Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 17
Некоторые проблемы создания лекарственных препаратов на основе пептидов 17
Меланокортины и их аналоги, функции в ЦНС 19
Пептидное семейство меланокортинов 19
Меланокортины как нейропеитиды 21
Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих. Проблема места синтеза меланокортинов. Нормальный и поврежденный мозг 22
Общие трофические свойства меланокортинов 25
Влияние меланокортинов на нейроны ЦНС 26
Ноотропные и нейропротекторные эффекты меланокортинов 27
Ноотропные и иейропротекторные эффекты Семакса 31
Нейротрофины и их характеристика 37
Общая характеристика семейства нейротрофинов 37
Характеристика нейротрофина BDNF 41
Экспрессия BDNF в нервной системе 42
Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции 44
Рецепторы для BDNF 48
Суточные колебания уровня BPNF 49
Факторы, влияющие на экспрессию BDNF в ЦНС 52
Нейродегенерации Адьцгеймеровского типа и гены нресенилина 62
Клинические и гистопатологические признаки болезни Альцгеймера 63
Генетические факторы и гены Болезни Альцгеймера 66
Функции генов пресенилинов 72
Участие пресенилинов в ап о птозе клеток 73
Материалы и методы исследования 76
Использованные материалы и реагенты 76
Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса и других пептидов 76
Выделение плазматических мембран мозга 77
Определение концентрации белка 78
Радиолигандный анализ 78
Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур 79
Получение и ведение первичных клеточных культур 81
Оценка выживаемости нейронов in vitro : 89
Оценка уровня пролиферации клеток 90
Подготовка плазмидной ДНК для трансфекции культур клеток млекопитающих 91
Трансфекция клеток линии РС12 с помощью электропорации 91
Получение трансфидированных поликлональных культур клеток РС12 и клонов индивидуального происхождения 93
Выделение высокополимерной геномной ДНК клеточных культур 95
Анализ стабильно-траясфицированных культур РС12 с помощью полимеразной цепной реакции (ППР') 95
Изучение дифференцировки РС12 клеток 96
Анализ пролиферации клеток PC 12 96
Изучение апоптоза в трансфнцированных культурах клеток РС12 97
Получение антител, использованных в работе 97
Выделение белковых гомогенатов из культур клеток PC 12, глиальных и нейрональных культур. Электрофорез белков в нолиакриламидиом геле. Вестерн-блоттинг 98
Анализ количества фосфорилированной формы МАР-киназы о помощью иммуиоблотинга 99
Определение активности холинацетилтрансферазы 99
Оценка уровня экспрессии мРНК нейротрофинов в культуре глии 100
Оценка уровня экспрессии trkB мРНК в первичных культурах глиальных клеток 102
Оценка уровня экспрессии мРНК для bdnf и trkB in vivo 103
Определение уровня BDNF в отделах мозга крысы in vivo 107
Статистнстичеекая оценка результатов 108
Результаты и их обсуждение 109
Связывание Се макс а с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы 109
Деградация Семакса в присутствии плазматических мембран, культивируемых нейронов и глии базальных ядер переднего мозга крысы. 114
Влияние Семакса на пролиферацию глии базальных ядер переднего мозга крысы in vitro 119
Влияние Семакса на выживаемость культивируемых нейронов, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы 121
Влияние Семакса на выживаемость тирозингидроксилаза-положительных нейронов, полученных из среднего мозга эмбрионов крысы 127
Исследование нейропротекторных эффектов Семакса в клеточных моделях индуцированной нейротоксичности 127
Модель гибели дофаминергических нейронов in vitro, индуцированной 6ГДА 129
«Пресенилиновая» клеточная модель болезни Альцгеймера 130
Влияние а-МСГ на уровень BDNF в первичных нейрональных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс 146
150 162 165
Влияние Семакса на экспрессию мРНК BDNF и NGF в культуре глиальных клеток, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы 146
Влияние Семакса на уровень BDNF в базальных ядрах переднего мозга крысы in vivo 148
Влияние Семакса на экспрессию BDNF в гмшокампе. мозжечке и коре больших полушарий мозга крысы in. vivo 150
Влияние Семакса на экспрессию TrkB в гиппокампе крысы 162
Возможный механизм действия Семакса в 1.ЩС 165
Семакс в качестве лекарственного препарата для лечения нейродегенеративных заболеваний (ишемический инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона) 172
Клеточная система для тестирования соединений с потенциальной нейр опр о текто риой активностью 176
Заключение 178
- Пептидное семейство меланокортинов
- Характеристика нейротрофина BDNF
- Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур
- Влияние Семакса на выживаемость культивируемых нейронов, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы
Введение к работе
Создание новых эффективных и безопасных фармакологических средств для повышения эффективности умственного труда в сложных условиях и коррекции патологий центральной нервной системы (ЦНС), включающих пейродегснеративные заболевания, особенно актуально в современную эпоху, которая характеризуется повышением влияния стрессогеиных факторов на организм человека, а также ухудшением экологической обстановки во многих областях земного шара. Длительное психическое напряжение, сопряженное с указанными выше факторами, постоянно сопровождает многие современные сферы деятельности человека, несмотря на постоянное совершенствование их технического обеспечения, и приводит к повреждению и гибели нервных клеток. Развитие нейродегенеративных процессов в ЦНС также связано с различными патологиями, наследственной предрасположенностью и черепно-мозговыми травмами, Доля нейродегенеративных заболеваний в общей структуре заболеваемости возрастает при увеличении продолжительности жизни [197]. Наиболее распространенными являются болезнь Альцгеймера [8,9,190] и инсульты [13]. Инсульты, по нашему мнению, могут быть отнесены к нейродегенеративным заболеваниям в связи с массовой гибелью клеток, в частности нейронов, в ЦНС. В настоящее время количество людей в мире, страдающих болезнью Альцгеймера, составляет по разным оценкам до 10 миллионов человек. По прогнозам, в случае, если ученые не найдут средство против этой болезни, уже через 25 лет от этого недуга будут страдать 22 миллиона жителей нашей планеты, а через 50 лет - примерно 45 миллионов [190,197]. Сходная ситуация и с инсультами. Ежегодно в мире переносят инсульт около 6 миллионов человек, умирает 4,7 миллиона. В России в год регистрируется до 450 тысяч инсультов, причем большинство из них относятся к тяжелой и средней степени тяжести [13]. Лишь около 20% выживших больных могут вернуться к прежней работе.
Современная медицина располагает довольно широким перечнем соединений, обладающих определенным нейропротекториым действием, таких как модуляторы ионных каналов, соединения с анти-эксайтотоксическим действием, противовоспалительные агенты, соединения, понижающие уровень свободных радикалов, нейротрофические факторы [13.197]. Однако ни одно из них не сочетает одновременно высокую эффективность, длительность действия, быстроту наступления эффекта и отсутствие негативных последействий. Большие надежды на успехи в лечении инсультов, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний связывают в перспективе с клеточной и генной терапией [28,29].
В поисках более эффективных и одновременно безопасных средств ученые обращаются к возможному использованию эндогенных регуляторов организма или близких их аналогов. В первую очередь внимание исследователей привлекают регуляторные пептиды (РП). Открытые еще в прошлом веке, они являются, как сейчас становится понятным, прямыми или опосредованными универсальными регуляторами всех физиологических процессов протекающих в живом организме. Общепринятым является представление о так называемом функциональном континууме РП [4,185,186]. Согласно этой концепции физиологическая функция модулируется достаточно большим количеством РП, как родственных по структуре, так и относящихся к разным семействам; в то же время каждый РП способен модулировать очень большой, хотя и вполне определенный спектр функций. Трактовка эффектов РП осложняется обстоятельством, что, кроме прямого действия, многие из них оказывают влияние на синтез других РП. При этом каждый РП сохраняет свою "индивидуальность", обладая в целом уникальным спектром биоактивности.
Все эти особенности системы РП позволяют выделить два принципиально важных направления реализации их лечебно-профилактического потенциала при коррекции различных патологий ЦНС, Во-первых, использование наиболее рациональных комплексов РП, сложившихся в процессе эволюции живых существ. Во-вторых, наиболее полное раскрытие и адекватное использование спектров активности каждого РП. Кроме исследования спектров активности РП, избранных для практической реализации, необходимо преодоление такого свойства большинства из них. как быстрота их распада во внутренних средах организма. Это требует создания стабилизированных аналогов соответствующих РП, либо создания пептидомиметиков (близких по действию непептидных соединений) [20].
Одним из интересных и перспективных РП являются пептиды семейства меланокортинов, которые включают N-концевые фрагменты адренокортикотроппого гормона, альфа-, бета-, гамма- меланоцитстимулирующие гормоны (МСГ) и их синтетические аналоги. Изучение функций этих пептидов выявило наличие у них способности модулировать такие процессы ЦНС как обучение, формирование памяти, внимание, а также различные формы поведения [93]. Кроме того, данные пептиды проявляют нейропротекторные и нейрорегенеративные активности как в центральной, так и в периферической нервной системе [45]. Таким образом, меланокортины проявляют комплекс ноотропных и иейротрофических свойств, что в совокупности со способностью некоторых из них проникать через гематоэнцефалический барьер делает данное пептидное семейство перспективным с точки зрения их медицинского применения.
Единственный клинически применяемый в настоящее время синтетический представитель семейства меланокортинов, Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), разработанный в Институте молекулярной генетики РАН В.Н. Незавибатько с сотр. [22,23] также проявляет аналогичный комплекс свойств. Исследование активности Семакса в экспериментах на животных выявило его способность стимулировать процессы обучения, внимания и запоминания, что нашло в дальнейшем подтверждение в клинических испытаниях Семакса, подтвердивших его способность стимулировать эти процессы и у человека. Клиническое применение Семакса («Семакс-0,1% раствор») выявило его эффективность при лечении травм мозга, расстройств внимания и обучения и ряда других заболеваний ЦНС различного происхождения [3].
Несмотря на имеющиеся сведения о иейротрофических свойствах меланокортинов и характеристике их рецепторов, механизмы их действия во многом остаются неясными [35,162,320]. Поэтому в настоящей работе основное внимание было уделено следующим аспектам:
1. Исследованию молекулярно-генетических механизмов действия аналогов меланокортинов (на примере пептида Семакс) на клетки ЦНС млекопитающих с целью создания на их основе фармакологических препаратов с нейропротекторной активностью, которые могут быть использованы для лечения инсультов и других нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Особое внимание было уделено взаимосвязи между эффектами меланокортинов и изменениями в уровне экспрессии генов ряда нейротрофических факторов: NGF (фактор роста нервов), BDNF (нейротрофический фактор, выделенный из мозга) в клетках ЦНС,
2. Созданию на основе как первичных клеточных культур, полученных из мозга млекопитающих, так и генетически модифицированных эукариотических клеток, модельных систем для скрининга соединений с потенциальной нейропротекторной активностью, представляющих фармакологический интерес.
Следует отметить, что эксперименты in vitro являются необходимой стадией в процессе создания лекарственных соединений и позволяют тестировать гораздо большее количество соединений, чем при проведении экспериментов непосредственно на животных сразу на первых стадиях создания препаратов. Использование генетически измененных или трансфицированных клеточных культур представляет собой удобную и весьма ценную модель как для изучения функций отдельных генов в клетке, так и в качестве систем, моделирующих различные заболевания человека in vitro. В настоящей работе представлены данные по созданию клеточной модели, имеющей отношение к процессам нейродегенерации, протекающей в мозге при развитии болезни Альцгеймера, с использованием нормального и мутантного гена пресенилина-1 (ps-Г) человека [293]. С мутациями в этом гене связывают возникновение существенной части случаев ранней семейной (наследственной) формы болезни Альцгеймера [40,293].
Актуальность настоящей работы связана с отсутствием в мировой клинической практике стандартизованных препаратов пептидной природы, способных предотвращать гибель нервных клеток (в частности нейронов различной ергичности) [133]. Кроме того, на наш взгляд, понимание молекулярных механизмов действия Семакса. как представителя семейства меланокортинов, а также разработка клеточных моделей для широкомасштабного скрининга соединений с потенциальной нейропротекторной активностью, не только расширит спектр его возможного применения в клинической практике, но и приведет в перспективе к созданию других эффективных нейропротекторов.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Цели:
Исследовать молекулярно-генетические механизмы действия аналогов меланокортинов (на примере пептида Семакс) на клетки ЦНС млекопитающих с целью создания на их основе фармакологических препаратов с нейропротекторной активностью.
На основе первичных культур клеток нервной системы, а также генетически модифицированных клеточных линий создать клеточные модели, позволяющие оценивать и отбирать соединения с целью последующего их использования для фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний нервной системы, таких как инсульты, болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.
Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:
Изучить способность Семакса и других представителей семейства меланокортинов предотвращать гибель нейронов различной ергичности в первичных культурах, полученных из мозга крысы.
Исследовать возможность существования специфических центров связывания Семакса на плазматических мембранах, полученных из мозга крысы, и изучить основные характеристики его связывания.
Изучить способность Семакса стимулировать в клетках ЦНС экспрессию ряда иейротрофинов как на уровне мРНК, так и белка, как промежуточной стадии его нейропротекторного действия.
Исследовать возможность участия митоген-активируемых протеинкиназ (МАР- киназ) и гена быстрого ответа c-fos в механизме передачи сигнала от Семакса внутрь клетки.
Создать клеточную модель, основанную на использовании первичных культур нервных и глиальных клеток, которая позволяет проводить отбор соединений с нейропротекторной активностью, представляющих фармакологический интерес.
Оценить нейропротекторные свойства Семакса in vitro в модельных системах: а) в системе индуцированной с помощью 6-гидроксидофамииа (6-ГДА) цитотоксичности в первичных клеточных культурах; б) в культуре клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12, трансфицированных нормальным и мутантным геном пресенилина-1 человека, принимающим участие в патогенезе ранней семейной формы болезни Альцгеймера.
На основе полученных результатов разработать рекомендации по проведению предклинических и клинических исследований пептида Семакс с целью создания на его основе лекарственного препарата с нейропротекторным действием.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
В рамках настоящей работы разработан новый молекулярно-генетический подход к пептидной фармакотерапии ряда нейродегенеративных заболеваний.
Открыта способность эндогенных пептидов семейства меланокортинов и их аналога Семакса регулировать экспрессию генов нейротрофических факторов в
ЦНС. Создано научное направление по разработке и созданию пептидных нейр о пр оте ктор о в, предназначенных для лечения таких нейродегенеративных заболеваний, как инсульты, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.
Впервые доказано существование специфических центров связывания для Семакса па плазматических мембранах базальных ядер переднего мозга крысы и получены характеристики его связывания. Изучена его биодеградация в присутствии плазматических мембран, первичных культур клеток нейронов и глии, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы. Установлено влияние Семакса на выживаемость холинергических и дофаминергических нейронов, полученных из эмбрионального мозга крысы, при отсутствии его эффекта на жизнеспособность ГАМК-ергических нейронов. Впервые выявлено стимулирующее влияние Семакса на экспрессию мРНК для нейротрофинов: BDNF и NGF в первичных глиальных культурах, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы. Установлено проникновение Семакса в мозг крысы при интраназальном введении и обнаружено его влияние в ряде отделов мозга на экспрессию BDNF и его рецепторов как на уровне мРНК, так и белка, что указывает на отделоспецифичность действия этого пептида. Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что регуляция экспрессии нейротрофинов и/или их рецепторов в клетках мозга является одним из этапов нейропротекторной) действия меланокортинов и их аналогов. Установлена вовлеченность МАР-киназ и гена быстрого ответа c-fos в механизм передачи сигнала от Семакса внутрь клетки. Выявлены нейропротекторные свойства Семакса in vitro в двух модельных системах: а) в системе индуцированной с помощью 6-ГДА цитотоксичности в первичных клеточных культурах; б) в культуре клеток феохромоцитомы крысы линии РС125 трансфицированных нормальным и мутантным геном пресенилина-1 человека, принимающим участие в патогенезе ранней семейной формы болезни Альцгеймера, В совокупности, полученные данные расширяют наши представления о молекулярных механизмах действия представителей пептидного семейства меланокортинов и их функциях в ЦНС.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Разработанные и использованные клеточные модели рекомендованы для скрининга фармакологических препаратов с потенциальной нейропротекторной активностью. Полученные в настоящей работе результаты обосновывают перспективность использования системы нейротрофинов и их рецепторов в качестве мишени для поиска лекарственных препаратов с нейропротекторной активностью. На основе результатов выполненного исследования создан оригинальный отечественный лекарственный препарат «Семакс капли назальные 1%» (Патент N 2124365 «Способ лечения ишемического инсульта»), предназначенный для лечения острого периода ишемического инсульта и утвержденный к применению Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения РФ 29 марта 2001 года, протокол № 5. Обнаруженные нейропротекторные свойства Семакса позволили рекомендовать его при лечении таких нейродегенеративных заболеваний как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Основные положения работы были представлены на Российских и международных научных конференциях, симпозиумах, съездах, в том числе:
International Symposium "Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds" (Квебек, Канада, 1991), Society for Neuroscience USA Meeting (США, 1995, 1997), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт- Петербург, 2001), VIII-ом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), European Society for Neurochemistry Conference on "Advances in molecular mechanisms of neurological disorders" (Перуджа, Италия, 2001), Российском съезде биохимиков и молекулярных биологов (Санкт- Петербург, 2002), Международном симпозиуме "Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals" (Москва, 2003), International Symposium "Neurodegeneration and Neurorepair" (Магдебург, Германия, 2003), Russian-German Symposium "Chemistry and Biology of Peptides" (Фридрихрода, Германия, 2003) Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт- Петербург, 2005), Conference of International Society for Neurochemistry "Changes in Neuronal Gene Expression and CNS Drug Responce" (Авиньон, Франция, 2004) и ряде других. В завершенном виде результаты диссертационной работы были представлены на заседаниях Ученого совета ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова (сентябрь 2005 г.) и Ученого совета Института молекулярной генетики РАН (декабрь 2005 г.)
Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН. В работе принимали участие коллеги из Медицинской школы Р.В. Джонсона (Пискатавей, США), Университета Ульма (Ульм, Германия), Университета Лейпцига (Лейпциг, Германия), Кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова, Центра психического здоровья РАМН. Вклад отечественных и зарубежных коллег отражен в публикациях по теме диссертации. Автор выражает благодарность всем коллегам, принимавшим участие в выполнении работы и в обсуждении ее результатов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований, Министерства образования и пауки РФ, ИНТАС, Фонда Макдонелла (США) и Фонда ДААД (Германия),
ПУБЛИКАЦИИ
По материалам диссертации опубликовано 37 статей, 25 тезисов в материалах российских и международных конференций; получено 3 патента, СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 243 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и 48 рисунков. Библиография включает 350 наименований.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Некоторые проблемы создания лекарственных препаратов на основе пептидов
Пептиды представляют собой уникальные эндогенные регуляторы большинства функций организма. Некоторые из их общих свойств представлены на рис. 1.
Действие в низких концентрациях (0.01 нМ -100 нМ).
Специфичность действия.
Незначительное время жизни.
Рис. 1. Уникальные свойства регуляторных пептидов.
Однако создание лекарственных препаратов на их основе связано и с определенными трудностями и проблемами, которые суммированы на рис. 2.
Множественность пептидов и неоднозначность физиологических эффектов отдельных пептидов.
Протеолиз пептидов (кратковременное время жизни).
Многообразие механизмов действия.
Рис. 2. Проблемы создания лекарственных препаратов на основе регуляторных пептидов.
Поэтому неудивительно, что количество лекарственных препаратов на основе пептидов в настоящее время невелико. Мы суммировали примеры таких препаратов в табл. 1.
Таблица 1. Некоторые пептиды, используемые в медицинской практике.
Как видно из этой таблицы, значительное количество этих препаратов представляет собой гормоны. Не претендуя на полноту картины, следует отметить, что лекарственные препараты на основе пептидов составляют мизерную часть от всего количества лекарств, используемых в настоящее время в практической медицине. Кроме того, к началу настоящей работы в мировой практике не существовало препаратов с нейропротекторными свойствами на основе регуляторных пептидов. Применяемый в настоящее время для лечения инсультов и других нейродегенеративных заболеваний препарат церебролизнн нельзя рассматривать как строго стандартизованный препарат, так как он представляет собой смесь пептидов и других низкомолекулярных соединений [7,25]. Следует отметить, что в последние годы исследования по созданию нейропротекторов на основе пептидов интенсивно развиваются как в нашей стране, так и за рубежом [1,6,20,21,132,133]. При этом основное внимание уделяется коротким пептидам (до 10 а.о.) и их аналогам, что связано, во-первых, с относительной дешевизной их синтеза, а, во-вторых, с более легким проникновением их в мозг при различных способах введения. В дальнейшем мы обратимся к описанию свойств пептидного семейства меланокортинов, один из аналогов которых был использован в работе для создания нового лекарственного препарата с нейропротекторными свойствами.
Меланокортины и их аналоги, функции в ЦНС
Пептидное семейство меланокортинов
Меланокортины являются семейством нейропептидов, принадлежащим к группе так называемых стрессовых пептидов, продуцирующихся с помощью протеолиза из молекулы-предшественника проопиомеланокортипа (ПОМК) [93].
ПОМК является источником нескольких интересных семейств нейропептидов (рис.
3) среди которых выделяются эндогенные опиоиды (а-, Р-, у-эндорфины) и семейство пептидов, в которое входят а-, [3- и у-меланоцитстимулирующие гормоны. В свою очередь, N-концевые фрагменты АКТГ, представляющие первые 13 аминокислот последовательности АКТГ, лишены способности стимулировать адренокортикальную секрецию. Последовательность АКТГ(1-13) соответствует а-меланоцитстимулирующему гормону (а -МСГ), структура которого идентична для всех позвоночных, в отличие от (5- и у-МСГ. Пептиды с аминокислотными последовательностями, входящими в последовательности а-МСГ, Р -МСГ, у-МСГ получили название меланокортины, или МСГ-пептиды [35,93].
Рис. 3. Схема процессинга проопиомеланокортина.
К меланокортинам [45,162,163] часто относят и их аналоги, содержащие замены в природной аминокислотной последовательности, модифицированные и D-аминокислоты, в связи с чем представляется справедливым включение в это семейство и пептида Семакс. Наиболее длинный представитель меланокортинов - а-МСГ (13 а.о.) - изначально был известен как соединение, стимулирующее синтез меланинов и увеличение размеров и количества пигментных клеток в кожных покровах [35,162]. Следует отметить, что короткие представители меланокортинов, включая их аналоги, лишены не только способности стимулировать адренокортикальную секрецию, но и пигмент-стимулирующей способности, то есть активности этих пептидов большей частью проявляются в отношении нервной системы. Тем не менее, исторически сложившееся название меланокортины будет употребляться и далее для обозначения семейства пептидов с аминокислотными последовательностями, родственными N-концевым фрагментам АКТГ (рис. 4). Минимальным эндогенным меланокортином, обладающим физиологической активностью, считается пептид АКТГ(4-10). а-МСГ Ser Туг Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val
АКТЦ4-10) Met Glu His Phe Arg Trp Gly
АКТЦ4-7) Met Glu His Phe Org 2766 02Met Glu His PheD-Lys Phe BIM-22015 D-Ala Gin Tyr Phe Arg Trp Gly
Семакс Met Glu His Phe Pro Gly Pro
Рис. 4. Структура меланокортинов и некоторых их аналогов.
Меланокортины как нейропептиды
Начиная с 50-60-х годов прошлого века, благодаря работам де Вида (D. de Wied) началось интенсивное изучение нейроактивных свойств меланокортинов [91- 93]. В 1950-60-х годах было показано, что АКТГ обладает не только к тому времени хорошо изученными эндокринными эффектами, но и способностью влиять на разные формы поведения животных [91]. Так, было продемонстрировано, что введение АКТГ может снимать чувство беспокойства [223], влияет на запоминание [231] и вызывает ряд других поведенческих реакций у животных. Влияние на поведение было затем показано и для а-МСГ [59] и для более коротких меланокортинов. С другой стороны, в дальнейшем было обнаружено, что и ПОМК, и АКТГ, и фрагменты АКТГ (в том числе и а-МСГ) иммунохимически детектируются в мозге [249]. Более того, было обнаружено присутствие мРНК для проопиомеланокортина в ряде отделов мозга [123]. Эти данные позволили придти к выводу, что АКТГ и меланокортины являются эндогенными по отношению к мозгу соединениями, и центральная нервная система не только служит мишенью для этих пептидов, но и может сама продуцировать их.
Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих. Проблема места синтеза меланокортинов. Нормальный и поврежденный мозг
Иммунохимическая локализация меланокортинов в основном проводилась с использованием антител к а-МСГ и АКТГ(4-10). Присутствие а-МСГ было обнаружено в мозге взрослой крысы, причем концентрации этого пептида в разных отделах мозга существенно различались [108]. Наибольшая концентрация а-МСГ обнаружена в гипоталамусе, а в пределах гипоталамуса - в аркуатном ядре. В остальных отделах мозга концентрация а-МСГ была на 1-2 порядка ниже (Таблица 1). Эксперименты на тканевых культурах показали, что нейроны аркуатного ядра синтезируют ПОМК [205]. Учитывая, что отростки нейронов аркуатного ядра гипоталамуса проникают в другие отделы мозга, можно предположить, что источником а-МСГ для них служит именно аркуатное ядро. Действительно, разрушение аркуатного ядра приводит к существенному снижению уровня а-МСГ в остальных отделах мозга, С другой стороны, при удалении гипофиза происходит снижение уровня а-МСГ в гипоталамусе [70].
Таблица 2. Уровень а-МСГ в различных отделах мозга крысы [108].
Таким образом, по-видимому, источником части а-МСГ в мозге служит гипофиз; можно также предположить и влияние гипофиза на процессы синтеза а- МСГ в гипоталамусе. В пользу предположения о регуляции гипофизом синтеза в гипоталамусе предшественника меланокортинов недавно были получены дополнительные свидетельства - удаление части ПОМК-синтезиругощих клеток гипофиза мыши приводило к увеличению уровня мРНК для ПОМК в гипоталамусе [350]. Другим источником служит аркуатное ядро, что не исключает возможности синтеза а-МСГ (и других меланокортинов) в остальных отделах мозга. Так мРНК для ПОМК была обнаружена в гиппокампе и миндалине [123], сам ПОМК был обнаружен не только в аркуатном ядре, но и в дорсолатеральном гипоталамусе и среднем мозге [319]. В ходе эмбрионального развития ПОМК детектируется в гипоталамических нейронах эмбриона крысы, начиная со срока 12 дней, в то время как в гипофизе иммунореактивность к ПОМК регистрируется, лишь начиная с 1516-го дня эмбрионального развития (Е15-16). Наибольший уровень иммунореактивности к ПОМК отмечается на 21-29 день постнатального развития [182]. Проводилось также исследование экспрессии ПОМК при развитии эмбрионов мыши [101]. Впервые ПОМК появляется в аркуатном ядре на сроке 10,5 дней развития эмбриона. В этот же срок ПОМК детектируется в нервных волокнах латерального и дорсального диэнцефалона. К сроку 11,5 дней развивается плотная сеть ПОМК-содержащих нейритов, проникающая в мезэнцефалон. К этому же сроку ПОМК-содержащие нейриты обнаруживаются в миелэнцефалоне. К 12,5 дням ПОМК-содержащие волокна появляются в спинном мозге. Между 13,5 и 15,5 днями формируется профиль ПОМК-содержащих волокон, распространяющихся в диэнцефалон, мезэнцефалон, метэнцефалон и миелэнцефалон, соответствующий взрослому состоянию, Следует отметить, что ПОМК-содержащие клетки в гипофизе появляются позже, чем в аркуатном ядре (к 12,5 дню в передней доле и к 14,5 дшо в промежуточной доле). Имеются данные о том, что в мозге эмбрионов мыши процессинг ПОМК с образованием а-МСГ начинается со срока 11,5 дней развития [267],
В мозге человека наибольшая концентрация а-МСГ была также обнаружена в гипоталамусе, а в наибольшем количестве а-МСГ присутствует в черной субстанции. Интересно, что у больных болезнью Альцгеймера концентрация этого пептида в черной субстанции существенно снижена [46]. Объяснения этому феномену пока не предложено. АКТД4-10) был иммунохимически обнаружен в мозге взрослой крысы только в волокнах аркуатного ядра и средней септальной области. Совершенно иная ситуация с распределением АКТГ(4-10) возникает при исследовании неонатального (то есть развивающегося) мозга: в нем АКТГ(4-10) обнаруживался как в аркуатиом ядре и средней септальной области, так и в стриатуме, коре, гиппокампе, перивентрикулярной области. При повреждении черной субстанции взрослой крысы АКТГ(4-10) обнаруживался в стриатуме и ряде других отделов мозга [45], Вопрос о происхождении АКТГ(4-10) практически не освещен в доступной литературе; в некоторых работах постулируется его протеолитическое выщепление из а-МСГ, на что указывает и похожее распределение этих пептидов в мозге [162].
Таким образом, из данных по экспрессии АКТГ(4-10) в мозге крысы следует, что, по-видимому, значение этого меланокортина в функционировании взрослого мозга весьма ограничено. Значительно более широкое распространение АКТГ(4- 10) в неонатальном мозге свидетельствует о его роли в развитии ЦНС, а появление АКТГ(4-10) в отделах поврежденного мозга (по крайней мере, в рамках нигростриатной системы мозга) указывает на вероятное участие АКТГ(4-10) в процессах регенерации ЦНС.
Общие трофические свойства меланокортинов
Наряду с изучением поведенческих и мнестических (ноотропных) эффектов меланокортинов происходило накопление данных о трофических эффектах меланокортинов. Так, было показано, что а-МСГ увеличивает вес эмбрионов, в то же время введение антител к этому пептиду ингибирует рост эмбриона и его мозга [122]. Подобные эффекты не наблюдались в случае постнатального развития. Таким образом, а-МСГ проявляет общие трофические свойства лишь на стадии эмбрионального развития организма. Другие исследованные меланокортины: АКТГ(4-10) и Org 2766, не обладают столь глобальными трофическими активностями [122],
Влияние меланокортинов на нейроны ЦНС
Большую ценность для изучения нейротрофических активностей представляют исследования на моделях in vitro. На этих моделях были получены данные о влиянии меланокортинов на нейроны. Так, а-МСГ усиливает рост нейритов (примерно в 2 раза) и выживание нейронов в культуре нейронов спинного мозга крысы (14-й день развития) [257]. Аналогичные исследования на культуре срезов спинного мозга выявили 30-40-процентное дозозависимое влияние а-МСГ и АКТГ(4-10) на рост нейритов при концентрациях 10"12 - 10"11 М [321]. С использованием диссоциированных культур нейронов спинного мозга эмбрионов крысы было показано влияние а-МСГ (но не АКТГ(4-10) и Org 2776) на появление и рост нейритов при концентрациях выше 10"ш М и максимальным эффектом при 10"4 М [322]. Отмечено влияние меланокортинов, в том числе и их синтетических аналогов, на дифференцировку серотонинергических нейронов [52]. Меланокортины (а-МСГ) также способны влиять на дифференцировку дофамин ер гических нейронов и рост их нейритов [100].
Ноотропные и нейропротекторные эффекты меланокортинов
Открытие и клонирование пяти различных подтипов меланокортиновых рецепторов (MC-R1 - MC-R5) (табл. 3) открыло новые возможности для разработки лекарств, которые могли бы быть использованы для лечения процессов воспаления, ожирения, анорексии, наркотической зависимости, половых дисфункций, нарушений памяти и др. Большинство соединений, мишенями для которых служат МС-рецепторы, являются аналогами а-МСГ. Считается, что только некоторые из этих веществ могут найти применение в клинике, что связано с их низкой биодоступностыо при периферических способах введения [332].
Таблица 3. Меланокортиновые рецепторы (MC-R)
Локализация
Рецептор Количество а.о.
Участие в Связываемый метаболизме меланокортин
315 (317)а. о. Меланома (мозг, гипофиз, семенники)
297 а.о. Надпочечники (жировая ткань, кожа)
323 (361) Мозг, (желудок, а. о. поджелудоч-ная железа, плацента)
333 а.о. Мозг
325 а.о. Мозг, кожа, MC-R1 MC-R2 MC-R3 MC-R4 MC-R5 мышцы, селезенка, яичники, семенники, надпочечники
Пигментация а-МСГ кожи, воспаление ^ - 0,12 нМ
Стероидогенез АКТГ ^-0,1 нМ ? а-, Р-, у-МСГ, (нейропротекция, К(/ -7-13 нМ регенерация)
Потребление а-, р-МСГ, пищи (вес тела), ^_70.380 нМ болевая чувствительность, (нейропротекция?) ? а-, р-МСГ,
Регенерация ,-10-70 нМ мышц и нервов (нейропротекция?)
В табл. 3 представлены некоторые характеристики 5 подтипов этих рецепторов. Гомология внутри семейства от 40 до 70% по аминокислотной последовательности. Рецепторы связаны с G- белками. Вторичные мессенджеры через которые осуществляют свое действие меланокортины: DAG/ITP (Са2т), сАМР [162,163]. Как видно из табл. 3, три подтипа MC-R (MC-R3, MC-R4, MC-R5,) экспрессируются преимущественно в мозге млекопитающих. Именно с этими рецепторами связывают нейротрофическое и нейропротекторное действие меланокортинов, хотя до конца ясности в этом вопросе нет.
Механизмы ноотропных эффектов меланокортинов до настоящего времени окончательно не выяснены; вероятно, они не опосредованы через известные к настоящему времени типы МС-рецепторов. Предполагается также, что ноотропные и нейропротекторные эффекты меланокортинов могут быть связаны с их воздействием на МС-рецепторы неизвестного типа, либо с их модулирующим влиянием на различные медиаторные системы мозга [35].
Изучение нейротропной активности фрагментов АКТГ. проведенные как в нашей стране, так и за рубежом, позволили выявить зависимость эффектов пептидов от их структуры, дозы и времени введения. На основании проведенных экспериментов были сделаны следующие заключения, которые суммированы ниже.
Фрагменты АКТГ(4-7), (5-10) и (4-10) ускоряют выработку условных рефлексов у экспериментальных животных. АКТГ(5-7) не оказывает влияния на обучение животных. Наиболее активным из исследованных пептидов оказался АКТГ(4-10).
Наименьшим фрагментом АКТГ, сохраняющим поведенческую активность, является АКТГ(4-7).
Ускорение обучения животных под действием фрагментов АКТГ зависит от дозы и эта зависимость имеет колоколообразный характер.
Эффекты фрагментов АКТГ весьма кратковременны и их длительность ограничивается приблизительно 10-30 мин.
Для пролонгирования действия фрагментов АКТГ бессмысленно увеличивать количество вводимого пептида, так как это приводит к исчезновению эффекта.
Исследования на добровольцах показали, что введение АКТГ(4-10) приводит к повышению селективного внимания [280]. Положительный эффект- пептидов был более выражен в том случае, когда в опытах участвовали люди с исходно плохой памятью или пожилые люди с ослабленными познавательными способностями.
Таким образом, многочисленные эксперименты показали принципиальную возможность создания на базе фрагментов АКТГ ноотропных препаратов, однако для разработки лекарственных средств на их основе необходимо было найти способ пролонгации их эффектов.
Первые попытки создания лекарств на основе фрагментов АКТГ относятся к началу 1970-х годов. Существует несколько путей для увеличения эффективности длительности действия регуляторных пептидов (табл 4).
Один из них - замена природных левовращающих L-аминокислот в молекуле пептида на правовращающие D-аминокислотные остатки или на остатки неприродных аминокислот с целью повышения устойчивости пептидов к действию протеаз. Так, замена Met4 в последовательности АКТГ(4-9) на сульфоксид метионина, Arg8 на D-Lys, а Тгр9 на Phe привела к разработке нового пептида ORG 2766, который во много раз более активен, чем АКТГ(4-10) в тесте на угашение реакции избегания, причем направленность действия этого пептида на сохранение навыка зависит от дозы - введение малых доз (0,5-1,0 нг/кг) улучшает, а больших доз (от 5 нг/кг) ухудшает сохранение навыка [111]. Препарат ORG 2766 не проявляет меланоцитстимулирующей и стероидогенной активности, не приводит к мобилизации липидов из жирового депо и не обладает опиоидной активностью. Также показано мощное нейропротекторное действие ORG 2766 после токсического воздействия 6-ГДА на черную субстанцию мозга, ORG 2766 способен оказывать положительный эффект на регенерацию периферических нервных волокон у крыс [122].
Таблица 4. Пути модификации регуляторных пептидов
Ряд структурных изменений, в том числе замена С-концевой СООН-группы, позволил получить два новых аналога фрагментов АКТГ - НОЕ 427 и ORG 31433, которые оказались в 10-100 раз мощнее, чем ORG 2766. В малых дозах эти пептиды облегчают выработку условных рефлексов, в больших - затормаживают процесс выработки навыка. ORG 31433 существенно ускоряет функциональное восстановление nucleus accumbens после его повреждения 6-ГДА [335]. НОЕ 427 более устойчив к действию протеаз, чем ORG 2766, обладает большей липофильностью и, вероятно, поэтому более эффективен по сравнению с другими синтетическими аналогами при исследовании формирования памяти и способности к обучению. Этот пептид при подкожном введении ликвидирует у крыс амнезию, вызванную электрошоком, улучшает обучение и память в различных тестах и восстанавливает память, нарушенную скополамином [159]. Введение НОЕ 427 людям пожилого возраста с нарушением когнитивных функций, а также пациентам с болезнью Альцгеймера оказывало небольшое, но достоверное положительное влияние на внимание и настроение больных [296].
Был синтезирован и исследован еще один аналог АКТГ(4-10) - BIM-22015. Изучение влияния этого пептида на фоне повреждения фронтальной коры показало, что животные, получавшие BIM-22015 в течение 20 дней после операции, не отличались по уровню обучаемости от ложиооперированных в тесте водный лабиринт. Также исследовались долговременные эффекты хронического введения BIM-22015, когда инъекции препарата прекращали за 30 дней до начала обучения. И в этом случае BIM-22015 оказывал нормализующее действие на оперированных животных [50].
Ноотропные и нейропротекторные эффекты Семакса
В Институте молекулярной генетики РАН был синтезирован пептид, имеющий структуру Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro. Эта последовательность получила название "Семакс" (семь аминокислот). Были проведены подробные исследования влияния Семакса на функции ЦНС животных, определены оптимальные дозы и сроки введения препарата, эффективность Семакса при различных способах введения, его влияние на обучение животных в тестах с различным знаком подкрепляющего раздражителя [3,22,23,49].
Проведено изучение влияния Семакса на выработку пищедобывательного рефлекса на место в Т-образном лабиринте и сравнение эффектов этого пептида с эффектами фрагмента АКТГ(4-10). Было показано, что внутрибрюшинное введение Семакса в дозе 0,015 мг/кг за 5 мин до и сразу после сеанса обучения ускоряет выработку рефлекса так же, как и в случае с АКТГ(4-10). Ежедневное введение Семакса за 1 ч до сеанса обучения также значимо ускоряло процесс выработки навыка, в то время как инъекция АКТГ(4-10) за 1 ч до сеанса обучения была неэффективна. Более того, введение Семакса в дозе 0,05 мг/кг за 20 ч до сеанса обучения также достоверно ускоряло процесс формирования пищедобывательного навыка в Т-образном лабиринте [49]. Изучение влияния различных доз Семакса на обучение животных в Т-образном лабиринте показало, что введение препарата в дозах 0,015; 0,05 и 0,1 мг/кг за 5 минут до сеанса обучения значимо ускоряет обучение животных в этом тесте. Снижение дозы препарат до 0,005 мг/кг приводило к исчезновению эффекта, Следовательно, увеличение дозы препарата не приводит к реверсии его эффектов в отличие от таких аналогов фрагментов АКТГ, как ORG 31433 и НОЕ 427.
Было изучено влияние Семакса на обучение животных в тесте с отрицательным подкреплением, В качестве модели такого обучения использовался тест выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Исследование влияния Семакса на выработку УРПИ показало, что введение пептида в дозе 0,015 мг/кг как за 1, так и за 6 часов до сеанса обучения улучшает обучение животных в этом тесте. Следовательно, влияние Семакса на выработку условных рефлексов не зависит от знака подкрепляющего раздражителя [49].
Было исследовано влияние Семакса на сохранение навыка пассивного избегания у крыс после электрошока. Семакс вводили перед проверкой сохранения навыка в дозе 0,05 мг/кг. В группе животных, которым вводили Семакс и не подвергали электрошоку, наблюдалось значимое снижение времени пребывания в затемненном отсеке экспериментальной камеры (в котором крысы получали болевое раздражение во время обучения) по сравнению с контрольной группой. Электрошок вызывал угасание ранее выработанного навыка пассивного избегания у контрольных животных. Инъекция Семакса перед проверкой сохранения рефлекса животным, перенесшим электрошок, приводила к частичному восстановлению навыка, т.е. ослабляла амнезию, вызванную электрошоком [3,49].
Было проведено изучение эффективности интраназального способа введения Семакса в организм. Показано, что ежедневное интраназальное введение пептида в дозе 0.015 мг/кг за 5 минут до сеанса обучения белых крыс в Т-образном лабиринте достоверно ускоряет выработку условного пищедобывательного рефлекса на место. Следовательно, при интраназальном введении Семакс был также эффективен, как и при внутрибрюшиниом. Это послужило основанием для рекомендации интраназального способа введения Семакса людям [3,49].
Было изучено наличие у Семакса антигипоксических свойств. В первой серии опытов проводилось исследование влияния Семакса на устойчивость животных к условиям гипобарической гипоксии. Эксперименты показали, что однократное внутрибрюшинное введение Семакса в дозе ОД мкг/кг в 2,5 раза повышает время до остановки дыхания у животных в условиях гипоксии. При хроническом введении пептида (интраназально в течение 7 дней в дозе 0,1 мкг/кг) антигипоксические эффекты Семакса были более выражены - у животных опытной группы в условиях гипоксии наблюдалось увеличение времени до потери позы (в 1,5 раза) и времени до остановки дыхания (в 3 раза) по сравнению с контрольными животными [3,49].
Целью следующей серии экспериментов явилось исследование влияния Семакса на устойчивость крыс к циркуляторной гипоксии. В экспериментах была использована методика двусторонней окклюзии общих сонных артерий. С использованием этой методики было показано, что инъекция Семакса (внутрибрюшинно в дозе 0.1 мг/кг) значимо увеличивает общую устойчивость крыс к циркуляторной гипоксии - процент животных с незначительными неврологическими нарушениями был значимо выше в опытной группе (27%), чем в контроле (6%) [33]. Таким образом, можно заключить, что введение Семакса способствует уменьшению тяжести клинических проявлений циркуляторной гипоксии,
Проводилась оценка влияния Семакса на постреанимационные нарушения памяти в эксперименте на крысах. Моделью клинической смерти являлась внезапная остановка общего кровообращения при пережатии сосудистого пучка сердца. Эксперименты показали, что ежедневное интраназальное введение Семакса в дозе 0,05 мг/кг в течение 2 недель нормализовало параметры поведения реанимированных крыс, приближая их значение к контролю. Следовательно, Семакс при интраназальном введении оказывает нормализующее действие на восстановление мнестических функций мозга в постреанимационном периоде [3,20,49].
Сравнительное исследование устойчивости Семакса и нативного АКТГ(4-10) к действию протеаз сыворотки крови человека показало, что первичным актом деградации в обоих случаях является отщепление N-концевого метионина аминопептидазой [261]. Но если природный фрагмент довольно быстро деградирует далее до отдельных аминокислот, то Семакс образует достаточно стабильный интермедиат со структурой Glu-ITis-Phe-Pro-Gly-Pro, который и сам проявляет нейротропную активность того же спектра, что и Семакс [19]. Было проведено сравнительное исследование ноотропной активности продуктов ферментативной деградации АКТГ(4-10) и Семакса - Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, His- PhePro-Gly-Pro и Phe-Pro-Gly-Pro [19]. Проведенное исследование поведенческих эффектов аналогов АКТЦ4-10) и Семакса с отщепленным N-концевым метионином показало, что АКТГ(5-10) и Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro обладают нейротропной активностью. Однако, если в природном фрагменте отщепление метионина приводит к резкому падению активности, то образующийся при деградации Семакса гексапептид улучшает обучение животных даже несколько эффективнее, чем Семакс. На основании проведенного исследования было сделано заключение о том, что продукты ферментативной деградации АКТГ(4-10) и Семакса обладают собственной нейротропной активностью и являются сииергнетами АКТГ(4-10) в отношении воздействия на процессы обучения. Следовательно, наблюдаемые при введении этих пептидов эффекты могут быть результатом действия как исходного гептапептида, так и его производных. При этом высокая активность и относительная устойчивость гексапептида Glu-ITis-Phe- Pro-Gly-Pro могут в значительной степени обеспечивать длительное (более 24 ч) действие Семакса.
Многочисленные исследования нейротропной активности Семакса, проведенные на животных, позволили сделать некоторые выводы, суммированные в табл.5.
Таблица 5. Некоторые эффекты Семакса на ЦНС млекопитающих.
В связи с выдвинутой нами гипотезой об участии нейротрофинов в осуществлении действия меланокортинов, в частности Семакса, на ЦНС [10], представляется необходимым отразить в обзоре литературы существующие в настоящее время данные об этом белковом семействе, и прежде всего о наиболее интенсивно изучаемом в настоящее время его представителе - нейротрофическом факторе, выделенном из мозга (BDNF).
Нсйротрофины и их характеристика
Общая характеристика семейства нейротрофинов
Нейротрофины - семейство регуляторных белков нервной ткани, которые синтезируются нейронами, также клетками микроглии и глии, и способствуют пролиферации, дифференцировке и поддержанию жизнеспособности и функционирования периферических и центральных нейронов [195]. При этом используется аутокринный и паракринный механизмы регуляции [195,345]. Во время эмбрионального развития нейротрофины способствуют выживанию нейронов до и во время иннервации мишеней [87,251]. Они функционируют также как физиологические сигналы выживания для центральных нейронов. При развитии нервной системы с помощью нейротрофинов регулируется выживаемость нейронов, то есть в зрелой нервной системе присутствуют те нейроны, которые в процессе развития нервной системы получили нейротрофины в надлежащем количестве от соответствующих клеток-мишеней [165,173,341]. "Лишние" же нейроны удаляются по механизму программируемой клеточной гибели. Нейротрофины регулируют нейрональную дифференцировку, индуцируют ветвление дендритов (арборизацию) и рост аксонов (спрутинг) в направлении клеток-мишеней. В зрелой нервной системе нейротрофины регулируют как краткосрочную сииаптическую передачу, так и долговременное потенцирование (LTP), участвуя, таким образом, в обеспечении пластичности нервной системы, необходимой для ее нормального функционирования [63, 88,212,323,288].
Семейство нейротрофинов к настоящему времени состоит из следующих представителей: фактор роста нервов, nerve growth factor, NGF (впервые описан в 1953
Г.) [195]; нейротрофический фактор, выделенный из мозга, brain-derived neurotrophic factor, BDNP [194]; нейротрофии-3, neurotrophin-3, NT-3 [105,161,210,275]; нейротрофин-4/5, neurotrophin-4/5, NT-4/5 [149]; нейротрофин-6, neurotrophin-6, NT-6 [129]; пейротрофии-7, neurotrophin-7, NT-7 [240].
Гены, кодирующие нейротрофины, были охарактеризованы у рыб, амфибий, рептилий и млекопитающих [130,150,166]. Последовательность зрелой формы человеческого BDNF (hBDNF) аналогична последовательностям найденным у свиньи, крысы и мыши [160,276]. Зрелая форма hBDNF имеет около 50% гомологии со зрелыми человеческими NGF, NT-3 и NT-4/5.
Трехмерная структура нейротрофинов содержит две пары антипараллельных р-слоев и три дисульфидных мостика [42,219]. Вариабельные домены определяют специфичность отдельных членов семейства. Зрелые активные формы нейротрофинов представляют собой стабильные нековалентно связанные гомодимеры с молекулярной массой около 28 кДа [67,218]. Гидрофобные взаимодействия между мономерами через высококонсервативные остатки во всех иейротрофинах предполагают возможность формирования гетеродимеров [218].
Основными мишенями для NGF, первого обнаруженного нейротрофина. являются холинергические нейроны переднего мозга, играющие значительную роль в таких функциях ЦНС, как внимание, обучение, память; холинергические нейроны стриатума, вовлеченные в контроль движения [126,214,227]; большинство нейронов симпатической нервной системы [172,195].
Выявленными мишенями для BDNF являются дофаминергические нейроны черной субстанции, холинергические нейроны переднего мозга, серотонинергические нейроны коры, ГАМК-ергические нейроны стриатума, гранулярные нейроны мозжечка; мотонейроны, нейроны ресничного ганглия; нейроны спинномозговых узлов (DRG, dorsal root ganglion); периферические чувствительные нейроны [36,288].
Мишенями для NT-3 являются холинергические нейроны лобной доли, холинергические нейроны гипоталамуса, нейроны коры головного мозга, система проприорецепторов, мышечные веретена, нейроны слуховых ядер, клетки глии, для NT-4/5 - мотонейроны, нейроны ресничного ганглия, чувствительные нейроны [88].
Нейротрофины связываются с двумя различными типами рецепторов - Trk-рецепторами (рецепторы сопряженные с тирозинкииазой) и Р75-рецепторами. В свою очередь, существуют подтипы Trk-рецепторов - TrkA (наибольшая аффинность к NGF), TrkB (наибольшая аффинность к BDNF и NT-4) и TrkC (наибольшая аффинность к NT-3). При этом возможно связывание Trk-рецепторов и нейротрофинов в различных сочетаниях. В центральной нервной системе TrkA экспрессируется в основном холинергическими нейронами базальных ядер переднего мозга. Наиболее распространенным в мозге является подтип TrkB [63]. Р75-рецепторы в наибольшей степени экспрессируется во время развития ЦНС, затем уровень его экспрессии падает, но быстро возрастает при входе нейронов в апоптоз [277].
Связывание нейротрофинов с рецептором приводит к его димеризации и активации тирозинкиназного домена. Затем происходит автофосфорилирование цитоплазматического домена Trk-димера [171] и активация адаиториых молекул, запускающих ферментативные каскады ( в основном протеинкиназы), передающие сигнал в ядро.
Р75-рецепторы не обладают тирозинкиназной активностью и принадлежат к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) [271,305] и модулируют функции Trk-рецепторов, повышая аффинность TrkA к NGF [209], снижая аффинность TrkB к BDNF и NT-4/5 и при этом существенно не влияя на связывание NT-3 с TrkC [324].
Кроме того, Р75 выполняет ряд функций без участия Trk. Это такие функции, как ретроградный транспорт нейротрофинов [84], влияние на мш^рацию шванновских клеток [43], активация некоторых транскрипционных факторов, например, NF-kappa В [74]. В присутствие NGF этот рецептор способен как запускать программированную клеточную гибель, так и защищать клетки от апоптоза в разных клеточных моделях [75,117,264]. В трансгенных мышах с повышенным уровнем экспрессии р75 наблюдается значительная гибель нейронов центральной нервной системы [211]. С другой стороны, активация Trk-рецепторов может предотвращать апоптоз, вызванный активацией нейротрофином Р75- рецепторов [86]. В настоящее время можно констатировать, что рецепторы нейротрофинов образуют сложную и во многом пока не изученную систему, активация элементов которой приводит к различным и зачастую противоположным эффектам [63].
К настоящему времени получены нокаутированные по генам всех нейротрофинов мыши, что дало дополнительные данные об их роли в организме. Нокауты по генам ngf, bdnf и nt-З приводили к гибели животных в раннем постнатальном развитии [63]. В противоположность этому, нокаут по nt-4 не являлся летальным, он приводил к минимальному дефициту нейронов (сенсорных), и нокаутированные животные нормально развивались до взрослого состояния [206]. В отличие от оценки развития периферической нервной системы нокаутированных по генам нейротрофинов животных, оценка развития ЦНС оказалась более сложна; тем не менее в качестве общего вывода отмечено уменьшение количества нейронов в ряде отделов мозга [157,206].
Характеристика пейротрофина BDNF
Нейротрофин BDNF - это белок с молекулярной массой 27 кДа, исходно выделенный из мозга свиньи [194] как трофический фактор для клеток спинномозговых узлов (DRG), а позже полученный и из человеческого мозга [55]. Он обладает высокой гомологией с NGF, NT-3 и NT-4/5 [268] и влияет на разные типы нейронов ЦНС [157]. Было показано, что BDNF поддерживает рост спинальных сенсорных нейронов [55], а также выживание и рост мотонейронов, сенсорных, ганглионарных, дофаминергических, холинергических и ГАМК- ергических нейронов [157], BDNF является сигналом к дифференцировке плюрипотентных клеток нервного гребня в сенсорные нейроны [81], но не влияет на NGF-чувствительные симпатические нейроны. Так, в период раннего развития тригеминальные нейроны отвечают на действие BDNF и NT-3, а потом они переключаются и становятся зависимыми только от NGF [71]. Имеются данные, что BDNF регулирует экспрессию нейропептидов, в частности, нейропептида Y (NPY) и соматостатина [235].
Отсутствие нормально работающего гена bdnf вызывает потерю нейронов в различных отделах мозга и раннюю постнатальную гибель животных [63]. В гиппокампе нокаутных по bdnf мышей нарушено долговременное потенцирование (LTP) [187], при этом введение экзогенного белка BDNF полностью возмещает имеющийся дефицит в LTP [139,188]. Делеция одного аллеля гена bdnf вызывает нарушения обучаемости у мышей [57].
Мыши с одним функционирующим аллелем гена bdnf проявляют склонность к ожирению и, вместе с тем, для них характерна повышенная двигательная активность [180,207].
Экспрессия BDNF в нервной системе BDNF продуцируется прежде всего клетками глии головного и спинного мозга [194], а также шванновскими клетками, ассоциированными с периферическими мотонейронами [34], Методом гибридизации in situ было изучено распределение мРНК для BDNF в мозге взрослых крыс и свиней [330]. В пределах гиппокампа интенсивно меченые нейроны были найдены в области пирамидного слоя, а также гранулярного слоя и ворот зубчатой извилины. Высокая экспрессия BDNF отмечена в нейронах коры мозга, ограде (claustrum) и других зонах. В значительно меньших количествах BDNF находят в сердце, легких и тромбоцитах [276,338],
У крыс в возрасте одного месяца самый высокий уровень BDNF определяется в гиппокампе (5,41 нг/г ткани), затем следует гипоталамус (4,23 нг/г) и перегородка (1,68 нг/г). В других областях уровень BDNF колеблется от 0,9 до 1,7 нг/г. BDNF также в очень низких концентрациях обнаружен на периферии: 0,65 нг/г в селезенке, 0.21 нг/г в тимусе, 0,06 нг/г в печени [176]. По другим данным [234] в гиппокампе двухмесячных крыс определяется более 200 нг/r ткани BDNF.
Наличие BDNF показано как в цитоплазме тел нейронов, так и в дендритах [276]. Вообще в головном мозге BDNF обнаружен во многих структурах, включая кору, миндалевидный комплекс, гиппокамп, некоторые ядра таламуса и гипоталамуса, черную субстанцию и некоторые образования ствола мозга. Причем в отличие от мРНК белковый продукт также определяется в боковой перегородке, в ядре ложа терминальной полосы, медиальном преоптическом ядре, оливном предпокрышечном ядре, латеральном парагигантоклеточном ядре и задних рогах спинного мозга [343]. Эти данные указывают на наличие антероградного транспорта BDNF в определенных популяциях. В некоторых областях, наоборот, определяется только мРНК для BDNF. Так, в гиппокампе клеточные области, в которых определяется иммунореактивность BDNF, не совпадают с распределением мРНК. Как предполагается, это связано с тем, что количество белка слишком мало, чтобы зафиксировать его с помощью иммуногистохимии или же он очень быстро используется или транспортируется в другие области.
Иммуногистохимическая локализация трансмембранного белка TrkB, служащего рецептором для BDNF, показала его широкое распространение в ЦНС крысы [342]. TrkB экспрессируется на телах нейронов, на аксонах и дендритах во многих структурах, включая кору, гиппокамп, зубчатую извилину, стриатум, ядра перегородки, черную субстанцию, клетки Пуркинье мозжечка, ствол мозга, спинальные мотонейроны и чувствительные ядра ствола. Кроме того, TrkB обнаружен на субиопуляции клеток эпендимы, выстилающей желудочки мозга. Белок TrkB экспрессируется и в астроцитах, однако в укороченной форме, лишенной каталитической субъединицы [37].
Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции
Ген bdnf (рис. 5) [310] состоит из четырех коротких 5'-некодирую щих экзонов (I-
IV), каждый из которых содержит отдельный промотор, и одного З'-концевого экзона (экзои V), кодирующего белок BDNF. Кроме того, каждый из четырех вариантов, полученных в результате альтернативного сплайсинга, подвергается полиаденилированию по одному из двух сайтов, расположенных в 3' области экзона V, Таким образом, получается 8 продуктов, кодирующих один и тот же белок (рис. 6). Смысл подобного разнообразия, по-видимому, состоит в том, что экспрессия BDNF таким образом может селективно регулироваться различными факторами и на нескольких уровнях, что обеспечивает большую гибкость в контроле скорости и величине ответа на то или иное воздействие, приводящее к усилению экспрессии белка BDNF.
Ген bdnf считается геном раннего ответа (IEG), то есть в ответ на стимул происходит быстрая инициация транскрипции этого гена, не требующая синтеза белка de novo, а в результате посттрансляционной модификации предсуществующих факторов транскрипции.
III IV V BDNF gene || / /—П / m «да I transcript exon tl transcript схш til transcript BDNF mRNA N,a potential gtycasj lalion site
Рис. 5. Строение гена bdnf[310].
I II III IV V -fa-fo^'fa Ь-ниши ь
Транскрипция и сплайсинг
Рис. 6. Транскрипты гена bdnf.
В нейронах рецепция нейротрансмиттера и деполяризация мембраны приводит к открытию лиганд- и потенциал-зависимых кальциевых каналов, что способствует входу кальция в клетку [292]. Кальций, быстро связываясь с соответствующими белками, запускает каскады передачи сигнала в ядро клетки, В ядре, в промоторе гена bdnf транскрипционный фактор CREB, связанный с последовательностью CRE, находится в неактивном состоянии. Кальций- зависимые протеинкиназы фосфорилируют CREB по остатку Ser-133, что запускает транскрипцию мРНК для BDNF.
Однако, мутационный анализ промотора bdnf выявил наличие дополнительных элементов, необходимых для кальций-зависимой транскрипции bdnf и отличных от CREB.
Регуляторные последовательности, контролирующие транскрипцию, находятся обычно в последовательности ДНК, фланкирующей 5'-конец начального экзона. Для гена bdnf таких экзонов четыре. Транскрипты, содержащие экзоны I, II и III, экспрессируются в мозге, тогда как экзон IV обнаружен вне мозга. Экзоны I и III индуцируются при судорожной активности во взрослом мозге [316]. Данные, полученные с помощью ОТ-ПЦР показали, что при деполяризации мембраны эмбриональных нейронов коры in vitro происходит транскрипция, главным образом, экзона III. Причем этот процесс не останавливается при добавлении в культуру циклогексемида, блокирующего синтез белка. Это говорит о том, что транскрипция экзона III запускается за счет посттранскрипционной модификации уже существующих факторов транскрипции [317].
Для определения роли регуляторных элементов в транскрипции гена bdnf осуществлялся делециоиный анализ и направленный мутагенез промоторной области экзона III [311,329]. Это позволило выявить наличие последовательности CRE за 35 п.н. до точки начала транскрипции. Дальнейший анализ промоторной области показал, что CREB является необходимым, но недостаточным фактором для запуска транскрипции. Найдены еще два элемента ДНК, регулирующие транскрипцию экзона III гена bdnf.
Проксимальный элемент (-52-43) содержит последовательность Е-box и связывает белок, принадлежащий к семейству транскрипционных факторов типа спираль-петля-спираль (helix-loop-helix). Дистальный элемент (-73-64) (5'- CTATTTCGAG-3') не принадлежит ни к одной из известных регуляторных последовательностей. С ним связывается белок, названный CaRF (calcium response factor).
Кофактор
CaRE1 CaRE2/E-box CaRE3/CRE |-73 -64| |-52 -43| |-36 -291
Рис. 7. Регуляция транскрипции гена bdnf различными транскрипционными факторами [329].
Таким образом, экзон III гена bdnf находится под регуляцией трех различных последовательностей, зависящих от ионов кальция (CaRE). Причем, мутация любого из них практически полностью прекращает транскрипцию bdnf зависящую от ионов кальция. То есть, для запуска транскрипции требуется несколько сигнальных событий, которые приведут к совместной активации всех трех факторов. Это, по-видимому, повышает порог сигнала, необходимого для запуска транскрипции bdnf, делая этот процесс более специфичным.
Кроме того, было показано, что транскрипция гена bdnf также находится под контролем другого транскрипционного фактора Fos [58,103,220,300]. Приведенные выше данные свидетельствуют о том. что экспрессия гена bdnf в ЦНС находится под сложным контролем различных внутри- и внеклеточных факторов,
Рецепторы для BDNF
Связывание нейротрофина с Trk-рецепторами вызывает их активацию путем лиганд-индуцированиой димеризации рецептора и автофосфорилирования внутриклеточных остатков тирозина [285]. Активированный рецептор способен фосфорилировать несколько внутриклеточных мишеней [289]. К белкам, которые активируются автофосфорилированным Trk-рецептором, относятся фосфолипаза С1-у, адалторные белки She, rAPS и SH2, фосфатидилинозитол-3' киназа (PI3K), Fyn, протеинтирозинкиназа. вовлеченная в регуляцию клеточной адгезии и синаптической пластичности и некоторые другие молекулы. В свою очередь, активированные белки запускают Ras/MAPK-каскад и фосфорилирование киназ, регулируемых внешними сигналами (ERKs), что приводит к увеличению концентрации кальция внутри клетки и последующей активации кальций/кальмодулин-зависимых киназ и казеинкиназы 2, фосфорилированию транскрипционного фактора CREB и дальнейшей активации экспрессии различных генов [114,169,245,262,307].
Кроме того, как и все нейротрофины, BDNF связывается с Р75-рецепторами и, действуя через этот рецептор, может запускать программированную гибель метки. Предполагается также, что именно через Р75 осуществляется ретроградный аксональный транспорт BDNF и NT-4 [84].
Суточные колебания уровня BDNF
В течение суток уровень BDNF в мозге крысы испытывает значительные изменения. Впервые наличие суточных колебаний в экспрессии мРНК для BDNF и mPFIK для TrkB было обнаружено во фронтальной коре и гиппокампе [68]. Самые высокие концентрации мРНК для BDNF отмечаются в ночные часы, и уровень в 20:00 выше уровня в 8:00 в 1,65 раза. В гиппокампе наблюдались еще большие колебания: уровень мРНК для BDNF в 20:00 выше, чем в 12:00 в 3,46 раза. То есть самые высокие концентрации mPFIK зафиксированы после выключения света (19:00), а самые низкие - после включения (7:00). Варьирует и экспрессия TrkB мРНК. Во фронтальной коре минимальный уровень наблюдался в 24:00, а максимальный - в 12:00 с разницей в 5,14 раза. В гиппокампе минимум экспрессии TrkB мРНК отмечен в 18:00, а максимум - в 8:00 с разницей в 17,44 раза. Авторы связывают эти вариации уровней мРНК с физиологическими колебаниями активности животных.
Методом гибридизации in situ на популяциях нейронов из разных областей гиппокампа крысы изучалась экспрессия мРНК для BDNF во время активного периода (темный цикл) и пассивного периода (светлый цикл) [60]. Крыс декапитировали через временные промежутки в 6 часов (12:00, 18:00, 24:00, 6:00). Точки 12:00 и 18:00 соответствовали середине и концу неактивного периода, а точки 24:00 и 6:00 - середине и концу активного. Было показано, что уровень мРЕПС для BDNF в гиппокампе минимален в 12:00, а затем повышается, достигая максимума в 6:00 (12:00<18:00<24:00<6:00). В результате были выявлены эндогенные колебания мРНК для BDNF в пирамидных клетках СА1 и САЗ областей гиппокампа, а также в воротных нейронах. Экспрессия мРНК для BDNF низкая во время светлого цикла (пассивный период) и повышается во время темного цикла (активный период) на 180% в СА1, на 170% в САЗ, на 153% в воротах, на 145% в зубчатой извилине относительно уровней в 12:00.
Ранее было показано, что физическая активность увеличивает уровень мРНК для BDNF [181,236,237]. Кроме того, стимуляция светом, а также стимуляция усов животного приводит к подъему уровня BDNF в коре [76,269], а помещение животных в новую обстановку увеличивает уровень мРНК в гиппокампе [110]. Таким образом, регуляция экспрессии белка BDNF зависит от активности животного и реакции на средовые воздействия.
Микродиализное изучение уровней ацетилхолина в гиппокампе выявило высокую корреляцию между физической активностью и подъемом ацетилхолина, причем самые высокие уровни ацетилхолина в гиппокампе наблюдаются во время темного цикла [95,224.225], что совпадает с суточными колебаниями мРНК для BDNF. В экспериментах in vivo и in vitro продемонстрирован подъем уровня мРНК для BDNF в нейронах гиппокампа под действием ацетилхолина [65,192,201]. Таким образом, ночное увеличение уровня мРНК для BDNF может быть связано с выбросом ацетилхолина.
Не исключено, что разные факторы вносят свой вклад в суточные колебания экспрессии белка BDNF. Если это так, то колебания BDNF в коре и гиппокампе не являются истинным суточным ритмом, а отражают внешние воздействия, зависящие от времени суток,
Существуют указания в пользу этой гипотезы [200] - в условиях постоянной темноты в гиппокампе не обнаружено ритмичных колебаний экспрессии мРНК для BDNF и его белкового продукта. Напротив, в гипоталамусе, структуре, тесно связанной с генерацией суточных ритмов у млекопитающих, BDNF (мРНК и белок) колеблются ритмично в отсутствЩ сигналов "свет-темнота".
Существуют указания в пользу того, что колебания уровня экспрессии белка BDNF могут вызываться колебаниями кортикостерона. Действительно, ранее было показано, что кортикостерои снижает экспрессию мРНК для BDNF и уровень белка BDNF в гиппокампе крысы [76]. Кортикостерои синтезируется ритмично в течение суток, достигая максимума с наступлением темноты, когда у крыс начинается период активности. Установлены суточные колебания мРНК для BDNF в зубчатой извилине: подъем с 8:00 до 12:00, спад с 12:00 до 20:00, далее уровень до 8:00 остается неизменным [281]. В областях СА1 и САЗ колебаний экспрессии bdnf не обнаружено, в отличие от данных, описанных в вышеуказанных исследованиях. При этом пик концентрации кортикостерона в плазме крови зафиксирован в 20:00, а минимум - в 8:00. Возможно, суточный ритм экспрессии bdnf в зубчатой извилине может регулироваться кортикостероном.
Имеются данные о колебаниях экспрессии bdnf в коре больших полушарий мозга крысы [78]. После 3 часов сна, спонтанного бодрствования или лишения сна отличий в экспрессии мРНК для BDNF в коре мозга обнаружено не было, Однако после 8 часов бодрствования экспрессия мРНК для BDNF в коре была существенно больше, чем после 8 часов сна, независимо от того, было ли бодрствование спонтанным во время темного периода или же оно достигалось лишением сна в светлое время суток. Бодрствование вызывало увеличение экспрессии мРНК для BDNF и в других областях мозга, а именно, в гиппокампе и таламусе. Уровень белка BDNF в коре бодрствующих крыс в 1,5 раза превышал уровень спящих крыс. Эти результаты дают основание предполагать, что поведение животного (бодрствование) в большей степени, чем время суток (темный период) отвечает за увеличение экспрессии мРНК для BDNF.
Факторы, влияющие на экспрессию BDNF в ЦНС
Экспрессия белка и мРНК для BDNF регулируется многими факторами - уровень BDNF варьирует в ходе развития и роста организма, зависит от его активности, а также меняется в ответ на повреждение нервной ткани при ишемии, гипогликемии, эпилептической активности и травмах [106,203,210,301]. Как при повреждении, так и в физиологических условиях регуляция экспрессии bdnf представляет собой сложное взаимодействие разных нейротрансмиттерных систем [315]. Краткие сведения о влиянии различных факторов на уровень BDNF в головном мозге представлены в Таблице 6 и следующих за ней комментариях.
Таблица 6. Влияние различных факторов на экспрессию BDNF в центральной нерпой системе млекопитающих.
1. Известно, что уровни мРНК для BDNF и NGF зависят от активности нейронов. Увеличение экспрессии регулируется глутаматом (через NMDA и nonNMDA рецепторы), а снижение - в основном через систему ГАМК [346,347]. Это показано в экспериментах как in vitro, так и in vivo на нейронах гиппокампа. В работе [155] изучалось действие антагонистов ГАМК(В) рецепторов CGP 36742, CGP 56433А и CGP 56999А. Однократное введение физиологически активных, не вызывающих судороги доз этих препаратов вызвало увеличение уровней мРНК для BDNF и NGF на 200-400%, а уровней соответствующих белков на 200 - 250% в коре, гиппокампе и спинном мозге крыс. Во всех исследованных областях сначала повышалась концентрация белка NGF, а затем - BDNF. Максимальные концентрации обоих белков достигались через 24-72 ч, в зависимости от области. В отличие от этого, концентрация нейротрофина NT-3 в коре и гиппокампе снижалась на 50% относительно контрольных значений. Эти данные демонстрируют способность антагонистов ГАМК(Б)-рецепторов избирательно увеличивать уровни эндогенных нейротрофинов в ЦНС.
В период раннего нейронального развития ГАМК функционирует как возбуждающий нейротрансмиттер. Такое действие ГАМК ведет к ряду изменений в структуре и функции нейронов. Одним из предполагаемых механизмов этого действия является участие ГАМК в регуляции активности киназ и косвенном контроле транскрипции bdnf через регуляцию фосфорилирования CREB [246]. И ГАМК, и агонист ГАМК(А)-рецептора мусцимол стимулируют экспрессию bdnf при раннем нейрональном развитии (нейроны гипоталамуса, 5 дней in vitro). Электрофизиологические исследования клеток показали, что BDNF значительно увеличивает частоту возбуждающих ГАМК-ергических постсинаптических токов. Эти данные говорят о взаимосвязи ГАМК и BDNF в период раннего развития: ГАМК увеличивает экспрессию bdnf a BDNF в свою очередь облегчает синаптический выброс ГАМК.
Исследовано влияние глутамата и его аналогов на экспрессию белка BDNF в культуре клеток мозжечка [62]. После 4 ч инкубации нейронов с агонистами глутаматных рецепторов: квисквалат, каииат, АМРА (альфа-амиио-З-гидрокси-5- метил-4-изоксазолпропионат и NMDA, увеличивался уровень мРНК для BDNF. Причем комбинация глутамата с антагонистами его ионотропных рецепторов (CNQX, АР-5 и/или МК-801) тоже повышала уровень мРНК для BDNF. Можно сделать вывод, что основной вклад в регуляцию экспрессии глутаматными рецепторами мРНК для BDNF вносят именно метаботрогшые рецепторы.
Половые стероидные гормоны, эстрогены и андрогены, влияют на организацию развивающейся нервной системы и участвуют в регуляции поведения взрослых особей. Эстрогены, как и нейротрофины, в ряде случаев способствуют выживанию и дифференцировке клеток нервной ткани. Показано, что нейроны, экспрессирующие нейротрофины и/или рецепторы к ним, также экспрессируют и рецепторы для эстрогена [222,318]. Уровни мРНК для BDNF в определенных областях гиппокампа колеблются во время эстрального цикла [128]. Как известно, эстрогеновый рецептор принадлежит к суперсемейству рецепторов, активирующих транскрипцию генов путем прямого связывания гормон-специфичных регуляторных элементов ДНК [109,250]. Таким образом, эстроген регулирует транскрипцию широкого набора генов. Была определена последовательность в гене bdnf, соответствующая ERE (estrogene response element) [302]. Эта последовательность расположена на 5'-конце экзона V, то есть экзона, кодирующего белок BDNF.
Изучено участие эстрогена в регуляции уровня мРНК для BDNF [302]. Овариэктомированным животным вводили эстроген и анализировали уровень мРНК в коре и обонятельных луковицах. Уже через 4 ч после однократного введения эстрогена наблюдалось 2-2.5-кратное увеличение экспрессии мРНК для BDNF относительно овариэктомированных животных (контроль). Показано, что дефицит эстрогена (двусторонняя овариэктомия) значительно снижает уровень мРНК для BDNF, тогда как применение эстрогена в тех же условиях поддерживает уровень нейротрофина в некоторых областях коры и в гиппокампе [298].
Исследовано влияние раннего стероидного окружения на экспрессию гена bdnf [303]. Анализ уровня мРНК для BDNF в гиппокампе после неонатальной гонадэктомиии и последующей заместительной терапией эстрогеном выявил значительное повышение уровня мРНК для BDNF с 4 по 10 дни постнаталы-гого развития (P4-I0). Параллельно с этим наблюдалось снижение уровня белка BDNF. Возможно, BDNF, синтезируемый нейронами гиппокампа, транспортируется к определенным мишеням, таким, как базальные ядра, а эстроген каким-то образом влияет на этот транспорт.
Показано, что физическая активность увеличивает экспрессию мРНК для NGF и BDNF в гиппокампе и коре крыс [237,248]. При этом наблюдалась прямая зависимость уровня мРНК для BDNF от расстояния, которое крысы пробегали в крутящемся колесе. Авторы полагают, что физическая активность способствует увеличению устойчивости мозга к повреждениям и защищает его от нейродегенерации, связанной со старением.
Изучено влияние глюкокортикоидов на экспрессию мРНК нейротрофинов в коре и гиппокампе крысы [54]. Через 3 дня после адренэктомии уровни мРНК для NGF, BDNF и NT-3 значительно снижались в обоих отделах. Заместительная терапия дексаметазоном восстановила уровни нейротрофинов до контрольных значении. Через 4 ч после введения дексаметазоиа в дозе 5мг/кг интактным животным уровень мРНК для NGF увеличивался в 2.5 раза, а для NT-3 увеличился в 1,4 раза. Через 24 ч и 48 ч после введения происходило снижение уровней до 50% от контрольных значений. Уровень мРНК для BDNF в первые 10 ч после введения не изменялся, а через 48 ч снижался до 70% от контрольных значений. Эти данные указывают на то, что глюкокортикоиды регулируют экспрессию мРНК нейротрофинов в коре и гиппокампе. Возможно, влияние глюкокортикоидов на выживаемость нейронов зависит от изменения уровней нейротрофинов в мозге [54].
Исследовано влияние иммобилизационного стресса (2 часа/день) на экспрессию нейротрофинов в мозге крысы [301]. В результате было показано, что единичная или повторная иммобилизация приводит к значительному снижению уровней мРНК для BDNF в гиппокампе и зубчатой извилине. В то же время уровень мРНК для NT-3 в тех же областях в условиях хронического стресса увеличивается, а экспрессия мРНК для NT-4 и TrkB не менялась.
В гипоталамусе крысы кратковременный иммобилизационный стресс (15 минут) вызывает быстрый подъем мРНК для BDNF, а затем и белка [265].
Показано, что хроническое потребление этанола приводит к значительному снижению мРНК для BDNF в гиппокампе крыс, а уровень мРНК для NGF, NT-3, а также белка NGF остаются неизменными. Кроме того, при хронической алкоголизации увеличивается уровень TrkB [53,208,312].
Острое применение этанола приводит к значительному увеличению экспрессии мРНК для BDNF через 12 ч в зубчатой извилине и САЗ области гиппокампа, а также в супраоптическом ядре гипоталамуса [312].
Существует топографическая корреляция между экспрессией нейротрофинов и распределением холинергических окончаний [344]. В связи с этим возникает вопрос, принимает ли холинергическая система участие в экспрессии нейротрофинов в ЦНС. Холинергическая деафферентация гиппокампа, коры и обонятельных луковиц с помощью инъекции в желудочки IgG-сапорина не вызвала значительных изменений уровней мРНК для NGF, BDNF и NT-3 в этих областях от 1 недели до 5 месяцев после повреждения. Эти данные свидетельствуют о том, что, по крайней мере, в физиологических условиях холинергическая афферентация не играет особой роли в поддержании базальных уровней нейротрофинов в мозге взрослой крысы [344].
Введение в гиппокамп агонистов холинергических рецепторов - никотина (агонист никотиновых рецепторов (nAChR)), карбахола (агонист и nAChRs, и мускариновых рецепторов (mAChRs)) и пилокарпина (агонист mAChRs) [118] - привело к следующим результатам. Никотин вызвал длительно сохраняющийся (с 24 до 72 ч) подъем уровня мРНК для NGF во всех областях гиппокампа. Этот подъем зависел от передачи возбуждающих нейротрансмиттеров и блокировался применением антагонистов АМРА или NMDА-рецепторов, В отличие от этого, карбахол и пилокарпин приводили к увеличению мРНК для NGF, сохранявшемуся 4-8 ч после введения. Пилокарпин приводил к значительному увеличению уровня мРНК для BDNF в гиппокампе; никотин и карбахол проявляли ту же тенденцию. Никотин и карбахол вызывали увеличение уровня NT-3 в зубчатой извилине и СА2. Через 8 ч после применения никотина происходил и подъем mPFIK для TrkB. Уровень мРНК для TrkB не изменялся.
Показано, что острое применение никотина значительно снижало уровень мРНК для BDNF в зубчатой извилине, СА1 и САЗ областях гиппокампа крысы через 2 и 24 ч после введения. Однако после 7 дней введения никотина развивалась толерантность и наблюдался подъем мРНК для BDNF в СА1 [180].
14,15. Норадренергические нейроны locus coeruleus иннервируют несколько областей мозга, в том числе гиппокамп и кору. Как известно, в гиппокампе отмечается самая высокая концентрация нейротрофинов NGF, BDNF и NT-3. Чтобы установить, какую роль играет адренергическая система в регуляции экспрессии мРНК нейротрофинов, осуществлялось химическое (с помощью N-(2- хлорэтил)-^этил-2-бромбензиламина) и механическое повреждение нор ад р енергич еских нейронов крысы и оценивались уровни мРНК нейротрофинов через 14 и 35 дней [164]. Было показано, что химическое повреждение вызывало значительный подъем мРНК для NGF и BDNF в гиппокампе через 35 дней, не повлияв при этом на уровень мРНК для NT-3. Механическое же разрушение привело к значительно менее выраженным изменениям в уровнях нейротрофинов. При введении норадреналина в гиппокампальные органотипические культуры, в зубчатой извилине уровни мРНК для NGF и BDNF, но не для NT-3, значительно снижались [164].
Показано, что хроническое применение ингибиторов обратного захвата серотонина. используемых в клинике в качестве антидепрессантов, ведет к увеличению экспрессии мРНК для BDNF в гиппокампе [239,247].
Изучено влияние дофамина на экспрессию белка BDNF в стриатуме мыши [247]. Через 2 ч после введения предшественника дофамина, леводопа, возрастал уровень мРНК для BDNF. Повышенный уровень сохранялся в течение 16 ч. Совместное введение галоперидола частично ингибировало этот эффект. Таким образом, дофаминергическая стимуляция напрямую влияет на экспрессию мРНК для BDNF в стриатуме in vivo.
Ингибирование эндогенной продукции N0 путем блокады NO-синтазы (NOS) поднимает уровень мРНК и белка BDNF в культуре нейронов коры грызунов [337]. Аналогичный результат был получен и на культуре нейронов гиппокампа крысы [73]. Экзогенное введение N0 приводило к снижению уровня белка BDNF на 46% относительно контроля. С другой стороны, при добавлении BDNF в культуру нейронов коры действует как положительный регулятор синтеза N0. У нокаутированных по bdnf мышей нарушена экспрессия NOS в коре.
Пептид AVP(4-8) является поведенчески-активным метаболитом аргинин-вазопрессииа (AVP), который способен влиять на процессы обучения и формирования памяти [94]. Изучено действие экзогенного AVP(4-8) на уровни мРНК для NGF, BDNF и NT-3 в мозге взрослой крысы [349]. Экспрессия белков NGF и BDNF значительно увеличивалась под действием AVP(4-8) в коре и гиппокампе, а экспрессия NT-3 не изменялась. Уровень мРНК для NGF в коре увеличивался в 6,43 раза, а уровень мРНК для BDNF - в 4,1 раза, В гиппокампе были обнаружены соответствующие изменения - в 3,05 раза для NGF и в 3,1 раза для BDNF. Применение в тех же условиях поведенчески-активного AVP привело к незначительным изменениям уровня экспрессии белка BDNF, а его поведенчески- неактивный аналог окситоцин вообще не вызвал изменений.
Пептиды VIP и родственный ему РАСАР, обладающие нейропротекторными свойствами [69,131,279], стимулируют экспрессию мРНК для BDNF в первичных культурах нейронов и астроцитов коры [252]. При этом в культурах нейронов увеличение экспрессии мРНК для BDNF, вызванная VIP и РАСАР, полностью отменяется под действием антагонистов NMDA-рецспторов - МК-801 и АР5, что указывает на то, что их действие связано с потенцированием действия глутамата.
Таким образом, обращает на себя внимание то, что нейротрофины и, в особенности BDNF, являются важнейшими факторами выживаемости нейронов и в то же время мощными регуляторами функций ЦНС. При этом уровень экспрессии белка BDNF достаточно лабилен - регулируется и эндогенными факторами, и внешними условиями, в которых находится организм. Следует отметить также, что пептидная регуляция экспрессии BDNF изучена недостаточно, и к настоящему времени имеется лишь три пептида, для которых показана способность усиливать экспрессию BDNF в клетках мозга - AVP(4-8), VIP и РАСАР, причем только на уровне транскрипции.
Рассмотрев в предыдущих разделах вопросы, связанные с проблемами создания лекарственных препаратов на основе пептидов (в частности и с нейропротекторными свойствами), свойств меланокортинов и ряда их аналогов, а также функций нейротрофинов в ЦНС перейдем к характеристике одной из распространенных болезней современности, связанной с гибелью нейронов в мозге, болезнн Альцгеймера.
Нейродегенерации Альцгеймеровского типа и гены пресенилина
Деменции - прогрессирующая потеря памяти и интеллекта - актуальная проблема здравохранения и социальной сферы в развитых странах. Болезнь Альцгеймера - наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание человека в среднем и пожилом возрасте, составляющее 50-60% всех форм деменций.
По данным организации Международной Организации болезнь Альцгеймера (Alzheimer's Disease International) за 2001 год, число больных деменцией в мире вырастет в ближайшие 25 лет с 18 до 34 млн. ('). По другим подсчетам, число больных в 2000 году оценивается как 25 млн. и прогноз на ближайшие десятилетия - 63 млн. к 2030 году и 114 мли. к 2050 году [190,197]. Рост случаев заболевания прежде всего связывают с увеличением продолжительности жизни в развитых странах мира. Несмотря на то, что относительная пропорция пожилых людей с деменцией в развивающихся странах ниже, чем в развитых, на долю развивающихся стран приходится около 52% всех случаев деменции, что связано в первую очередь с высокой численностью населения в данных странах [190].
Клинические и гистопатологические признаки болезни Альцгеймера
Исторически болезнь Альцгеймера связана с именем Алоиса Альцгеймера (Alois Alzheimer) - немецкого медика, впервые описавшего совокупность гистопатологических признаков заболевания в 1906-1907 годах. История болезни 51-летней пациентки Августы Д. (Auguste D.), наблюдавшейся с 51 года в течение 4,5 лет в госпитале для душевнобольных и больных эпилепсией во Франкфурте на Майне и умершей в апреле 1906 года, послужила основой доклада на конференции психиатров в Тюбингене 3 ноября 1906 года и последующих публикаций 1907 года. Пациентка страдала прогрессирующей потерей памяти, нарушениями речи, движения, узнавания, непредсказуемым поведением, галлюцинациями. Паталого- анатомический анализ мозга показал распростаненнуто атрофию коры, а также присутствие в кортексе характерных нейрональных бляшек (названных позже Альцгеймеровскими или сенильными) и нарушение структур нейрофибрилл (образование внутриклеточных нейрофибриллярных клубков). В 1910 году впервые появился термин "Болезнь Альцгеймера", который ввел Эмиль Крэпелин (Emil Kraepelin), директор королевской психиатрической клиники в Мюнхене, куда Альцгеймер перешел работать из Франкфурта [134,135,215]. В настоящее время по ряду классификаций (МКБ-10, DSM-IV), различают раннюю (пресенильную) форму болезни Альцгеймера, с началом заболевания до 65 лет, составляющую до 10% всех случаев, и позднюю (сенильную) форму, с началом заболевания после 65 лет. Заболевание Августы Д. относилось к первому типу, поэтому часто иресенильную деменцию называют "истинной" или классической болезнью Альцгеймера, а для случаев с поздним началом употребляют термин сенильная деменция альцгеймеровского типа (СДАТ). Кроме того, выделяют семейные и спорадические случаи болезни Альцгеймера.
Клиническое проявление болезни Альцгеймера начинается с ухудшения памяти о недавних событиях, встречах, разговорах, трудностями в пространственной ориентации, потерей интереса к жизни с прогрессирующим усилением симптомов деменции вплоть до полной потери способностей к узнаванию, ориентировке в пространстве и времени, деградации интеллекта и памяти. С начала проявления первых симптомов болезнь неуклонно развивается в течение 2-15 (20) лет. Смерть чаще всего наступает от пневмонии или общего истощения ( urn. org).
Основным гистопатологическим признаком болезни Альцгеймера является накопление амилоидных сенильных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, которое сопровождается массовой гибелью нейронов в ряде структур головного мозга. Сенильные бляшки представляют собой нерастворимые сферические образования диаметром около 0,2 мм (Рис. 8, А). Типичное строение бляшек - центральная, более плотная часть, состоящая в основном из отложений труднорастворимого р-амилоида (Ар пептида), продукта амилоидогенного протеолиза АРР (белка предшественника р-амилоида), окружена кольцом из дистрофичных нейритов. Кроме различных форм р-амилоида, в состав амилоидных бляшек входят другие белки, такие как: глгокозаминогликан (GAG), гепаран сульфат протеогликан (HSPG), амилоид Р сыворотки (SAP), аполипопротеин Е (АроЕ), «2 - м акр о гл о бу л ин, al-антихимотрипсин, факторы комплемента и др. [290]. Амилоидные бляшки часто окружают капилляры и более крупные сосуды и встречаются в основном в коре головного мозга, а также в некоторых других структурах мозга. Нейрофибриллярные клубки встречаются в нейронах, в виде внутриклеточных конгломератов, состоящих главным образом из аномально фосфорилированного тау-белка - структурного белка микротрубочек [ deptlabs/diagnostic_center_for alzheimer.htm] (Рис. 8, Б).
Болезнь Альцгеймера поражает в первую очередь нервные клетки височной доли коры головного мозга и гиппокампа (контролирующих память). Также нарушены следующие отделы мозга: лобная доля, отвечающая за принятие решений, индивидуальность, движение, речь; теменная доля, контролирующая речь, тактильные, болевые, пространственные и температурные ощущения; миндалина (отвечающая за эмоциональный контроль).
А
Рис. 8. Сеиильные бляшки и иейрофибриллярные клубки.
А. - Амилоидные бляшки [х11]. Б. - Рисунок нейрофибриллярных клубков пациентки Августы Д., выполненный А. Альцгеймером [215].
Ранняя диагностика болезни Альцгеймера крайне затруднена, т.к. первичные клинические проявления возникают через несколько лет после начала патологических процессов в мозге. Болезнь Альцгеймера необходимо отличать от других форм деменции, и в первую очередь от сосудистых деменций. Точный диагноз болезни Альцгеймера возможен только при гистопатологическом исследовании мозга после смерти (post mortem).
Генетические факторы и гены Болезни Альцгеймера
Молекулярные исследования болезни Альцгеймера связывают с идентификацией главного компонента амилоидных бляшек - Ар протеина [124]. Glenner и Wong показали также идентичность амилоидного компонента бляшек при болезни Альцгеймера и при болезни Дауна. Поскольку было известно, что болезнь Дауна вызывается трисомией по 21-й хромосоме, авторы предположили, что ген болезнь Альцгеймера, возможно находится на 21-й хромосоме [125]. В 1987 году был клонирован ген белка амилоидного предшественника (АРР), который локализовали на 21-й хромосоме и было показано, что этот ген кодирует белок рецептора наружной клеточной мембраны. Амилоид сенильных бляшек был определен как продукт аномального пропессинга АРР [175].
Дальнейший анализ семейных форм показал, однако, что болезнь Альцгеймера - генетически гетерогенное заболевание. Во многих случаях не наблюдалось сцепленного наследования болезни Альцгеймера с маркерами ДНК 21-й хромосомы [153,282,308]. Тем не менее, вскоре была найдена точечная мутация в гене АРР, приводившая к развитшо болезни Альцгеймера в двух неродственных семьях [127]. По совокупности биохимических и генетических данных была сформулирована гипотеза амилоидного каскада, в которой первичная роль отводилась отложению нерастворимого амилоида, запускающему дальнейшее развитие болезни Альцгеймера [151,153].
Для поиска генов более распространеных генетических форм болезни Альцгеймера была использована стратегия позиционного клонирования. В семьях с ранней формой болезни Альцгеймера был определен новый локус болезни Альцгеймера на 14-й хромосоме [230,283,309]. В результате реализации стратегии позиционного клонирования был выделен новый ген болезни Альцгеймера, получивший название пресенилина 1 (PS1) [293]. Вскоре после этого был обнаружен высокогомологичный ген (пресенилин 2/ PS2), локализованный на хромосоме 1. В результате генетического анализа, проведенного в семьях поволжских немцев и итальянцев, в данном гене были выявлены мутации, также приводящие к развитию ранней формы болезни Альцгеймера [196,272]. Последующий анализ показал, что пресенилины участвуют в процессинге АРР, мутации в генах ирееенилинов приводят к увеличению продукции амилоидогенной формы Ар (Р42 пептида) [66].
До сегодняшнего дня АРР, PS1 и PS2 остаются единственными генами для которых известны мутации при болезни Альцгеймера. Формы болезни Альцгеймера, вызываемые мутациями в генах АРР, PS1, PS2, характеризуются аутосомно-доминантным наследованием, "агрессивным" течением, ранним началом до 65 лет, и составляют до 10% всех случаев заболевания. Все мутации, ассоциированные с болезнь Альцгеймера, суммированы в базах данных, которые постоянно обновляются (, admutations/). C410Y
Рис. 9. Структура пресенилина-1 человека.
Показано трансмембранное расположение 8 доменов белка, участок протеолитического расщепления и одна из аминокислотных замен (C410Y), ассоциированная с развитием болезни Альцгеймера.
Интересно, что большая часть найденных мутаций приходится на ген PS1 [242], тогда как в АРР найдено всего 19 мутаций, а в PS2 - 10. С чем связано такое неравное распределение остается неизвестным.
Помимо классического типа болезни Альцгеймера некоторые мутации в гене PS1 могут также вызывать специфическую форму заболевания, для которой характерны диффузные "ватообразные" сосудистые бляшки, а также симптомы спастического парапареза (неполного паралича конечностей с усиленным тонусом мышц), часто предшествующие деменции [83]. Известно, что к такой форме заболевания приводят делеция экзона 10 (по номенклатуре [273] данный участок соответствует экзоиу 10), а также около 10 других миссенс-мутаций в PSJ [154]. Механизм действия мутаций, приводящий к данной патологии, до сих пор не изучен.
Второй главный маркер болезни Альцгеймера - нейрофибриллярные клубки - также интенсивно изучался. Было найдено, что нейрофибриллярные клубки состоят в основном из конгломератов гиперфосфорилироваиной полной формы тау-белка, а таюке из фрагментов тау-белка [140,141,242,336]. Был клонирован may-ген (МАРТ, Microtubule-Associated Protein Таи ген), который локализован на 17-й хромосоме [238]. Мутаций, приводящих к болезни Альцгеймера, в МАРТтте обнаружено не было. Интересно, что в недавних исследованиях в МАРТ гене было найдено более 30 мутаций, вызывающих некоторые формы лобно-височной деменции, при которой в мозге пациентов образуются нейрофибриллярные клубки, такие же как при болезни Альцгеймера, но отсутствуют отложения р-амилоид а [115]. В гипотезу амилоидного каскада было внесено уточнение: при болезни Альцгеймера нерастворимый амилоид запускает процесс, который через нарушение структуры микротрубочек приводит, в конечном итоге, к гибели клеток и нейродегенерации. При лобно-височной деменции непосредственно мутации в МАРТ гене являются причиной образования иейр о фибриллярных клубков [152]. Интересно, что найдены три мутации в гене пресенилина 1, ассоциированные с развитием лобно-височной деменции, но не болезни Альцгеймера. Предполагается, что такие мутации в PS1, могут приводить к частичной потере функций гена, и как следствие - отсутствию накоплений амилоида [41,90,266]. Хотя эти данные неоднозначны и требуют дальнейшего исследования, не исключается существование "неамилоидных" механизмов развития деменции при мутациях в гене PS1.
Сенильная деменция Альцгеймеровского типа, по всей видимости, является комплексным заболеванием, в которое может быть вовлечено сразу множество генов. Рассматривается более 50 различных генов-кандидатов, вовлеченных в патогенез болезни Альцгеймера и сосудистых деменции, участвующих в процессах оксидативиого стресса и апоптоза, воспалительных процессах, формировании сенильных бляшек и нейрофибриллярных клубков, метаболизме р-амилоида и др. Среди них: 1) гены, кодирующие белки-участники метаболизма Ар (например, гены сериновой протеазы al-антихимотрипсина; аспартатной протеазы катепсина D; неприлизина; IDE (insulin-degradating ensyrae); гены липопротеиновых рецепторов и их лигандов - LRP, LRPAP1, VLDLR, а2-макроглобулина, липопротеин липазы, АроЕ); 2) гены оксидативиого стресса и апоптоза (например, гены N0 синтазы, интерлейкинов, фактора некроза опухолей TNF-a); 3) гены ренин-ангиотензиновой системы (АСЕ) и др. гены (например, ген МАРТ, ген серотонинового транспортера 5-НТТ, эстрогеновых рецепторов) [82,270]. Кроме того, исследуются полиморфизмы в регуляторных областях, нитронах и экзонах уже известных генов болезни Альцгеймера (PS1, PS2, АРР), генов пресенилинового комплекса (никастрина, Aph-1 и др.) и генов-гомологов пресенилинов.
Продолжается поиск новых генов поздних форм болезни Альцгеймера с использованием методов анализа генетического сцепления. Наиболее перспективные локусы болезни Альцгеймера были картированы на хромосомах 10 [61,107,232], 12 [253,286], 19 [64,178,254,331]. Кроме того, рассматриваются потенциальные локусы и на других хромосомах - 1, 5, 6, 9, 21, X, и др. [64,178,233,331].
При трисономии по 21-й хромосоме отложения амилоида и нейрофибриллярные клубки появляются гораздо раньше, чем при болезни Альцгеймера. В возрасте после 40 лет эти гистопатологические маркеры болезни Альцгеймера, а также клиническая картина деменции, наблюдаются практически у всех пациентов с синдромом Дауна [333]. По всей видимости, это связано с повышенной экспрессией АРР гена. В пользу этой гипотезы свидетельствует уникальный случай 78-летней пациентки, имевшей частичную трисономию по 21-й хромосоме, исключая участок, содержавший АРР и близлежащие гены. Такая больная имела многие симптомы болезни Дауна (гипотироидизм, катаракту, гипотонию, нарушение слуха), но не развивала деменцию и другие гистопатологические маркеры болезни Альцгеймера [268]. Тем не менее, не следует исключать возможного влияния других генов 21-й хромосомы на развитие болезни Альцгеймера.
Исследования болезни Альцгеймера показали, что риск заболевания выше у женщин, чем у мужчин. Риск повышен в любом возрасте и не связан с другими известными генетическими факторами или разницей в средней продолжительности жизни [191].
Суммируя данные, можно заключить, что большую часть (50-80%) ранних семейных форм болезни Альцгеймера связывают с мутациями в генах PS1, PS2 и АРР. Для ранних и поздних (спорадических) форм болезни Альцгеймера наиболее общим фактором риска остается е4 аллель гена АроЕ.
Для разработки систем генетического прогнозирования развития заболевания, подходов профилактики и терапии, актуальным остается поиск новых генов болезни Альцгеймера, дальнейший анализ генов-кандидатов, а также, для известных генов болезни Альцгеймера, изучение метаболитических и сигнальных путей в которые они могут быть вовлечены, механизмов действия в норме и патологии. В этой связи активно изучаются гены пресенилинов, строение и функции которых будут рассмотрены ниже.
Функции генов пресенилинов
У человека идентифицировано 2 гена пресенилинов: PS1> локализованный на 14-й хромосоме (14q24.3) и PS2, локализованный на 1-й хромосоме (Iq31-q42). Гены пресенилинов кодируют белки с множественными трансмембранными доменами, состоящими из 467 и 448 а.о., соответственно. Существует несколько структурных моделей PS, по одной из которых, белок состоит из 8 трансмембранных доменов, между трансмембранными доменами VI и VII находится гидрофильная "петля", N- и С- гидрофильные концевые части и "петля" ориентированы в цитоплазму. Кроме того, выделяют два гидрофобных околомембранных домена после трансмембранных доменов VI и VIII (рис. 9) [198].
Показано, что в трансфицированных клеточных культурах и тканях мозга, пресенилин 1 подвергается быстрому эндопротеолизу и детектируется в виде двух основных фрагментов: N-домена 27-28 кДа и С-домена 16-17 кДа [314]. Кроме того, в процессе созревания пресенилины фосфорилируются по сериновым остаткам [287,327].
Белки пресеннлинов эволюционно консервативны. Они были обнаружены во множестве организмов: у простейших (Dyctiostellium discoideum), растений (.Arabidopsis thaliana), беспозвоночных (Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Helix lucorum) и позвоночных (Rcma temporana, Mus musculus, Homo sapiens). Пресенилины не найдены в геноме бактерий и грибов. При выравнивании белковых последовательностей различных организмов выделяются наиболее консервативные области вокруг двух аспартатов трансмембранных доменов VI и VII, и С-концевой PAL -мотив. Было показано, что эти области критически важны для функций пресенилинов (см. ниже).
Функции пресенилинов разнообразны и во многом не известны. Недавно установлено участие пресенилинов в протеолизе мембранных белков. Кроме того, показано, что пресенилины участвуют в регуляции WNT/p-катенинового сигнального пути, кальциевом обмене и, возможно, в сегрегации хромосом в митозе [199,216,228].
Участие пресенилинов в апоптозе клеток
Может ли причиной гибели нейронов при болезни Альцгеймера быть апоптоз, в настоящее время является предметом дискуссий. В некоторых работах, в тканях мозга пациентов с болезнью Альцгеймера, был найден ряд специфических морфологических и биохимических изменений в клетках - конденсация хроматина, фрагментация ДНК, нарушение Са2+ гомеостаза и функций митохондрий, оксидативный стресс, активация каспаз и др. [56,98,306]. В других работах таких эффектов не было обнаружено. Следует отметить, что сопоставление результатов при прямом исследовании постмортального материала является затруднительным, т.к. начальные этапы иейродегенерации и разные стадии деменции могут варьировать и влиять на результаты исследования. В связи с этим целесообразным представляется прямое исследование моделей клеточных линий, экспрессируюгцих мутантные и нормальные формы генов болезни Альцгеймера.
Экспрессия АРР как с мутациями, приводящими к развитию болезни Альцгеймера, так и без них, вызывала апоптоз в трансфицированных клеточных линиях [241,339,340]. Индукция апоптоза [47,170,328] или повышенная чувствительность к различным апоптотическим стимулам (депривации по трофическим факторам, оксидативному стрессу, действию р-амилоида) [89,142- 145,334] показаны в культурах с гиперэкспрессией ряда мутантных форм генов hPSl и hPS2. При изучении knock-in трансгенных мышей с экспрессией мутантных форм пресенилина 1 на эндогенном уровне, было также показано, что мутация M146V увеличивала чувствительность нейронов гиппокампа к апоптозу [146].
Основными причинами иейродегенерации при болезни Альцгеймера на сегодня считается накопление токсичного пептида Ар42, оксидативный стресс, нарушение Са2+ обмена, воспалительный процесс при участии цитокинов, наблюдаемое повышение чувствительности клеток к действшо факторов, вызывающих апоптоз и некроз [217]. При изучении механизмов апоптоза было показано, что мутации в пресенилине 1 приводят к нарушению стабильности комплексов PS1 с р-катенином, возможно защищающим клетки от негативного действия А(342 [348]. При экспрессии мутантных форм hPSl происходит таюке накопление внутриклеточного Са2+ как напрямую, так и опосредовано, через изменение протеолиза АРР [158].
В ряде работ по изучению апоптоза в модельных системах болезни Альцгеймера были получены негативные данные. Так, при knock-in мутантной формы гена hPSl, кодирующей ак-замену P264L, у трансгенных мышей не изменялась чувствительность нейронов кортекса к апоптозу [297]. В работе на первичных культурах нейронов кортекса гиперэкспрессия генов hPSl дикого типа или кодирующего белок с мутацией, встречающейся при болезни Альцгеймера, А246Е, не вызывала апоптоз, а напротив, играла протективную роль в отношении факторов, вызывающих апоптоз [72]. Гиперэкспрессия нормальной или мутантной форм hPS2 в различных клеточных культурах (N2a, СНО, НЕК293Т) не вызывала ни апоптоза, ни чувствительности к факторам апоптоза [121]. При экспрессии нормальных и мутантных форм гена пресенилина в модели трансгенных D. melanogasfer, апоптоз детектировали только при значительном увеличении числа копий генов - усилении экспрессии экзогенного hPSl [344].
Отличия в получаемых результатах, возможно, объясняются выбором типа клеток, уровнем экспрессии вносимых генов, различным действием мутаций, вызывающих болезнь Альцгеймера и др., что требует дальнейшего исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Использованные материалы и реагенты
В работе использовали следующие реагенты; L-глутамии, MEM, F12, DMEM, эмбриональную, сыворотку коровы («ICN», США), сахарозу, BSA, SDS, EDTA, NaOH, Na2C03, Na2HP04, NaCl, PPO, POPOP, бензамидин, PMSF, BDNF, Трис, инсулин, трансферрин, прогестерон, путресцин, Na2Se03, трифторуксусную кислоту, гептафтормасляную кислоту, трихлоруксусную кислоту, ацетонитрил, полиэтиленимин, D-глюкоза, L-глутамин, апротинин, лейпептин («Sigma-Aldrich», США), CuS04, параформальдегид, СаДа-тартрат, соляную кислоту, толуол («Реахим», Россия), СаСЬ, реактив Фолина, тритон Х-100 («Мегск», Германия), («Ferak Berlin»). Для работ с культурами клеток разного происхождения использовали пластиковую культуральную посуду фирм «Nunc» (Дания) и «Costar» (США). Фирмы-производители других использованных в работе материалов и реагентов указаны в соответствующих разделах.
Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса и других пептидов
Синтез гептапептида Семакс его аналогов и фрагментов проводилось в Отделе химии физиологически активных веществ (ОХФАВ) ИМГ РАН. Чистота препаратов проверялась методами тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ. Использовались препараты с чистотой не менее 99%. Меченный тритием Семакс (мечение проводилось в ОХФАВ) имел удельную радиоактивность 60-120 Ки/ммоль и хранился в 50% водно-этанольном растворе при -20С. НемеченныЙ Семакс и другие пептиды хранились в виде 1-5 мМ растворов в воде стандарта чистоты «Milli-Q» или в PBS при -70С. Стерильные растворы пептидов получали фильтрованием через ацетат-целлюлозные фильтры (0,22 мкм) («Costar», США). Растворы пептидов после размораживания хранили при 4С и использовали в течение 24 ч. В качестве контролей использовали эквивалентный объем воды или PBS.
Выделение плазматических мембран мозга
Выделение плазматических мембран мозга проводили по методу Грэя и
Виттакера с некоторыми модификациями [136]. Крыс линии Вистар (самцы) массой 200-250 г декапитировали, извлеченные базальные ядра переднего мозга промывали PBS (10 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl, рН 7,4) и гомогенизировали в 10 объемах 10 мМ Трис-HCl (рН 7,4), содержавшего 0,32 М сахарозу, 1 мМ EDTA, 1 мМ бензамидин и 0,1 мМ PMSF (буфер А) в гомогенизаторе тефлон-стекло. Гомогенизацию и все последующие операции проводили при температуре 4С. Гомогенат центрифугировали в течение 20 мин при 1000 g, осадок отбрасывали, а супернатант подвергали повторному центрифугированию при 40000 g в течение 30 мин. Плотный коричневый осадок на дне пробирки, обогащенный митохондриями, отбрасывали, а менее плотный светлый осадок суспендировали в буфере А, переносили в чистую пробирку и дважды промывали этим же буфером, осаждая мембраны центрифугированием, аналогичным предыдущему. По окончании промывок осадок суспендировали в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, содержавшем 0,22 М сахарозу и 1 мг/мл BSA и хранили в жидком азоте. Концентрация белка в образцах мембран составляла 10-20 мг/мл.
Определение концентрации белка
Концентрацию белка в образцах определяли с помощью модифицированного метода Лоури [256]. Для каждой экспериментальной точки использовали по 4 параллели. Калибровочные (концентрация белка (0-100 мг/мл) и определяемые пробы наносились на 96-луночные культуральные планшеты в объеме 80 мкл. после чего в каждую лунку добавлялось по 80 мкл четырехкомпонентной смеси (раствор 0,1% CuS04 х 5Н20, 0,2% Ca,Na-TapTpaT х 4 Н20, 10% Na2C03 (компонент 1), 10% SDS (компонент 2), 0,8 М NaOH (компонент 3), дистиллированная вода (компонент 4), смешанные в равных объемах). После инкубации 20 мин при комнатной температуре добавлялось по 40 мкл реактива Фолина, разведенного в 5 раз дистиллированной водой, После каждой стадии пробы тщательно перемешивались. Не менее чем через 90 мин инкубации при комнатной температуре измерялась оптическая плотность при 490 им. По полученным данным строили калибровочную кривую, в линейном интервале 20-80 мг/мл которой рассчитывалось количество белка в изучаемой пробе.
Радиолигандный анализ
Эксперименты по связыванию гептапептида Семакс с плазматическими мембранами проводили в полистирольных пробирках объемом 3,5-мл. Использовался меченный тритием пептид с удельной активностью 60-120 Ки/моль.
Реакционная смесь (конечный объем 1 мл) содержала 10 нМ [ Н] Семакс и 1 мМ СаСЬ (кроме экспериментов по изучению влияния ионов кальция на связывание Семакса) в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7,4 (буфер Б) и немеченный Семакс в соответствующих концентрациях. Реакцию начинали добавлением 0,2 мг мембранного белка в 0,2 мл того же буфера. Пробирки переносили в шейкер-инкубатор и выдерживали соответствующее время при температуре 30С при постоянном перемешивании. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолоконные фильтры GF/B («Whatman», Англия), предварительно вымоченные в 0,3% растворе полиэтиленимина в течение 2 ч при 4С. Каждую пробирку промывали один раз холодным 50 мМ Трис-HCl рН 7.4 (3 мл), а затем тем же объемом этого буфера три раза промывали фильтр. Фильтры сушили на воздухе и переносили в сцинтилляционные флаконы, содержащие 5 мл сцинтилляционной смеси (4 г РРО, 0,2 г РОРОР на 1 л толуола). Радиоактивность определяли на сцинтилляционном счетчике "Mark-3" («Nuclear Chicago», США) с эффективностью около 30%. Неспецифическое связывание определяли как количество метки, не вытесняемое 10 мкМ немеченым пептидом, Обратимость связывания с мембранами выявляли путем вытеснения связавшейся метки избытком немеченого Семакса (в среду инкубации добавляли 10 мкл 1 мМ немеченого пептида до конечной концентрации 10 мкМ).
Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур
В инкубационную смесь вводили 440 нМ [3Н]Семакса с удельной активностью 60 Ки/ммоль. В случае клеточных культур инкубационная смесь состояла из культуральной среды MEM/F12 (1:1), содержавшей 6 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глутамин, 25 мг/л инсулина, 100 мг/л трансферрина, 20 нМ прогестерон, 100 нМ путресцин и 30 нМ селенит натрия. Плотность посева клеток соответствовала указанному в разделе "Получение и ведение первичных клеточных культур", После инкубации указанное время в С02-инкубаторе при 37С в атмосфере, содержавшей 5% С02 и 95% воздуха, инкубационную смесь отбирали, кипятили в течение 2 мин, охлаждали до 4С и центрифугировали при 4С 15 мин при 15000 g. Супернатанты хранили при -20С,
В случае плазматических мембран реакционная смесь содержала 1 мМ СаС12 в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 7,4. Реакцию начинали добавлением мембранного белка до концентрации 0.2 мг/мл. Пробирки переносили в шейкер-инкубатор и выдерживали соответствующее время при температуре 30С при постоянном перемешивании. В указанные промежутки времени из инкубационной смеси отбирали аликвоты объемом 400 мкл в полипропиленовые микропробирки («Eppendorf», Германия), инкубировали 2 мин при 100С и центрифугировали при 4С 15 мин при 15000 g. Супернатант отбирали и хранили при -20С.
Для определения содержания Семакса и его фрагментов в биологических пробах проводили экстрагирование пептидной фракции образцов с помощью органических растворителей с последующей ВЭЖХ полученных экстрактов. К образцу объемом 200 мкл прибавляли 4-кратный объем ацетонитрила. Смесь центрифугировали при 4С 15 мин при 12000 g. Отбирали супернатант и высушивали его в роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в 1 мл метанола. Центрифугировали в тех же условиях, супернатант снова высушивали в роторном испарителе, сухой остаток растворяли в 100 мкл дистиллированной воды.
Пептидное семейство меланокортинов
Меланокортины являются семейством нейропептидов, принадлежащим к группе так называемых стрессовых пептидов, продуцирующихся с помощью протеолиза из молекулы-предшественника проопиомеланокортипа (ПОМК) [93]. ПОМК является источником нескольких интересных семейств нейропептидов (рис. 3) среди которых выделяются эндогенные опиоиды (а-, Р-, у-эндорфины) и семейство пептидов, в которое входят а-, [3- и у-меланоцитстимулирующие гормоны. В свою очередь, N-концевые фрагменты АКТГ, представляющие первые 13 аминокислот последовательности АКТГ, лишены способности стимулировать адренокортикальную секрецию. Последовательность АКТГ(1-13) соответствует а-меланоцитстимулирующему гормону (а -МСГ), структура которого идентична для всех позвоночных, в отличие от (5- и у-МСГ. Пептиды с аминокислотными последовательностями, входящими в последовательности а-МСГ, Р -МСГ, у-МСГ получили название меланокортины, или МСГ-пептиды [35,93]. К меланокортинам [45,162,163] часто относят и их аналоги, содержащие замены в природной аминокислотной последовательности, модифицированные и D-аминокислоты, в связи с чем представляется справедливым включение в это семейство и пептида Семакс. Наиболее длинный представитель меланокортинов - а-МСГ (13 а.о.) - изначально был известен как соединение, стимулирующее синтез меланинов и увеличение размеров и количества пигментных клеток в кожных покровах [35,162]. Следует отметить, что короткие представители меланокортинов, включая их аналоги, лишены не только способности стимулировать адренокортикальную секрецию, но и пигмент-стимулирующей способности, то есть активности этих пептидов большей частью проявляются в отношении нервной системы. Тем не менее, исторически сложившееся название меланокортины будет употребляться и далее для обозначения семейства пептидов с аминокислотными последовательностями, родственными N-концевым фрагментам АКТГ (рис. 4).
Минимальным эндогенным меланокортином, обладающим физиологической активностью, считается пептид АКТГ(4-10). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 а-МСГ Ser Туг Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val АКТЦ4-10) Met Glu His Phe Arg Trp Gly АКТЦ4-7) Met Glu His Phe Org 2766 02Met Glu His PheD-Lys Phe BIM-22015 D-Ala Gin Tyr Phe Arg Trp Gly Семакс Met Glu His Phe Pro Gly Pro Рис. 4. Структура меланокортинов и некоторых их аналогов. Меланокортины как нейропептиды Начиная с 50-60-х годов прошлого века, благодаря работам де Вида (D. de Wied) началось интенсивное изучение нейроактивных свойств меланокортинов [91- 93]. В 1950-60-х годах было показано, что АКТГ обладает не только к тому времени хорошо изученными эндокринными эффектами, но и способностью влиять на разные формы поведения животных [91]. Так, было продемонстрировано, что введение АКТГ может снимать чувство беспокойства [223], влияет на запоминание [231] и вызывает ряд других поведенческих реакций у животных. Влияние на поведение было затем показано и для а-МСГ [59] и для более коротких меланокортинов. С другой стороны, в дальнейшем было обнаружено, что и ПОМК, и АКТГ, и фрагменты АКТГ (в том числе и а-МСГ) иммунохимически детектируются в мозге [249]. Более того, было обнаружено присутствие мРНК для проопиомеланокортина в ряде отделов мозга [123]. Эти данные позволили придти к выводу, что АКТГ и меланокортины являются эндогенными по отношению к мозгу соединениями, и центральная нервная система не только служит мишенью для этих пептидов, но и может сама продуцировать их. Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих. Проблема места синтеза меланокортинов. Нормальный и поврежденный мозг Иммунохимическая локализация меланокортинов в основном проводилась с использованием антител к а-МСГ и АКТГ(4-10). Присутствие а-МСГ было обнаружено в мозге взрослой крысы, причем концентрации этого пептида в разных отделах мозга существенно различались [108]. Наибольшая концентрация а-МСГ обнаружена в гипоталамусе, а в пределах гипоталамуса - в аркуатном ядре. В остальных отделах мозга концентрация а-МСГ была на 1-2 порядка ниже (Таблица 1). Эксперименты на тканевых культурах показали, что нейроны аркуатного ядра синтезируют ПОМК [205]. Учитывая, что отростки нейронов аркуатного ядра гипоталамуса проникают в другие отделы мозга, можно предположить, что источником а-МСГ для них служит именно аркуатное ядро. Действительно, разрушение аркуатного ядра приводит к существенному снижению уровня а-МСГ в остальных отделах мозга, С другой стороны, при удалении гипофиза происходит снижение уровня а-МСГ в гипоталамусе [70]. Таким образом, по-видимому, источником части а-МСГ в мозге служит гипофиз; можно также предположить и влияние гипофиза на процессы синтеза а- МСГ в гипоталамусе. В пользу предположения о регуляции гипофизом синтеза в гипоталамусе предшественника меланокортинов недавно были получены дополнительные свидетельства - удаление части ПОМК-синтезиругощих клеток гипофиза мыши приводило к увеличению уровня мРНК для ПОМК в гипоталамусе [350]. Другим источником служит аркуатное ядро, что не исключает возможности синтеза а-МСГ (и других меланокортинов) в остальных отделах мозга. Так мРНК для ПОМК была обнаружена в гиппокампе и миндалине [123], сам ПОМК был обнаружен не только в аркуатном ядре, но и в дорсолатеральном гипоталамусе и среднем мозге [319]. В ходе эмбрионального развития ПОМК детектируется в гипоталамических нейронах эмбриона крысы, начиная со срока 12 дней, в то время как в гипофизе иммунореактивность к ПОМК регистрируется, лишь начиная с 1516-го дня эмбрионального развития (Е15-16).
Наибольший уровень иммунореактивности к ПОМК отмечается на 21-29 день постнатального развития [182]. Проводилось также исследование экспрессии ПОМК при развитии эмбрионов мыши [101]. Впервые ПОМК появляется в аркуатном ядре на сроке 10,5 дней развития эмбриона. В этот же срок ПОМК детектируется в нервных волокнах латерального и дорсального диэнцефалона. К сроку 11,5 дней развивается плотная сеть ПОМК-содержащих нейритов, проникающая в мезэнцефалон. К этому же сроку ПОМК-содержащие нейриты обнаруживаются в миелэнцефалоне. К 12,5 дням ПОМК-содержащие волокна появляются в спинном мозге. Между 13,5 и 15,5 днями формируется профиль ПОМК-содержащих волокон, распространяющихся в диэнцефалон, мезэнцефалон, метэнцефалон и миелэнцефалон, соответствующий взрослому состоянию, Следует отметить, что ПОМК-содержащие клетки в гипофизе появляются позже, чем в аркуатном ядре (к 12,5 дню в передней доле и к 14,5 дшо в промежуточной доле). Имеются данные о том, что в мозге эмбрионов мыши процессинг ПОМК с образованием а-МСГ начинается со срока 11,5 дней развития [267], В мозге человека наибольшая концентрация а-МСГ была также обнаружена в гипоталамусе, а в наибольшем количестве а-МСГ присутствует в черной субстанции. Интересно, что у больных болезнью Альцгеймера концентрация этого пептида в черной субстанции существенно снижена [46]. Объяснения этому феномену пока не предложено. АКТД4-10) был иммунохимически обнаружен в мозге взрослой крысы только в волокнах аркуатного ядра и средней септальной области. Совершенно иная ситуация с распределением АКТГ(4-10) возникает при исследовании неонатального (то есть развивающегося) мозга: в нем АКТГ(4-10) обнаруживался как в аркуатиом ядре и средней септальной области, так и в стриатуме, коре, гиппокампе, перивентрикулярной области. При повреждении черной субстанции взрослой крысы АКТГ(4-10) обнаруживался в стриатуме и ряде других отделов мозга [45], Вопрос о происхождении АКТГ(4-10) практически не освещен в доступной литературе; в некоторых работах постулируется его протеолитическое выщепление из а-МСГ, на что указывает и похожее распределение этих пептидов в мозге [162]. Таким образом, из данных по экспрессии АКТГ(4-10) в мозге крысы следует, что, по-видимому, значение этого меланокортина в функционировании взрослого мозга весьма ограничено. Значительно более широкое распространение АКТГ(4- 10) в неонатальном мозге свидетельствует о его роли в развитии ЦНС, а появление АКТГ(4-10) в отделах поврежденного мозга (по крайней мере, в рамках нигростриатной системы мозга) указывает на вероятное участие АКТГ(4-10) в процессах регенерации ЦНС.
Характеристика нейротрофина BDNF
BDNF продуцируется прежде всего клетками глии головного и спинного мозга [194], а также шванновскими клетками, ассоциированными с периферическими мотонейронами [34], Методом гибридизации in situ было изучено распределение мРНК для BDNF в мозге взрослых крыс и свиней [330]. В пределах гиппокампа интенсивно меченые нейроны были найдены в области пирамидного слоя, а также гранулярного слоя и ворот зубчатой извилины. Высокая экспрессия BDNF отмечена в нейронах коры мозга, ограде (claustrum) и других зонах. В значительно меньших количествах BDNF находят в сердце, легких и тромбоцитах [276,338], У крыс в возрасте одного месяца самый высокий уровень BDNF определяется в гиппокампе (5,41 нг/г ткани), затем следует гипоталамус (4,23 нг/г) и перегородка (1,68 нг/г). В других областях уровень BDNF колеблется от 0,9 до 1,7 нг/г. BDNF также в очень низких концентрациях обнаружен на периферии: 0,65 нг/г в селезенке, 0.21 нг/г в тимусе, 0,06 нг/г в печени [176]. По другим данным [234] в гиппокампе двухмесячных крыс определяется более 200 нг/r ткани BDNF. Наличие BDNF показано как в цитоплазме тел нейронов, так и в дендритах [276]. Вообще в головном мозге BDNF обнаружен во многих структурах, включая кору, миндалевидный комплекс, гиппокамп, некоторые ядра таламуса и гипоталамуса, черную субстанцию и некоторые образования ствола мозга. Причем в отличие от мРНК белковый продукт также определяется в боковой перегородке, в ядре ложа терминальной полосы, медиальном преоптическом ядре, оливном предпокрышечном ядре, латеральном парагигантоклеточном ядре и задних рогах спинного мозга [343]. Эти данные указывают на наличие антероградного транспорта BDNF в определенных популяциях. В некоторых областях, наоборот, определяется только мРНК для BDNF.
Так, в гиппокампе клеточные области, в которых определяется иммунореактивность BDNF, не совпадают с распределением мРНК. Как предполагается, это связано с тем, что количество белка слишком мало, чтобы зафиксировать его с помощью иммуногистохимии или же он очень быстро используется или транспортируется в другие области. Иммуногистохимическая локализация трансмембранного белка TrkB, служащего рецептором для BDNF, показала его широкое распространение в ЦНС крысы [342]. TrkB экспрессируется на телах нейронов, на аксонах и дендритах во многих структурах, включая кору, гиппокамп, зубчатую извилину, стриатум, ядра перегородки, черную субстанцию, клетки Пуркинье мозжечка, ствол мозга, спинальные мотонейроны и чувствительные ядра ствола. Кроме того, TrkB обнаружен на субиопуляции клеток эпендимы, выстилающей желудочки мозга. Белок TrkB экспрессируется и в астроцитах, однако в укороченной форме, лишенной каталитической субъединицы [37]. Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции Ген bdnf (рис. 5) [310] состоит из четырех коротких 5 -некодирую щих экзонов (I- IV), каждый из которых содержит отдельный промотор, и одного З -концевого экзона (экзои V), кодирующего белок BDNF. Кроме того, каждый из четырех вариантов, полученных в результате альтернативного сплайсинга, подвергается полиаденилированию по одному из двух сайтов, расположенных в 3 области экзона V, Таким образом, получается 8 продуктов, кодирующих один и тот же белок (рис. 6). Смысл подобного разнообразия, по-видимому, состоит в том, что экспрессия BDNF таким образом может селективно регулироваться различными факторами и на нескольких уровнях, что обеспечивает большую гибкость в контроле скорости и величине ответа на то или иное воздействие, приводящее к усилению экспрессии белка BDNF. Ген bdnf считается геном раннего ответа (IEG), то есть в ответ на стимул происходит быстрая инициация транскрипции этого гена, не требующая синтеза белка de novo, а в результате посттрансляционной модификации предсуществующих факторов транскрипции. В нейронах рецепция нейротрансмиттера и деполяризация мембраны приводит к открытию лиганд- и потенциал-зависимых кальциевых каналов, что способствует входу кальция в клетку [292]. Кальций, быстро связываясь с соответствующими белками, запускает каскады передачи сигнала в ядро клетки, В ядре, в промоторе гена bdnf транскрипционный фактор CREB, связанный с последовательностью CRE, находится в неактивном состоянии. Кальций- зависимые протеинкиназы фосфорилируют CREB по остатку Ser-133, что запускает транскрипцию мРНК для BDNF. Однако, мутационный анализ промотора bdnf выявил наличие дополнительных элементов, необходимых для кальций-зависимой транскрипции bdnf и отличных от CREB. Регуляторные последовательности, контролирующие транскрипцию, находятся обычно в последовательности ДНК, фланкирующей 5 -конец начального экзона. Для гена bdnf таких экзонов четыре. Транскрипты, содержащие экзоны I, II и III, экспрессируются в мозге, тогда как экзон IV обнаружен вне мозга. Экзоны I и III индуцируются при судорожной активности во взрослом мозге [316]. Данные, полученные с помощью ОТ-ПЦР показали, что при деполяризации мембраны эмбриональных нейронов коры in vitro происходит транскрипция, главным образом, экзона III. Причем этот процесс не останавливается при добавлении в культуру циклогексемида, блокирующего синтез белка. Это говорит о том, что транскрипция экзона III запускается за счет посттранскрипционной модификации уже существующих факторов транскрипции [317]. Для определения роли регуляторных элементов в транскрипции гена bdnf осуществлялся делециоиный анализ и направленный мутагенез промоторной области экзона III [311,329]. Это позволило выявить наличие последовательности CRE за 35 п.н. до точки начала транскрипции.
Дальнейший анализ промоторной области показал, что CREB является необходимым, но недостаточным фактором Проксимальный элемент (-52-43) содержит последовательность Е-box и связывает белок, принадлежащий к семейству транскрипционных факторов типа спираль-петля-спираль (helix-loop-helix). Дистальный элемент (-73-64) (5 - CTATTTCGAG-3 ) не принадлежит ни к одной из известных регуляторных последовательностей. С ним связывается белок, названный CaRF (calcium response factor). CaRE1 CaRE2/E-box CaRE3/CRE -73 -64 -52 -43 -36 -291 Рис. 7. Регуляция транскрипции гена bdnf различными транскрипционными факторами [329]. Таким образом, экзон III гена bdnf находится под регуляцией трех различных последовательностей, зависящих от ионов кальция (CaRE). Причем, мутация любого из них практически полностью прекращает транскрипцию bdnf зависящую от ионов кальция. То есть, для запуска транскрипции требуется несколько сигнальных событий, которые приведут к совместной активации всех трех факторов. Это, по-видимому, повышает порог сигнала, необходимого для запуска транскрипции bdnf, делая этот процесс более специфичным. Кроме того, было показано, что транскрипция гена bdnf также находится под контролем другого транскрипционного фактора Fos [58,103,220,300]. Приведенные выше данные свидетельствуют о том. что экспрессия гена bdnf в ЦНС находится под сложным контролем различных внутри- и внеклеточных факторов, Рецепторы для BDNF Связывание нейротрофина с Trk-рецепторами вызывает их активацию путем лиганд-индуцированиой димеризации рецептора и автофосфорилирования внутриклеточных остатков тирозина [285]. Активированный рецептор способен фосфорилировать несколько внутриклеточных мишеней [289]. К белкам, которые активируются автофосфорилированным Trk-рецептором, относятся фосфолипаза С1-у, адалторные белки She, rAPS и SH2, фосфатидилинозитол-3 киназа (PI3K), Fyn, протеинтирозинкиназа. вовлеченная в регуляцию клеточной адгезии и синаптической пластичности и некоторые другие молекулы. В свою очередь, активированные белки запускают Ras/MAPK-каскад и фосфорилирование киназ, регулируемых внешними сигналами (ERKs), что приводит к увеличению концентрации кальция внутри клетки и последующей активации кальций/кальмодулин-зависимых киназ и казеинкиназы 2, фосфорилированию транскрипционного фактора CREB и дальнейшей активации экспрессии различных генов [114,169,245,262,307].
Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур
Первичные культуры глиальных клеток. Первичную культуру глиальных клеток (рис. 10) получали согласно стандартной методике [79]. Крыс линии Sprague-Dowly или Вистар возраста 1-3 дня умерщвляли с помощью углекислотной асфиксии (15 мин) и помещали на 1 мин в 80% раствор этанола в воде. Далее все операции проводили в асептических условиях при температуре 4-7С. Выделенный мозг помещали в раствор Хэнкса и далее выделяли базальные ядра переднего мозга, освобождая ткань от оболочек. Выделенную ткань один раз промывали раствором Хэнкса и переносили в среду MEM/F12 (1:1), содержавшую 20% ЭСК и 2 мМ L-глутамин. Ткань механически диссоциировали на отдельные клетки с помощью пипетирования. Полученную клеточную суспензию один раз промывали средой того же состава с помощью центрифугирования при 200 g. Клетки считали в гемацитометре (камера Г оря ев а) и засевали плотностью 200 тыс. клеток/см2 на обработанные поли-L-лизином культуральные флаконы площадью 75 смг. Культивирование клеток проводили в С02-инкубаторе при 37С в атмосфере, содержавшей 5% С02 и 95% воздуха в среде MEM/F12 содержавшей 15% эмбриональной сыворотки коровы, 2 мМ L-глутамин, 100мкг/мл гентамицина. Культуральную среду меняли каждые 3 дня. Пересев клеток проводили после образования монослоя в соотношении 1:3. Для экспериментов использовали клетки, полученные в результате третьего пересева, после образования монослоя. Первичные культуры нервных и глиальных клеток щ fos-lacZ трансгенных мышей. Первичную культуру нервных и глиальных клеток из fos-lacZ- трансгенных мышей получали согласно описанному методу [103]. Анализ экспрессии гена c-fos в этих культурах проводили через 3-6 дней инкубации in vitro (DIV, days in vitro) и осуществляли с помощью гистохимической окраски на бета-галактозидазу, с использованием красителя X-Gal (5-бр о м - 4 - хл ор - 3 -ин д о л и л - Р -D - галактопиранозид) как описано ранее [244,284]. Фотографии клеточных культур представлены на рис. 11-13. Первичные диссоциированные культуры нейронов. Первичные диссоциированные культуры нейронов базальных ядер переднего мозга крысы (рис, 14) получали из 16-17-дневных эмбрионов (Е16-17) по стандартной методике [156]. Крыс линии Sprague-Dowly массой 200-300 г ссаживали в соотношении 1 самец - 3 самки после 18 ч вечера; следующий день после рассаживания считался первым днем беременности. Крыс умерщвляли методом углекислотной асфиксии (15 мин) и помещали на 1 мин в 80% раствор этанола в воде.
Далее все операции проводили в асептических условиях при температуре 4-7С. Выделенный из эмбриона мозг помещали в раствор Хэнкса и далее выделяли базальные ядра переднего мозга, освобождая ткань от оболочек. Выделенную ткань один раз промывали раствором Хэнкса и переносили в среду MEM/F12 (1:1), содержавшую 20% эмбриональной сыворотки коровы и 2 мМ L-глутамин. Ткань механически диссоциировали на отдельные клетки с помощью пипетирования. Полученную клеточную суспензию два раза промывали средой с помощью центрифугирования. Клетки считали в гемоцитометре (камера Горяева) и засевали с плотностью 100 тыс. клеток/см на обработанные поли-L-лизином 12-луиочные планшеты (или 24- луночные планшеты) в среде MEM/F12 (1:1), содержавшей 6 г/л D-глгокозы, 2 мМ L-глутамин, 25 мг/л инсулина, 100 мг/л трансферрина, 20 нМ прогестерон, 100 нМ путресцин и 30 нМ селенит натрия. Культивирование клеток проводили в С02- ипкубаторе при 37С в атмосфере, содержавшей 5% ССЬ и 95% воздуха. Аналогичным образом получали первичные нейрональные культуры и из других отделов мозга эмбрионов крысы (гиппокамп, кора, мозжечок, средний мозг). Культивирование клеток феохромоцитомы крысы линии РС12. Клетки феохромоцитомы крысы линии РС12 выращивали при ЗТС и 5% СОг на среде RPMI-1640 («ICN», США) с добавлением 15% ЭСК и 80 мкг/мл гентамицина. Хранение полученных клеточных линий. Для сохранения полученных линий клетки замораживали. Клетки механически сбивали с поверхности чашки или флакона, гомогенизировали в 100% сыворотке и добавляли 7% ДМСО («Serva», Германия), после чего аликвоты клеток объемом 1 мл охлаждали в холодильнике при +4С, затем переносили в кельвинатор, для кратковременного хранения при - 70С и, наконец, в жидкий азот для долговременного хранения. Оценка выживаемости нейронов in vitro Культивирование первичных культур нейронов проводили в 12-луночных планшетах в 6 параллелях для каждого варианта. Выживаемость культивируемых нейронов через 7 DIV оценивали путем подсчета цитохимически или иммуноцитохимически окрашенных клеток в 18 случайных полях каждой лунки. Холинергические нейроны визуализировали с помощью окраски на ацетилхолинэстеразу. Культуры фиксировали 4% параформальдегидом 1 ч при комнатной температуре, промывали PBS и инкубировали 48 ч в 50 мМ ацетатном буфере (рН 5,0), содержавшем 4 мМ ацетилхолин-иодид, 2 мМ C11SO4, 10 мМ глицин и 0,2 мМ этопропазин. Затем инкубационную среду отбирали, клетки промывали водой и на 1-2 мин добавляли 1,25% раствор NaiS. Среду отбирали и на 1-2 мин добавляли 1% раствор AgN03. Среду отбирали и планшеты промывали водой. Тотальную (общую) популяцию нейронов визуализировали с помощью антител к нейронспецифической энолазе (NSE) или МАР-2, маркеру зрелых нейронов. Клетки фиксировали 1 ч при комнатной температуре 4% иараформальдегидом, промывали PBS, инкубировали 15 мин в PBS, содержавшем 33% овечьей сыворотки, и затем 1 ч в PBS, содержавшем 0,3% Тритона Х-100 и антитела кролика к NSE (разбавление 1:2000) или к МАР-2 (1:1000). Лунки промывали PBS и инкубировали 1 ч с биотинилировапиыми анти-кроличьими антителами (разбавление в PBS 1:500) и визулизировали клетки с помощью набора ABC reagent («Vectastain», США). ГАМК-ергические нейроны визуализировали с помощью антител к ГАМК. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом 1 ч при комнатной температуре, промывали PBS и инкубировали 1 ч в PBS, содержавшем 7% сахарозы. После инкубации раствор отбирали, добавляли раствор аналогичного состава, замораживали при -70С и размораживали при комнатной температуре. Клетки затем инкубировали 10 мин в PBS и затем 10 мин в PBS, содержавшем 5% овечьей сыворотки и 0,3% Тритона Х-100. Среду отбирали, и клетки инкубировали с кроличьими антителами к ГАМК (разбавление 1:1000 в PBS с 5% овечьей сывороткой). Лунки промывали PBS и инкубировали 1 ч с биотинилированными анти-кроличьими вторыми антителами (разбавление в PBS 1:500) и визулизировали клетки с помощью набора ABC reagent («Vectastain») в соответствии с методикой и рекомендациями фирмы-производителя. Аналогичным образом окрашивали дофаминергические нейроны в первичных культурах, полученных из среднего мозга крысы (Е 15).
Влияние Семакса на выживаемость культивируемых нейронов, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы
Для получения дополнительной информации относительно специфичности действия Семакса на жизнеспособность различных типов нейронов в культуре было изучено действие этого пептида на количество дофаминергических нейронов в среднем мозге эмбрионов крыс (Е15-16). Семакс при однократном введении в среду инкубации в концентрациях 10"7М и 10"5 М в день посева клеток увеличивал в 3-5 раз по сравнению с контролем количество тирозингидроксилаза (Неположительных нейронов в первичных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс (Е15-16) через 12 дней культивирования (рис. 25). Известно, что тирозингидроксилаза экспрессируется, в частности, в дофаминергических нейронах в различных отделах ЦНС и является одним из маркеров нейронов этого типа. Суммируя полученные результаты, можно констатировать, что Семакс способен предотвращать спонтанную гибель нейронов различной ергичности в опытах in vitro. Такое действие пептида свидетельствует о наличии у него нейропротекторных свойств и таким образом определяет его перспективность для разработки лекарственного препарата на его основе. 6. Исследование нейропротекторных эффектов Семакса в клеточных моделях индуцированной нейротоксичности Учитывая способность Семакса предотвращать спонтанную гибель нейронов различной ергичности в первичных клеточных культурах, полученных из эмбрионального мозга крыс, было интересным и необходимым оценить егонейропротекторные свойства в модельных клеточных системах с так называемой индуцированной нейротоксичностыо. В наших исследованиях были использованы две различные модели. В первой модели для индукции гибели дофаминергических нейронов в первичных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс (Е15-16), добавляли 6-ГДА [16,24] . Во втором случае использовали генетически модифицированные генами пресенилина-1 человека (hPS-1) клетки феохромоцитомы крысы линии РС12. Известно, что мутации в этом гене приводят к развитию ранней семейной формы болезни Альцгеймера [293].
Клетки феохромоцитомы крысы линии РС12 являются удобным и общепризнанным объектом для индукции нейрональной дифференцировки in vitro под действием NGF [137]. 6а. Модель гибели дофаминергических нейронов in vitro, индуцированной 6ГДЛ Так как окружение глии имеет большое значение для поддержания жизнеспособности нейронов как in vitro, так и in vivo, нами были изучены цитопротекторные эффекты Семакса в смешанной нейроглиальной культуре, полученной из среднего мозга эмбрионов крысы (Е15-16). Нейротоксин 6-ГДА, добавленный к клеткам в концентрациях 2 и 5 мкМ, вызывал дозозависимое снижение количества ТГ-положительных нейронов (рис. 26). Причем в присутствии 5 мкМ 6-ГДА наблюдалась гибель примерно 60% ТГ-положительных нейронов по сравнению с контролем. Семакс (100 нМ). добавленный за 30 мин до 6-ГДА (5 мкМ), достоверно повышал количество ТГ- положительных нейронов примерно на 70-75%, демонстрируя существенный защитный эффект (рис. 26). В присутствии 2 мкМ 6-ГДА достоверного защитного эффекта пептида обнаружено не было, вследствие незначительной гибели клеток в присутствии нейротоксина. При добавлении Семакса к клеточным культурам за 1 сутки до нейротоксина, защитного влияния пептида на выживаемость ТГ-положительных нейронов обнаружено не было. Выявленные в наших опытах цитопротекторные эффекты пептида могут быть обусловлены повышением уровня нейротрофических факторов, таких как NGF; BDNF [ 14,291 ] и GDNF, которые обладают выраженными нейропротекторными свойствами и могут препятствовать гибели дофаминергических нейронов [99,177,304]. В литературе ранее были описаны нейропротекторные эффекты аналога АКТГ(4-10) ORG 2766 на модели нейротоксичности у крыс in vivo, вызванной 6-ГДА [44,45,325,326], однако об эффективности этого пептида в условиях in vitro не сообщалось. Кроме того, ORG2766 не является в отличие от Семакса клинически применяемым пептидом. 66. «Пресен ил иноеая» клеточная модель болезни Альцгеймера Для создания «пресенилииовой» клеточной модели в клетки PC 12 методом электропорации вводили следующие вектора: pcDNA3 (контроль) и сконструированные на его основе плазмиды. Были использованы следующие плазмиды: pcPSlwt (со вставкой кДНК гена hPSl дикого типа), pePSlC410Y (со вставкой к ДНК мутантной C410Y формы гена hPSl), а также pcPSlM146V (со вставкой кДНК мутантной M146V формы гена hPSl). Точечные мутации C410Y и M146V в гене hPSl характеризуются аутосомно-доминантным наследованием и приводят к развитию наиболее агрессивной ранней семейной формы болезни Альцгеймера [40,293]. В результате трансфекции и последующей селекции на устойчивость к антибиотику G418 (все рекомбинантные плазмиды несли ген резистентности к неомицину пеог) были получены 4 поликлональные культуры, а именно: K-poly (трансфекция вектором pcDNA3), wt-poly (pcPSlwt) и C410Y-poly (pcPSlC410Y) и M146V-poly (pcPSlM146V). Каждая поликлональная культура представляла собой суммарный пул из 300-400 G418-резистентных клонов. Параллельно с выделением поликлональных культур были отобраны индивидуальные клоны независимого происхождения для каждого варианта трансфекции. ПЦР-анализ геномной ДНК полученных поликлональных культур и клонов показал, что в каждом варианте трансфекции все поликлональные культуры и приблизительно 75-80% клонов, резистентных к G418, содержали вставки кДНК гена человека PS1.
В положительных по данным ПЦР-анализа культурах и клонах была проанализирована экспрессия белкового продукта трансгена. Для проведения Вестерн-анализа использовали полученные нами поликлональные антитела к N- концевому участку белка hPS 1. Вестерн-анализ показал, что в поликлональных культурах wt-poly, C410Y- poly и M146V-poly, в отличие от контрольной культуры К-poly, наблюдался сигнал в районе 43-45 к Да, соответствующий непроцессированному белку экзогенного PS1 человека. Кроме того, во всех культурах присутствовала 30 кДа форма эндогенного пресенилина крысы (степень гомологии крысиного и человеческого пресенилинов -96%) (Рис. 27). Полноразмерный экзогенный белок, как дикого типа (wt), так и мутантных форм, подвергался эндопротеолитическому расщеплению в районе гидрофильной петли. При этом экзогенный мутантный пресенилин, особенно с мутацией C410Y, процессировался с меньшей эффективностью. Изучение пролиферативной активности клеток поликлональных культур К- poly, wt-poly, C410Y-poly и M146V-poly показало, что при их культивировании на различных средах (в стандартных условиях с 15% ЭСК, на среде с пониженным содержанием сыворотки (1%) и в условиях, приводящих к дифференцировке) статистически достоверных различий в скорости роста не выявлено (Рис. 28). Все эксперименты по анализу пролиферации клеточных культур проводили с помощью МТТ-метода. МТТ-метод основан на том, что добавляемый в культуральпуто среду МТТ под действием ферментов дыхательной цепи митохондрий живых клеток превращается в нерастворимую форму. Проводимый затем лизис клеток, солюбилизация лизисного раствора и определение его оптической плотности позволяют с помощью калибровочной кривой определить число жизнеспособных клеток, а точнее клеток, в которых сохраняется активность митохондриальных ферментов, Таким образом, можно точно определить количество живых клеток. При изучении апоптоза этот метод, как правило, дает заниженные результаты по сравнению с цитологическими методами, оценивающими фрагмеитирование и конденсирование ядер, характерные для апоптоза. Поскольку в апоптотических клетках, в отличие от некротических, сохраняется целостность мембраны, то остающаяся даже во фрагментированных мембранных образованиях активность ферментов дыхательной цепи оценивает по данному методу апоптотические клетки, как нормальные жизнеспособные клетки. Поэтому при изучении апоптоза в данной работе дополнительно был использован
