях и культурах клеток человека [4, 82, 83]. Наиболее высокий уровень транскрипции HERV обнаружен в плаценте, эмбриональных и опухолевых тканях. Примечательно, что существуют химерные транскрипты генов разных семейств ERV, а также химерные транскрипты генов клетки-хозяина и HERV.
Примером второго случая служит HERV-H-транскрипт, в котором ретровирус-подобный элемент RTVL-H сплайсирован с последовательностью, содержащей ORF для 689 аминокислот, и имеющей два домена, гомологичных фосфорилазе А2 [84]. Этот транскрипт обнаружен в двух клеточных линиях тератокарциномы и не найден в других тканях и клеточных линиях. Подобный же случай описан для HERV-E - элемента, спланированного с геном калбиыдина [85].
Функциональная роль координировано транскрибируемых клеточных и вирусных генов в клетке до сих пор не ясна. Поэтому естественно обратить внимание на участие и роль HERV в нормальных и патофизиологических процессах. Факт распространенности ERV и их элементов ставит вопрос о степени их вовлеченности в клеточную физиологию с точки зрения нейтральности, полезности или вреда, а также эволюционных перспектив хозяина при таких симбиозах. Имеются данные об участии ERV в эмбриогенезе и развитии плаценты, в иммунном ответе, а также в причастности к возникновению опухолей и диабета [82, 86-103].
Ретровирусы были идентифицированы как агенты, вызывающие рак у животных. Для человека вовлеченность HERV в процесс опухолеобразования не доказана, но и не опровергнута. Причастность к раку ретровирусов может быть обусловлена несколькими особенностями. Во-первых, возможным участием в регуляториых функциях, т.к. промотор вируса, расположенный в LTR, может обеспечивать экспрессию клеточных онкогенов. Во-вторых, за счет появления новых генов. Измененные гены клетки, объединенные между собой или с вирусными генами, могут давать белковые продукты с непредсказуемыми функциями. В-третьих, ретровирусы могут нарушать структуру клеточных генов в местах интеграции и тем самым изменять их функции, в частности, может происходить инактивация генов онкосупрессоров. Второй и третий случай тоже могут привести к онкогенезу. В результате встраивания промотора в составе LTR в различные онкогены может происходить индукция этих генов [104, 105].
Перечисленные возможности на сугубо генетическом уровне не исчерпывают роли ERV в онкогенезе. Известно, что в опухолях человека часто продуцируются иммуносупрессивные факторы, сходные с ТМ (Transmembrane Protein), кодируемым геном env [106]. Являются ли эти факторы продуктами клеточных генов или I-1ERV - не известно, но некоторые HERV кодируют белки, сходные с классическим трансмембранным белком [106]. Таким образом, иигибирование ретровирус-родственных иммуыосупрессивных белков может иметь отношение к контролю роста злокачественных опухолей человека. Экспрессия HERV ТМ-подобных молекул в процессе развития опухоли может обеспечивать механизм выключения (модулирования) действия натуральных киллеров и Т-киллеров на опухолевые клетки, что может являться одним из этапов в многостадийном процессе развития опухолей [107].
Белки ERV сами могут являться аутоантигенами и вызывать аутоиммунные ответы [108]. Помимо этого, предполагается участие ERV в возникновении других аутоиммунных расстройств по механизму молекулярной мимикрии [109].
В процессе эволюции длинные концевые повторы эндогенных ретровирусов оказались в различных сайтах в составе генетического локуса, который, как считают, ответственен за возникновение инсулин-зависимой формы диабета типа I (IDDM). Был проведен анализ наличия HERV-К LTR (DQ-LTR3) в HLA DQ участке этого локуса и анализ их связи с DRB1, DQA1 и DQB1 гаплотипами у пациентов с этим видом заболевания. Было показано, что DQ-LTR3 присутствует в DQA1 и DQB1 гаплотипах, и отсутствует в других. Авторы предполагают, что присутствие DQ-LTR3 в соответствующих гаплотипах, может служить независимым генетическим маркером, позволяющим определить риск возникновения диабета типа I [110].
Кроме того, при исследовании рассеянного склероза были получены данные о связи ERV в некоторых локусах генома человека с этой болезнью [ Ш -113]. В конце девяностых выделили склероз-ассоциированный ретровирус (MSRV), который имел активность обратной транскриптазы [112]. В дальнейшем обнаружили, что этот эндогенный ретровирус представляет собой химерную форму HERV-H и ERV-9 [111]. Этот тип эндогенных ретровирусов назвали HERV-W. В дальнейшем доказали, что MSRV является репликациошю-компетеитиым HERV и может упаковываться в вирусные частицы [112].
Сейчас активно обсуждается участие ER.V в другом аутоиммунном заболевании -ревматоидном артрите [56, 114-116]. В синовиальной жидкости пациентов с данной болезнью обнаружили транскрипты HERV-W [114]. Возможно, какие-либо ERV содействуют1 развитию ревматоидного артрита по механизму, аналогичному 1DDM.
Обнаружение вирусных частиц в эмбриональных тканях и плаценте привлекает особое внимание из-за их возможной роли в процессах развития и патогенетических событиях. Показано, что вирус-подобные частицы (Virus-Like Particles, VLP) присутствуют в плаценте приматов и ассоциированы, в основном, с базалы-юй поверхностью плацентарного синцитиотрофобласта [82, 87]. Немаловажным является уровень дифференцировки клеток: как показано, цитотрофобласты не содержат подобных частиц, VLP обнаруживаются лишь в цитотрофобластах, дифференцировавшихся в синцитиотрофобласт [87, 96]. Это позволяет считать, что строгая регуляция экспрессии VLP обусловлена клеточными факторами, появляющимися на определенной стадии клеточной дифференцировки. Принципиальными событиями при формировании плаценты являются создание иммунологического барьера и дифференцировка способных к делению трофобластов в неспособные к делению синцитиотрофобласты. По-видимому, во время радиальной эволюции отдельных отрядов млекопитающих от общего предка, множество ретровирусов внедрялось в герминогеиные клетки млекопитающих. Большинство из этих событий были, конечно, селективно негативные, но отдельные случаи могли привести к увеличению способности деления цитотрофобластов с последующей способностью их к слиянию и формированию примитивной плаценты [87].
Проявляя свое действие на таком важном участке влияния как плацента, ERV, например ERV-3, могут участвовать в иммунной защите эмбриона и зародыша, в регуляции роста и дифференциации цитотрофобластов, способствовать защите плода от нежелательных материнских веществ и экзогенных ретровирусов [87, 117]. Впрочем, для плаценты характерен высокий уровень экспрессии и других семейств HERV, например HBRV-W, что также может играть определенную роль в эмбриогенезе [118]. Известно, что уникальный локус ervwel семейства W человеческих эндогенных ретровирусов кодирует гликопротеин оболочки вируса, синцитин [119]. Этот белок ERVWE1 ENV был обнаружен in vivo в слое синцитиотрофобластов в плаценте [120, 121].
Влияние эндогенных ретровирусов и одиночных LTR на функционирование генома человека
Регуляция генов в геномах млекопитающих включает в себя невероятно сложные сети взаимодействий различных си-регуляторных элементов с ґгаиі-действующими факторами, цель которых - достижение и поддержание правильной тканеспецифичности экспрессии генов. Чрезвычайно важно найти такие компоненты регуляторной системы генома. Среди большого количества кандидатов па эту роль одними из очевидных участников регуляторной машины организма являются различные виды человеческих эндогенных ретровирусов и их длинные концевые повторы LTR.
Как было описано выше, LTR HERV содержат различные потенциальные транскрипционные регуляториые последовательности, которые консервативны у LTR разного эволюционного возраста [69]. Такие последовательности могут оказывать воздействие на клеточные гены. Было показано, что ERV, включая и человеческие, могут участвовать в регуляции транскрипции и трансляции генов хозяина: их LTR могут проявлять промоторную и эихансерную активность [49, 128, 152-154], специфически взаимодействовать с клеточными регуляторными белками [48, 128, 148]. быть терминаторами транскрипции [155], участвовать в альтернативном сплайсинге клеточных генов, расположенных рядом [156], в ремоделировапии хроматина [61], влиять на регуляцию транскрипции, и трансляции [84].
Несмотря на то, что уже расшифрованы нуклеотидные последовательности геиомов многих организмов, таких как человек, мышь и т.д., иаше понимание механизмов регуляции транскрипции и возникновения имеющегося разнообразия белков еще далеко не полное. Все чаще встречаются работы, которые показывают существование альтернативных промоторов для генов. Они демонстрируют нам, что такой феномен является одним из важных источников для белкового и регуляторного разнообразия.
Использование последовательностей эндогенных ретровирусов и других перемещающихся элементов в качестве транскрипционных промоторов не является необычным в геноме [157]. Известно много примеров участия LTR эндогенных ретровирусов в транскрипции в качестве альтернативных промоторов генов. Кроме гена последовательности «цинковых пальцев» ZNF80 [152] подобный эффект обнаружили в процессе исследования генов аполипопротеина С-І (АРОС-І) и рецептора эндотелина В (EBR). В обоих случаях используется промотор LTR HERV-E, причем и тот и другой гены имеют обычные клеточные промоторы (не LTR-промоторы). Промотор LTREBR используется чаще, чем клеточный промотор. Более того, под воздействием энхансера, входящего в состав промотора LTREBR, происходит усиление экспрессии данного гена в плаценте. Промотор LTRAPOC-J довольно слабый, т.к. всего около 15% траискриптов инициируются с него. Несмотря на высокую степень идентичности двух вышеописанных LTR, различия в нуклеотидных последовательностях их регуляторных элементов оказывают решающий эффект на их промоторную активность и демонстрируют сложность регуляторных воздействий LTR человеческих эндогенных ретровирусов на экспрессию генов [158,159].
В случае гена человека CYP19, который кодирует белок Р450 ароматазы, вовлеченный в синтез эстрогена, LTR эндогенного ретровируса является одним из 6 альтернативных промоторов. LTR индуцирует высокий уровень транскрипции в плаценте и является уникальным для человека и других приматов [12, 160-162].
Иногда LTR может быть единственным промотором гена, что было показано для LTR эндогенного ретровируса RTVL-H, кодирующего белок, подобный фосфолипазе А2 (PLA2L) [163]. Вовлеченность некоторых эндогенных ретровирусов в расширение биологических функций путем предоставления своих транскрипционных регуляторных элементов клеточным генам была подтверждена и случаем с геном MIDI. LTR HERV-E, который является одним из его альтернативных промоторов, приводит к ткаиеспецифичности транскрипции. Наибольший вклад LTR-индуцированиых транскриптов в общее количество транскриптов гена MIDI - в плаценте и эмбриональной почке, он составляет 25% и 22% соответственно. Кроме того, было показано, что LTR усиливает активность других альтернативных, иеретровирусных, промоторов этого гена [164].
Как было показано выше, существует немало случаев лишь частичного вклада LTR как: альтернативных промоторов в общую транскрипцию генов, но есть и данные, что промоторная активность LTR может быть достаточно высока. Кроме случая с промотором гена EBR, существуют еще примеры, когда регуляторные элементы LTR эндогенных ретровирусов используются чаще, чем основные промоторы, например в случае гена GSDML (gasdermin-like protein). Локус этого гена - "горячая точка" онкогенных рекомбинаций. Его альтернативным промотором является LTR HERV-H, расположенный в обратной ориентации. В данном случае участие LTR значительно увеличивает количество тканей, в которых экспрессируетея ген GSDML. Это, а также специфичность LTR для геномов человекообразных обезьян и человека, указывает на участие этого ретровируеного элемента в транскрипционной регуляции в течение эволюции приматов [165]. Возможно, внедрение LTR в подобные локусы может способствовать и возникновению онкогенных рекомбинаций.
Было показано изменение ткаиеспецифичности экспрессии гена плейотропина (PTN фактора роста человека) после внедрения HERV, за счет инициации транскрипции с LTR в трофобластах [166]. Внедрение HERV в геном в данном случае произошло также после отделения ветви человекообразных обезьян.
Как видно, влияние внедрения HERV и одиночных LTR на ткаиеспецифичность экспрессии гена является достаточно частым явлением, также как и время внедрения - интеграции таких ретроэлементов обычно происходили между разделением ветвей высших обезьян (орангутан, горилла, шимпанзе, человек) и обезьян Старого Света (макаки, колобусы, бабуины и др.). Такие данные дают возможность предположить участие HERV и одиночных LTR в эволюции. LTR, как отмечено выше, способен выступать и в качестве терминатора транскрипции. При скрининге библиотеки кДНК полностью сформированной плаценты были обнаружены два клона, содержащие не родственные HERV-H семейству клеточные последовательности, которые были полиаденилированы внутри LTR HERV-H. Анализ этих клонов показал, что они содержат ORF нового гена, названного pit. Исследователи предполагают, что мРНК гена pit подвергается альтернативному сплайсингу на З -конце и полиаденилироваииго внутри HERV-H LTR, тем самым, образуя два типа транскриптов [155]. Кроме этого случая, ранее Mager et al. [167] было изолировано два химерных транскрипта, состоящих из пуклеотидыой последовательности клеточного гена и LTR HERV-И, который полиаденилировап в типичном вирусном poly(A) сайте. Другие LTR, представляющие семейство HERV-H, участвуют в образовании химерных транскриптов с геном, кодирующем HMGI-C, негистоновый компонент хроматина. Кластер HERV-H элементов расположен в третьем интропе гена HMGI-C и этот участок является местом частых перестроек при доброкачественных опухолях человека. Предоставляя свои сигналы полиаденилирования, LTR HERV-H способствуют образованию химерных транскриптов, в которых отсутствует часть кодирующей последовательности HMG1-C, отвечающая за синтез ДНК-связывающей части белка [168].
Сравнение последовательностей представителей подсемейства К1АА1245 различных приматов
Дифференциальная транскрипция генов изучаемого подсемейства может быть результатом как присутствия LTR, так и других факторов, например различий в регуляториых последовательностях промоторных областей и их статусе метилирования, различной хромосомной локализации генов этого семейства.
Для выяснения возможной зависимости транскрипции различных представителей подсемейства KIAA1245 от их хромосомного локуса был проведен анализ положения генов подсемейства на хромосомах. Анализ показал, что все гены изучаемого подсемейства локализованы на хромосоме 1 человека, один из двух LTR-несодержащих генов (AL592309) находится на коротком плече хромосомы (1р36.12), тогда как все остальные гены (LTR содержащие гены AL592284, AL049742 и AL954711, а также LTR-иесодержащий ген AL356957) расположены рядом друг с другом на длинном плече этой хромосомы. Расстояние между LTR-содержащими генами составляет около 1.6 и 2 миллионов пар оснований, а расстояние между одним из LTR-несодержащих и группой LTR-содержащих генов составляет около 600 тысяч пар оснований. Такое близкое положение генов дает возможность предполагать, что различная транскрипционная активность все же зависит от различий во внутреннем составе генов, например от присутствия или отсутствия LTR в их составе, чем от позиционного эффекта расположения генов. Дифференциальная транскрипция LTR-содержащих и LTR-несодержащих генов изучаемого подсемейства может быть результатом различий в регуляторных последовательностях промоторных областей генов. Для исключения подобной возможности мы провели подробный биоинформатический анализ регуляторных последовательностей промоторных областей всех генов подсемейства. Промоторные участки исследуемых генов еще мало изучены. С помощью программы Gene2Promoter пакета программ GENOMATIX мы постарались идентифицировать и сравнить промоторные области LTR -содержащих и LTR-несодержащих генов. Все промоторы отличались многочисленными вставками ретроэлементов. Для каждого гена выделили область, лежащую выше относительно начала транскрипции, которая включала в себя промоторную область и по длине превосходила ее в два раза. На этом фрагменте длиной 1300 пар оснований находятся два Alu, два Line2 и одни MaLR элемент. Локализация и классы РЭ идентичны для всех генов подсемейства, за исключением одного LTR-содержащего гена, у которого был обнаружен дополнительный Alu элемент и, вследствие этого, вряд ли обусловливают разницу в транскрипции генов, хотя и содержат необходимые для этого элементы.
Далее мы провели анализ промоторной области с помощью программы Matlnspector пакета программ GENOMATIX для определения последовательностей, связывающих различные факторы транскрипции. Нашей задачей было сравнить регуляторные последовательности LTR -содержащих и LTR-несодержащих генов и найти такие последовательности, которые присутствуют только у одного типа генов и, таким образом, могут влиять на дифференциалы-гость транскрипции. После анализа транскрипционных факторов, сайты связывания которых находились на изучаемой последовательности, на участие в процессах опухолеобразования и эмбриогенеза (так как экспрессия подсемейства генов была обнаружена лишь в эмбриональных и опухолевых тканях, а в нормальных тканях взрослого человека - нет) было отобрано 5 LTR(+) специфических и 2 LTR(-) специфических сайта связывания транскрипционных факторов. Коровые последовательности этих сайтов связывания сравнили у всех LTR -содержащих и LTR-не содержащих генов. Мы не обнаружили ни одного сайта связывания транскрипционных факторов, как активирующего, так и подавляющего транскрипцию, последовательность которого полностью совпадала со всеми последовательностями одной группы генов и отличалась от другой группы генов. Обычно даже незначительные изменения в последовательности ДНК, отвечающей за связывание факторов транскрипции, приводят к значительному уменьшению сродства этих факторов с ДНК.
Таким образом, биоинформатический анализ не обнаружил каких-либо систематических различий между регуляторными сайтами промоторов в LTR -содержащих и LTR-не содержащих генах.
Дифференциальная экспрессия LTR-содержащих и LTR-несодержащих генов изучаемого подсемейства может быть также результатом метилирования регуляторных последовательностей промоторных областей генов этого подсемейсгва. Поэтому мы провели анализ метилирования всех промоторных областей всех генов подсемейства KIAA1245. В анализе использовали определенную ранее промоторную область LTR-содержащих и LTR-несодержащих генов. С помощью пакета программ Vector NTI v. 9.0 провели поиск CpG островков, а также дифференциально расположенных CG пар в коровых последовательностях сайтов связывания транскрипционных факторов, которые могут быть метилированы. Всего в последовательностях длиной 1300 п.н. было обнаружено 10 CG пар в LTR -содержащих генах и 13 CG пар в LTR -несодержащих. Таким образом, в исследуемой зоне отсутствуют CpG островки. Также было обнаружено, что все регуляторные сайты, в которых присутствуют CG пары, находятся максимум лишь на одной из пяти последовательностей подсемейства генов, то есть не могут влиять на транскрипцию всех LTR-содержащих или всех LTR-несодержащих генов и не могут приводить к дифференциальной транскрипции группы генов.
Для исключения различий в статусе метилирования промоторных участков генов мы провели также экспериментальный анализ метилирования. Были определены уровни транскрипции генов подсемейства KIAA1245 в клеточной линии 293 и в той же линии клеток, но обработанной 5-аза-2 -дезоксицитидином, ДНК-деметилирующим агентом. RT-PCR с парами праймеров, специфическими ко (і) всем генам подсемейства КІАА1245 (Prl/Pr4), (іі) только к LTR-содержащим генам (Prl/Pr2), и (iii) только к LTR-несодержащим генам (Prl/РгЗ) показал (рис. 22), что уровень транскрипции генов, в частности LTR-содержащих генов, не меняется при обработке клеток деметилирующим агентом. Из этого можно сделать вывод, что в данном случае метилирование не влияет на транскрипцию.
Экспериментальное подтверждение энхансерной активности исследуемого LTR
Промоторную активность LTR определяли в экспериментах по транзиентной трансфекции. На основе плазмиды pGL3-Basic Vector (Promega) были получены векторные конструкции, где в качестве промотора репортерного гена встроен LTR в прямой и обратной ориентациии, pGL3-BV/LTR(FOR) и pGL3-BV/LTR(REV), соответственно (рис. 26).
С ними были проведены серии трансфекции (минимум по три на каждой линии клеток) клеточных линий различного происхождения. В качестве контроля использовали плазмиду pGL3-PV, в которой экспрессия репортерного гена находится под контролем промотора вируса SV40. Для определения эффективности трансфекции использовали плазмиду pEGFP-Nl (Clontech), аналогично экспериментам по энхансерной активности LTR.
Правильность сборки конструкций подтверждали рестрикционным анализом и PCR-амплификацией конструкций с использованием, помимо праймеров, специфичных для последовательности LTR, праймеров GL2 и RV3 (Promega., США) (табл. 2), фланкирующих сайты клонирования LTR в векторы. Кроме этого, последовательность LTR гена AL592284, клонированного в вектор pGL3-PV, была подтверждена с помощью секвенирования.
Полученные в сериях экспериментов значения активности выравнивали с учетом эффективности трансфекции. Все результаты выражали в долях от результатов для pGL3-PV для данной линии.
Как видно из гистограммы (рис. 27), LTR гена AL592284 подсемейства KIAA1245, находящийся в прямой ориентации относительного репортерного гена, обладает тканеспецифической промоторной активностью, приводящей к повышению уровня экспрессии репортерного гена в клеточной линии Тега 1 в 4 раза по сравнению с его экспрессией в контрольном векторе pGL3-PV. В линии клеток HeLa промоторная активность изучаемого LTR не превышает люциферазную активность вектора pGL3-PV. При положении LTR в обратной ориентации относительно репортерного гена уровень экспрессии последнего повышается почти в два раза в клеточной линии Тега 1 и не превышает активности гена люциферазы в векторе pGL3-PV в клеточной линии HeLa.
Таким образом, в экспериментах in vitro мы показали, что LTR, находящийся во втором интроне группы генов подсемейства KIAA1245, действительно способен инициировать транскрипцию. Кроме того, в гетерологической системе промотор LTR был сильнее, чем промотор SV40, стандартный промотор для экспрессии генов в клетках млекопитающих. Вследствие этого, транскрипция, инициированная с LTR, может составлять значительную часть от общей транскрипции LTR-содержащих генов в клетках человека. Также, с помощью 5 RACE, мы показали новый класс транскриптов этого гена, которые не содержат первого и второго экзонов и инициированы с промотора LTR. На сегодняшний день известны случаи участия LTR эндогенных ретровирусов в транскрипции в качестве альтернативных промоторов генов. Например, подобный эффект обнаружили в процессе исследования генов аполипопротеина C-I (APOC-I) и рецептора эндотелина В (EBR). В обоих случаях используется промотор LTR HERV-E, причем и тот и другой гены имеют обычные клеточные промоторы (не LTR-промоторы). Более того, промотор LTREBR используется чаще, чем клеточный промотор [158, 159]. Такое показано и в случае гена GSDML (gasdermin-like protein). Его альтернативным промотором является LTR HERV-H, расположенный в обратной ориентации. В данном случае участие LTR значительно увеличивает количество тканей, в которых экспрессйруется ген GSDML.
Такая активность LTR, а также его специфичность для геномов человекообразных обезьян и человека, указывает на участие этого ретровирусного элемента в транскрипционной регуляции в течение эволюции приматов Резюмируя полученные результаты, можно сделать вывод, что присутствие LTR играет важную роль в регуляции транскрипционной активности подсемейства генов KIAA1245. Представленное семейство генов является уникальной природной моделью, на примере которой можно изучать роль LTR в транскрипции генов. Полученные данные демонстрируют интересный феномен воздействия определенного LTR на экспрессию генов. Такое воздействие происходит в одинаковых внутриклеточных условиях и, таким образом, скорее всего за счет внутренних -характеристик внедренных LTR. Достаточно правдоподобным является предположение, что эти LTR функционируют как ткаиеспецифические энхансеры, активные на эмбриональных стадиях развития. Такие внедрения могут придавать новые черты организмам и являться объектом отбора в эвошоции приматов. 1. Обнаружено подсемейство генов KIAA1245, состоящее из пяти близкородственных генов, три из которых содержат в своих интронах LTR HERV-K, тогда как остальные два - нет. Методами биоинформатики проведен сравнительный структурный и эволюционный анализ членов подсемейства, различающихся по интеграции LTR. HERV-K. 2. Сравнительным PCR-анализом геномов различных видов показано, что интеграция LTR в гены AL049742 и AL592284 подсемейства КЇАА1245 произошла после отделения эволюционной ветви орангутана от остальных гоминоидов. но до отделения ветви гориллы, то есть между 8 и 13 миллионами лет назад. Интеграция LTR в геи AL954711. по данным множественного выравнивания, произошла около 6 миллионов лет назад. 3. Исследована транскрипционная активность данного подсемейства. Показано, что вне зависимости от присутствия LTR гены подсемейства не транскрибируются в нормальных тканях взрослого человека. В опухолевых, эмбриональных тканях и трансформированных культурах клеток человека транскрибируются только LTR-содержащие гены этого подсемейства. 4. Показано, что в опухолевых и эмбриональных тканях человека экспрессируются все три формы LTR-содержащих генов изучаемого подсемейства, тогда как в трансформированных клеточных линиях экспрессируются лишь две более старые формы LTR-содержащих генов, а самая молодая - нет. 5. В экспериментах in vitro показаны необычно высокая тканеспецифическая энхансерная и промоторная активности LTR подсемейства KIAA1245. 6. Полученные данные дают основания для заключения, что именно внедрение LTR и их энхансерная активность послужила основой появления транскрипционной активности членов подсемейства KIAA1245.
