Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 17
Некоторые проблемы создания лекарственных препаратов на основе пептидов 17
Меланокортины и их аналоги, функции в ЦНС 19
Пептидное семейство меланокортинов 19
Меланокортины как нейропептиды 21
Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих. Проблема места синтеза меланокортинов. Нормальный и поврежденный мозг 22
Общие трофические свойства меланокортинов 25
Влияние меланокортинов на нейроны ЦНС 26
Ноотропные и нейропротекторные эффекты меланокортинов 27
Ноотропные и иейропротекторные эффекты Семакса 31
Нейротрофины и их характеристика 37
Общая характеристика семейства нейротрофинов 37
Характеристика нейротрофина BDNF 41
Экспрессия BDNF в нервной системе 42
Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции 44
Рецепторы для BDNF 48
Суточные колебания уровня BDNF 49
Факторы, влияющие на экспрессию BDNF в ЦНС 52
Нейродегенерации Адьцгеймеровского типа и гены нресенилина 62
Клинические и гистопатологические признаки болезни Альцгеймера 63
Генетические факторы и гены Болезни Альцгеймера 66
Функции генов пресенилииов 72
Участие нресенилинов в апоптозе клеток 73
Материалы и методы исследования 76
Использованные материалы и реагенты 76
Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса и других пептидов 76
Выделение плазматических мембран мозга 77
Определение концентрации белка 78
Радиолигандный анализ 78
Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур 79
Получение и ведение первичных клеточных культур 81
Оценка выживаемости нейронов in vitro 89
Оценка уровня пролиферации клеток 90
Подготовка плазмидной ДНК для трансфекции культур клеток млекопитающих 91
Траисфекция клеток линии РС12 с помощью электронорации 91
Получение трансфидированных поликлональных культур клеток РС12 и клопов индивидуального происхождения 93
Выделение высокополимерной геномной ДНК клеточных культур 95
Анализ стабильно-трансфицированных культур РС12 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) 95
Изучение дифференцировки РС12 клеток 96
Анализ пролиферации клеток PC 12 96
Изучение апоптоза в трансфицированных культурах клеток РС12 97
Получение антител, использованных в работе 97
Выделение белковых гомогенатов из культур клеток РС12, глиальных и нейрональных культур. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг 98
Анализ количества фосфорилированной формы МАР-киназы с помощью иммуиоблотинга 99
Определение активности холинацетилтрансферазы 99
Оценка уровня экспрессии мРНК нейротрофинов в культуре глии 100
Оценка уровня экспрессии trkB мРНК в первичных культурах глиальных клеток 102
Оценка уровня экспрессии мРНК для bdnfn trkB in vivo 103
Определение уровня BDNF в отделах мозга крысы in vivo 107
Статистистическая оценка результатов 108
Результаты и их обсуждение 109
Связывание Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы 109
Деградация Семакса в присутствии плазматических мембран, культивируемых нейронов и глии базальных ядер переднего мозга крысы 114
Влияние Семакса на пролиферацию глии базальных ядер переднего мозга крысы in vitro 119
Влияние Семакса на выживаемость культивируемых нейронов, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы 121
Влияние Семакса на выживаемость тирозингидроксилаза-положителъных нейронов, полученных из среднего мозга эмбрионов крысы 127
Исследование нейропротекторных эффектов Семакса в клеточных моделях индуцированной нейротоксичности 127
Модель гибели дофаминергических нейронов in vitro, индуцированной 6ГДА 129
Пресенилиновая» клеточная модель болезни Альцгеймера 130
Влияние а-МСГ на уровень BDNF в первичных нейрональных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс 146
Влияние Семакса на экспрессию мРНК BDNF и NGF в культуре глиальных клеток. полученных из базальных ядер переднего мозга крысы 146
Влияние Семакса на уровень BDNF в базальных ядрах переднего мозга крысы in vivo 148
Влияние Семакса на экспрессию BDNF в гипяокампе. мозжечке и коре больших полушарий мозга крысы in, vivo 150
Влияние Семакса на экспрессию TrkB в гиппокампе крысы 162
Возможный механизм действия Семакса в ЦНС 165
Семакс в качестве лекарственного препарата для лечения нейродегенеративных заболеваний (ишемический инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Шркинсона) 172
Клеточная система для тестирования соединений с потенциальной нейропротекториой активностью 176
Заключение 178
Выводы 180
- Меланокортины как нейропептиды
- Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции
- Функции генов пресенилииов
- Выделение белковых гомогенатов из культур клеток РС12, глиальных и нейрональных культур. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг
Введение к работе
Создание новых эффективных и безопасных фармакологических средств для повышения эффективности умственного труда в сложных условиях и коррекции патологий центральной нервной системы (ЦНС), включающих пейродегснеративные заболевания, особенно актуально в современную эпоху, которая характеризуется повышением влияния стрессогеиных факторов на организм человека, а также ухудшением экологической обстановки во многих областях земного шара. Длительное психическое напряжение, сопряженное с указанными выше факторами, постоянно сопровождает многие современные сферы деятельности человека, несмотря на постоянное совершенствование их технического обеспечения, и приводит к повреждению и гибели нервных клеток. Развитие нейродегенеративных процессов в ЦНС также связано с различными патологиями, наследственной предрасположенностью и черепно-мозговыми травмами, Доля нейродегенеративных заболеваний в общей структуре заболеваемости возрастает при увеличении продолжительности жизни [197]. Наиболее распространенными являются болезнь Альцгеймера [8,9,190] и инсульты [13]. Инсульты, по нашему мнению, могут быть отнесены к нейродегенеративным заболеваниям в связи с массовой гибелью клеток, в частности нейронов, в ЦНС. В настоящее время количество людей в мире, страдающих болезнью Альцгеймера, составляет по разным оценкам до 10 миллионов человек. По прогнозам, в случае, если ученые не найдут средство против этой болезни, уже через 25 лет от этого недуга будут страдать 22 миллиона жителей нашей планеты, а через 50 лет - примерно 45 миллионов [190,197]. Сходная ситуация и с инсультами. Ежегодно в мире переносят инсульт около 6 миллионов человек, умирает 4,7 миллиона. В России в год регистрируется до 450 тысяч инсультов, причем большинство из них относятся к тяжелой и средней степени тяжести [13]. Лишь около 20% выживших больных могут вернуться к прежней работе.
Современная медицина располагает довольно широким перечнем соединений, обладающих определенным нейропротекториым действием, таких как модуляторы ионных каналов, соединения с анти-эксайтотоксическим действием, противовоспалительные агенты, соединения, понижающие уровень свободных радикалов, нейротрофические факторы [13.197]. Однако ни одно из них не сочетает одновременно высокую эффективность, длительность действия, быстроту наступления эффекта и отсутствие негативных последействий. Большие надежды на успехи в лечении инсультов, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний связывают в перспективе с клеточной и генной терапией [28,29].
В поисках более эффективных и одновременно безопасных средств ученые обращаются к возможному использованию эндогенных регуляторов организма или близких их аналогов. В первую очередь внимание исследователей привлекают регуляторные пептиды (РП). Открытые еще в прошлом веке, они являются, как сейчас становится понятным, прямыми или опосредованными универсальными регуляторами всех физиологических процессов протекающих в живом организме. Общепринятым является представление о так называемом функциональном континууме РП [4,185,186]. Согласно этой концепции физиологическая функция модулируется достаточно большим количеством РП, как родственных по структуре, так и относящихся к разным семействам; в то же время каждый РП способен модулировать очень большой, хотя и вполне определенный спектр функций. Трактовка эффектов РП осложняется обстоятельством, что, кроме прямого действия, многие из них оказывают влияние на синтез других РП. При этом каждый РП сохраняет свою "индивидуальность", обладая в целом уникальным спектром биоактивности.
Все эти особенности системы РП позволяют выделить два принципиально важных направления реализации их лечебно-профилактического потенциала при коррекции различных патологий ЦНС, Во-первых, использование наиболее рациональных комплексов РП, сложившихся в процессе эволюции живых существ. Во-вторых, наиболее полное раскрытие и адекватное использование спектров активности каждого РП. Кроме исследования спектров активности РП, избранных для практической реализации, необходимо преодоление такого свойства большинства из них. как быстрота их распада во внутренних средах организма. Это требует создания стабилизированных аналогов соответствующих РП, либо создания пептидомиметиков (близких по действию непептидных соединений) [20].
Одним из интересных и перспективных РП являются пептиды семейства меланокортинов, которые включают N-концевые фрагменты адренокортикотроппого гормона, альфа-, бета-, гамма- меланоцитстимулирующие гормоны (МСГ) и их синтетические аналоги. Изучение функций этих пептидов выявило наличие у них способности модулировать такие процессы ЦНС как обучение, формирование памяти, внимание, а также различные формы поведения [93]. Кроме того, данные пептиды проявляют нейропротекторные и нейрорегенеративные активности как в центральной, так и в периферической нервной системе [45]. Таким образом, меланокортины проявляют комплекс ноотропных и иейротрофических свойств, что в совокупности со способностью некоторых из них проникать через гематоэнцефалический барьер делает данное пептидное семейство перспективным с точки зрения их медицинского применения.
Единственный клинически применяемый в настоящее время синтетический представитель семейства меланокортинов, Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), разработанный в Институте молекулярной генетики РАН В.Н. Незавибатько с сотр. [22,23] также проявляет аналогичный комплекс свойств. Исследование активности Семакса в экспериментах на животных выявило его способность стимулировать процессы обучения, внимания и запоминания, что нашло в дальнейшем подтверждение в клинических испытаниях Семакса, подтвердивших его способность стимулировать эти процессы и у человека. Клиническое применение Семакса («Семакс-0,1% раствор») выявило его эффективность при лечении травм мозга, расстройств внимания и обучения и ряда других заболеваний ЦНС различного происхождения [3].
Несмотря на имеющиеся сведения о иейротрофических свойствах меланокортинов и характеристике их рецепторов, механизмы их действия во многом остаются неясными [35,162,320]. Поэтому в настоящей работе основное внимание было уделено следующим аспектам:
1. Исследованию молекулярно-генетических механизмов действия аналогов меланокортинов (на примере пептида Семакс) на клетки ЦНС млекопитающих с целью создания на их основе фармакологических препаратов с нейропротекторной активностью, которые могут быть использованы для лечения инсультов и других нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Особое внимание было уделено взаимосвязи между эффектами меланокортинов и изменениями в уровне экспрессии генов ряда нейротрофических факторов: NGF (фактор роста нервов), BDNF (нейротрофический фактор, выделенный из мозга) в клетках ЦНС,
2. Созданию на основе как первичных клеточных культур, полученных из мозга млекопитающих, так и генетически модифицированных эукариотических клеток, модельных систем для скрининга соединений с потенциальной нейропротекторной активностью, представляющих фармакологический интерес.
Следует отметить, что эксперименты in vitro являются необходимой стадией в процессе создания лекарственных соединений и позволяют тестировать гораздо большее количество соединений, чем при проведении экспериментов непосредственно на животных сразу на первых стадиях создания препаратов. Использование генетически измененных или трансфицированных клеточных культур представляет собой удобную и весьма ценную модель как для изучения функций отдельных генов в клетке, так и в качестве систем, моделирующих различные заболевания человека in vitro. В настоящей работе представлены данные по созданию клеточной модели, имеющей отношение к процессам нейродегенерации, протекающей в мозге при развитии болезни Альцгеймера, с использованием нормального и мутантного гена пресенилина-1 (ps-Г) человека [293]. С мутациями в этом гене связывают возникновение существенной части случаев ранней семейной (наследственной) формы болезни Альцгеймера [40,293].
Актуальность настоящей работы связана с отсутствием в мировой клинической практике стандартизованных препаратов пептидной природы, способных предотвращать гибель нервных клеток (в частности нейронов различной ергичности) [133]. Кроме того, на наш взгляд, понимание молекулярных механизмов действия Семакса. как представителя семейства меланокортинов, а также разработка клеточных моделей для широкомасштабного скрининга соединений с потенциальной нейропротекторной активностью, не только расширит спектр его возможного применения в клинической практике, но и приведет в перспективе к созданию других эффективных нейропротекторов.
Меланокортины как нейропептиды
Начиная с 50-60-х годов прошлого века, благодаря работам де Вида (D. de Wied) началось интенсивное изучение нейроактивных свойств меланокортинов [91-93]. В 1950-60-х годах было показано, что АКТГ обладает не только к тому времени хорошо изученными эндокринными эффектами, но и способностью влиять на разные формы поведения животных [91]. Так, было продемонстрировано, что введение АКТГ может снимать чувство беспокойства [223], влияет на запоминание [231] и вызывает ряд других поведенческих реакций у животных. Влияние на поведение было затем показано и для а-МСГ [59] и для более коротких меланокортинов. С другой стороны, в дальнейшем было обнаружено, что и ГЮМК, и АКТГ, и фрагменты АКТГ (в том числе и а-МСГ) иммунохимически детектируются в мозге [249]. Более того, было обнаружено присутствие мРНК для проопиомеланокортина в ряде отделов мозга [123]. Эти данные позволили придти к выводу, что АКТГ и мелаыокортииы являются эндогенными по отношению к мозгу соединениями, и центральная нервная система не только служит мишенью для этих пептидов, но и может сама продуцировать их. Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих. Проблема места синтеза меланокортинов. Нормальный и поврежденный мозг Иммунохимическая локализация меланокортинов в основном проводилась с использованием антител к а-МСГ и АКТГ(4-10). Присутствие а-МСГ было обнаружено в мозге взрослой крысы, причем концентрации этого пептида в разных отделах мозга существенно различались [108]. Наибольшая концентрация а-МСГ обнаружена в гипоталамусе, а в пределах гипоталамуса - в аркуатном ядре. В остальных отделах мозга концентрация а-МСГ была на 1-2 порядка ниже (Таблица 1). Эксперименты на тканевых культурах показали, что нейроны аркуатного ядра синтезируют ПОМК [205]. Учитывая, что отростки нейронов аркуатного ядра гипоталамуса проникают в другие отделы мозга, можно предположить, что источником а-МСГ для них служит именно аркуатное ядро. Действительно, разрушение аркуатного ядра приводит к существенному снижению уровня а-МСГ в остальных отделах мозга, С другой стороны, при удалении гипофиза происходит снижение уровня а-МСГ в гипоталамусе [70]. Таблица 2. Уровень а-МСГ в различных отделах мозга крысы [108]. Таким образом, по-видимому, источником части а-МСГ в мозге служит гипофиз; можно также предположить и влияние гипофиза на процессы синтеза а-МСГ в гипоталамусе.
В пользу предположения о регуляции гипофизом синтеза в гипоталамусе предшественника меланокортинов недавно были получены дополнительные свидетельства - удаление части ПОМК-синтезирующих клеток гипофиза мыши приводило к увеличению уровня мРЫК для ПОМК в гипоталамусе [350]. Другим источником служит аркуатное ядро, что не исключает возможности синтеза а-МСГ (и других меланокортинов) в остальных отделах мозга. Так мРНК для ПОМК была обнаружена в гиппокампе и миндалине [123], сам ПОМК был обнаружен не только в аркуатном ядре, но и в дорсолатеральном гипоталамусе и среднем мозге [319]. В ходе эмбрионального развития ПОМК детектируется в гипоталамических нейронах эмбриона крысы, начиная со срока 12 дней, в то время как в гипофизе иммунореактивность к ПОМК регистрируется, лишь начиная с 15-16-го дня эмбрионального развития (Е15-16). Наибольший уровень иммунореактивности к ПОМК отмечается на 21-29 день постнатального развития [182]. Проводилось также исследование экспрессии ПОМК при развитии эмбрионов мыши [101]. Впервые ПОМК появляется в аркуатном ядре на сроке 10,5 дней развития эмбриона. В этот же срок ПОМК детектируется в нервных волокнах латерального и дорсального диэнцефалона. К сроку 11,5 дней развивается плотная сеть ПОМК-содержащйх нейритов, проникающая в мезэнцефалон. К этому же сроку ПОМК-содержащие нейриты обнаруживаются в миелэнцефалоне. К 12,5 дням ПОМК-содержащие волокна появляются в спинном мозге. Между 13,5 и 15,5 днями формируется профиль ПОМК-содержащих волокон, распространяющихся в диэнцефалон, мезэнцефалон, метэнцефалон и миелэнцефалон, соответствующий взрослому состоянию, Следует отметить, что ПОМК-содержащие клетки в гипофизе появляются позже, чем в аркуатном ядре (к 12,5 дню в передней доле и к 14,5 дню в промежуточной доле). Имеются данные о том, что в мозге эмбрионов мыши процессинг ПОМК с образованием а-МСГ начинается со срока 11,5 дней развития [267], В мозге человека наибольшая концентрация а-МСГ была также обнаружена в гипоталамусе, а в наибольшем количестве а-МСГ присутствует в черной субстанции. Интересно, что у больных болезнью Альцгеймера концентрация этого пептида в черной субстанции существенно снижена [46]. Объяснения этому феномену пока не предложено. АКТЦ4-Ї0) был иммунохимически обнаружен в мозге взрослой крысы только в волокнах аркуатного ядра и средней септальной области. Совершенно иная ситуация с распределением АКТГ(4-10) возникает при исследовании неонатального (то есть развивающегося) мозга: в нем АКТГ(4-10) обнаруживался как в аркуатном ядре и средней септальной области, так и в стриатуме, коре, гиппокампе, перивентрикулярной области.
При повреждении черной субстанции взрослой крысы АКТГ(4-10) обнаруживался в стриатуме и ряде других отделов мозга [45], Вопрос о происхождении АКТГ(4-10) практически не освещен в доступной литературе; в некоторых работах постулируется его протеолитическое выщепление из а-МСГ, на что указывает и похожее распределение этих пептидов в мозге [162]. Таким образом, из данных по экспрессии АКТЦ4-10) в мозге крысы следует, что, по-видимому, значение этого меланокортина в функционировании взрослого мозга весьма ограничено. Значительно более широкое распространение АКТГ(4-10) в неонатальном мозге свидетельствует о его роли в развитии ЦНС, а появление АКТГ(4-10) в отделах поврежденного мозга (по крайней мере, в рамках нигростриатной системы мозга) указывает на вероятное участие АКТГ(4-10) в процессах регенерации ЦНС. Общие трофические свойства мепанокортинов Наряду с изучением поведенческих и мнестических (ноотропных) эффектов меланокортинов происходило накопление данных о трофических эффектах меланокортинов. Так, было показано, что а-МСГ увеличивает вес эмбрионов, в то же время введение антител к этому пептиду ингибирует рост эмбриона и его мозга [122]. Подобные эффекты не наблюдались в случае постнаталыюго развития. Таким образом, а-МСГ проявляет общие трофические свойства лишь на стадии эмбрионального развития организма. Другие исследованные меланокортины: АКТГ(4-10) и Org 2766, не обладают столь глобальными трофическими активностями [122], Влияние меланокортинов на нейроны ЦНС Большую ценность для изучения нейротрофических активностей представляют исследования на моделях in vitro. На этих моделях были получены данные о влиянии меланокортинов на нейроны. Так, а-МСГ усиливает рост нейритов (примерно в 2 раза) и выживание нейронов в культуре нейронов спинного мозга крысы (14-й день развития) [257]. Аналогичные исследования на культуре срезов спинного мозга выявили 30-40-процентное дозозависимое влияние а-МСГ и АКТГ(4-10) на рост нейритов при концентрациях 10 12 - 10"11 М [321]. С использованием диссоциированных культур нейронов спинного мозга эмбрионов крысы было показано влияние а-МСГ (но не АКТГ(4-10) и Org 2776) на появление и рост нейритов при концентрациях выше 10" М и максимальным эффектом при 10"4 М [322]. Отмечено влияние меланокортинов, в том числе и их синтетических аналогов, на дифференцировку серотонинергических нейронов [52]. Меланокортины (а-МСГ) также способны влиять на дифференцировку дофамин ер гических нейронов и рост их нейритов [100].
Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции
Ген bdnf (рас. 5) [310] состоит из четырех коротких 5 -некодирующих экзопов (I- IV), каждый из которых содержит отдельный промотор, и одного З -концевого экзона (экзои V), кодирующего белок BDNF. Кроме того, каждый из четырех вариантов, полученных в результате альтернативного сплайсинга, подвергается полиаденилированию по одному из двух сайтов, расположенных в 3 области экзона V, Таким образом, получается 8 продуктов, кодирующих один и тот же белок (рис. 6). Смысл подобного разнообразия, по-видимому, состоит в том, что экспрессия BDNF таким образом может селективно регулироваться различными факторами и на нескольких уровнях, что обеспечивает большую гибкость в контроле скорости и величине ответа на то или иное воздействие, приводящее к усилению экспрессии белка BDNF. Ген bdnf считается геном раннего ответа (IEG), то есть в ответ на стимул происходит быстрая инициация транскрипции этого гена, не требующая синтеза белка de novo, а в результате посттрансляционной модификации предсуществующих факторов транскрипции. В нейронах рецепция нейротрансмиттера и деполяризация мембраны приводит к открытию лиганд- и потенциал-зависимых кальциевых каналов, что способствует входу кальция в клетку [292]. Кальций, быстро связываясь с соответствующими белками, запускает каскады передачи сигнала в ядро клетки, В ядре, в промоторе гена bdnf транскрипционный фактор CREB, связанный с последовательностью CRE. находится в неактивном состоянии. Кальций-зависимые протеинкиназы фосфорилируют CREB по остатку Ser-ІЗЗ, что запускает транскрипцию мРНК для BDNF. Однако, мутационный анализ промотора bdnf выявил наличие дополнительных элементов, необходимых для кальций-зависимой транскрипции bdnf и отличных от CREB. Регуляторные последовательности, контролирующие транскрипцию, находятся обычно в последовательности ДНК, фланкирующей 5 -конец начального экзона. Для гена bdnf таких экзонов четыре. Транскрипты, содержащие экзоны I, II и III, экспрессируются в мозге, тогда как экзон IV обнаружен вне мозга. Экзоны I и III индуцируются при судорожной активности во взрослом мозге [316]. Данные, полученные с помощью ОТ-ПЦР показали, что при деполяризации мембраны эмбриональных нейронов коры in vitro происходит транскрипция, главным образом, экзона III. Причем этот процесс не останавливается при добавлении в культуру циклогексемида, блокирующего синтез белка. Это говорит о том, что транскрипция экзона III запускается за счет посттранскрипционной модификации уже существующих факторов транскрипции [317].
Для определения роли регуляторных элементов в транскрипции гена bdnf осуществлялся делециоиный анализ и направленный мутагенез промоторной области экзона III [311,329]. Это позволило выявить наличие последовательности CRE за 35 п.н. до точки начала транскрипции. Дальнейший анализ промоторной области показал, что CREB является необходимым, но недостаточным фактором для запуска транскрипции. Найдены еще два элемента ДНК, регулирующие транскрипцию экзона III гена bdnf. Проксимальный элемент (-52-43) содержит последовательность Е-box и связывает белок, принадлежащий к семейству транскрипционных факторов типа спираль-петля-спираль (helix-loop-helix). Дистальный элемент (-73-64) (5 -CTATTTCGAG-3 ) не принадлежит ни к одной из известных регуляторных последовательностей. С ним связывается белок, названный CaRF (calcium response factor). Таким образом, экзон III гена k/и/находится под регуляцией трех различных последовательностей, зависящих от ионов кальция (CaRE). Причем, мутация любого из них практически полностью прекращает транскрипцию bdnf зависящую от ионов кальция. То есть, для запуска транскрипции требуется несколько сигнальных событий, которые приведут к совместной активации всех трех факторов. Это, по-видимому, повышает порог сигнала, необходимого для запуска транскрипции bdnf, делая этот процесс более специфичным. Кроме того, было показано, что транскрипция гена bdnf также находится под контролем другого транскрипционного фактора Fos [58,103,220,300]. Приведенные выше данные свидетельствуют о том. что экспрессия гена bdnf в ЦНС находится под сложным контролем различных внутри- и внеклеточных факторов, Рецепторы для BDNF Связывание нейротрофина с Trk-рецепторами вызывает их активацию путем лиганд-индуцированной димеризации рецептора и автофосфорилировапия внутриклеточных остатков тирозина [285]. Активированный рецептор способен фосфорилировать несколько внутриклеточных мишеней [289]. К белкам, которые активируются автофосфорилированным Trk-рецептором, относятся фосфолипаза С1-у, адапторные белки She, rAPS и SH2, фосфатидилинозитол-3 киназа (РТЗК), Fyn, протеинтирозинкиназа, вовлеченная в регуляцию клеточной адгезии и синаптической пластичности и некоторые другие молекулы. В свою очередь, активированные белки запускают Ras/MAPK-каскад и фосфорилирование киназ, регулируемых внешними сигналами (ERKs), что приводит к увеличению концентрации кальция внутри клетки и последующей активации кальций/кальмодулин-зависимых киназ и казеинкиназы 2, фосфорилированиго транскрипционного фактора CREB и дальнейшей активации экспрессии различных генов [114,169,245,262,307].
Кроме того, как и все нейротрофины, BDNF связывается с Р75-рецепторами и, действуя через этот рецептор, может запускать программированную гибель клетки. Предполагается также, что именно через Р75 осуществляется ретроградный аксональный транспорт BDNF и NT-4 [84]. Суточные колебания уровня BDNF В течение суток уровень BDNF в мозге крысы испытывает значительные изменения. Впервые наличие суточных колебаний в экспрессии мРНК для BDNF и мРНК для TrkB было обнаружено во фронтальной коре и гиппокампе [68]. Самые высокие концентрации мРНК для BDNF отмечаются в ночные часы, и уровень в 20:00 выше уровня в 8:00 в 1,65 раза. В гиппокампе наблюдались еще большие колебания: уровень мРНК для BDNF в 20:00 выше, чем в 12:00 в 3,46 раза. То есть самые высокие концентрации мРНК зафиксированы после выключения света (19:00), а самые низкие - после включения (7:00). Варьирует и экспрессия TrkB мРНК. Во фронтальной коре минимальный уровень наблюдался в 24:00, а максимальный - в 12:00 с разницей в 5,14 раза. В гиппокампе минимум экспрессии TrkB мРНК отмечен в 18:00, а максимум - в 8:00 с разницей в 17,44 раза. Авторы связывают эти вариации уровней мРНК с физиологическими колебаниями активности животных. Методом гибридизации in situ на популяциях нейронов из разных областей гипиокампа крысы изучалась экспрессия мРНК для BDNF во время активного периода (темный цикл) и пассивного периода (светлый цикл) [60]. Крыс декапитировали через временные промежутки в 6 часов (12:00, 18:00, 24:00, 6:00). Точки 12:00 и 18:00 соответствовали середине и концу неактивного периода, а точки 24:00 и 6:00 - середине и концу активного. Было показано, что уровень мРНК для BDNF в гиппокампе минимален в 12:00, а затем повышается, достигая максимума в 6:00 (12;00 18:00 24:00 6:00). В результате были выявлены эндогенные колебания мРРІК для BDNF в пирамидных клетках СА1 и САЗ областей гиппокампа, а также в воротных нейронах. Экспрессия мРНК для BDNF низкая во время светлого цикла (пассивный период) и повышается во время темного цикла (активный период) на 180% в СА1, на 170% в САЗ, на 153%) в воротах, на 145% в зубчатой извилине относительно уровней в 12:00. Ранее было показано, что физическая активность увеличивает уровень мРНК для BDNF [181,236,237]. Кроме того, стимуляция светом, а также стимуляция усов животного приводит к подъему уровня BDNF в коре [76,269], а помещение животных в новую обстановку увеличивает уровень мРНК в гиппокампе [ПО]. Таким образом, регуляция экспрессии белка BDNF зависит от активности животного и реакции на средовые воздействия.
Функции генов пресенилииов
У человека идентифицировано 2 гена пресенилинов: PS1, локализованный на 14-й хромосоме (14q24.3) и PS2, локализованный на 1-й хромосоме (Iq31-q42). Гены пресенилинов кодируют белки с множественными трансмембранными доменами, состоящими из 467 и 448 а,о., соответственно. Существует несколько структурных моделей PS, по одной из которых, белок состоит из 8 трансмембранных доменов, между трансмембранными доменами VI и VII находится гидрофильная "петля", N- и С- гидрофильные концевые части и "петля" ориентированы в цитоплазму. Кроме того, выделяют два гидрофобных околомембранных домена после трансмембранных доменов VI и VIII (рис. 9) [198]. Показано, что в трансфицированных клеточных культурах и тканях мозга, пресенилин 1 подвергается быстрому эндопротеолизу и детектируется в виде двух основных фрагментов: N-домена 27-28 кДа и С-домена 16-17 кДа [314]. Кроме того, в процессе созревания пресенилины фосфор илируются по сериновым остаткам [287,327]. Белки пресенилинов эволюционно консервативны. Они были обнаружены во множестве организмов: у простейших (Dyctiostellium discoideum), растений (Arabidopsis thaliana), беспозвоночных (Drosophila melanogaster Caenorhabditis elegans, Helix lucorum) и позвоночных (Rana temporana, Mus musculm, Homo sapiens). Пресенилины не найдены в геноме бактерий и грибов. При выравнивании белковых последовательностей различных организмов выделяются наиболее консервативные области вокруг двух аспартатов трансмембранных доменов VI и VII, и С-концевой PAL -мотив. Было показано, что эти области критически важны для функций пресенилинов (см. ниже). Функции пресенилинов разнообразны и во многом не известны. Недавно установлено участие пресенилинов в протеолизе мембранных белков. Кроме того, показано, что пресенилины участвуют в регуляции WNT/p-катенинового сигнального пути, кальциевом обмене и, возможно, в сегрегации хромосом в митозе [199,216,228]. Участие пресенилинов в апоптозе клеток Может ли причиной гибели нейронов при болезни Альцгеймера быть апоптоз, в настоящее время является предметом дискуссий. В некоторых работах, в тканях мозга пациентов с болезнью Альцгеймера, был найден ряд специфических морфологических и биохимических изменений в клетках - конденсация хроматина, фрагментация ДНК, нарушение Са2+ гомеостаза и функций митохондрий, оксидативный стресс, активация каспаз и др. [56,98,306]. В других работах таких эффектов не было обнаружено.
Следует отметить, что сопоставление результатов при прямом исследовании постмортального материала является затруднительным, т.к. начальные этапы неиродегенерации и разные стадии деменции могут варьировать и влиять на результаты исследования. В связи с этим целесообразным представляется прямое исследование моделей клеточных линий, экспрессирующих мутантные и нормальные формы генов болезни Альцгеймера. Экспрессия АРР как с мутациями, приводящими к развитию болезни Альцгеймера, так и без них, вызывала апоптоз в трансфицированных клеточных линиях [241,339,340]. Индукция апоптоза [47,170,328] или повышенная чувствительность к различным апоптотическим стимулам (депривации по трофическим факторам, оксидативному стрессу, действию )3-амилоида) [89,142-145,334] показаны в культурах с гиперэкспрессией ряда мутантных форм генов hPSl и hPS2. При изучении knock-in трансгенных мышей с экспрессией мутантных форм пресенилина 1 на эндогенном уровне, было также показано, что мутация M146V увеличивала чувствительность нейронов гиппокампа к апоптозу [146]. Основными причинами неиродегенерации при болезни Альцгеймера на сегодня считается накопление токсичного пептида А342, оксидативный стресс, нарушение Са2+ обмена, воспалительный процесс при участии цитокинов, наблюдаемое повышение чувствительности клеток к действшо факторов, вызывающих апоптоз и некроз [217]. При изучении механизмов апоптоза было показано, что мутации в пресенилине 1 приводят к нарушению стабильности комплексов PS1 с р-катенином, возможно защищающим клетки от негативного действия А[342 [348]. При экспрессии мутантных форм hPSl происходит таюке накопление внутриклеточного Са2+ как напрямую, так и опосредовано, через изменение протеолиза АРР [158]. В ряде работ по изучению апоптоза в модельных системах болезни Альцгеймера были получены негативные данные. Так, при knock-in мутантной формы гена hPSl, кодирующей ак-замену P264L, у трансгенных мышей не изменялась чувствительность нейронов кортекса к апо птозу [297]. В работе на первичных культурах нейронов кортекса гиперэкспрессия генов hPSl дикого типа или кодирующего белок с мутацией, встречающейся при болезни Альцгеймера, А246Е, не вызывала апоптоз, а напротив, играла протективную роль в отношении факторов, вызывающих апоптоз [72]. Гиперэкспрессия нормальной или мутантной форм hPS2 в различных клеточных культурах (N2а, СНО, НЕК293Т) не вызывала ни апоптоза, ни чувствительности к факторам апоптоза [121]. При экспрессии нормальных и мутантных форм гена пресенилина в модели трансгенных D. mdanogaster, апоптоз детектировали только при значительном увеличении числа копий генов - усилении экспрессии экзогенного hPSl [344].
Отличия в получаемых результатах, возможно, объясняются выбором типа клеток, уровнем экспрессии вносимых генов, различным действием мутаций, вызывающих болезнь Альцгеймера и др., что требует дальнейшего исследования. В работе использовали следующие реагенты; L-глутамип, MEM, F12, DMEM, эмбриональную, сыворотку коровы («ICN», США), сахарозу, BSA, SDS, EDTA, NaOH, Na2C03, Na2HP04, NaCl, PPO, POPOP, бензамидин, PMSF, BDNF, Трис, инсулин, трансферрин, прогестерон, иутресцин, Na2SeC 3, трифторуксусную кислоту, гептафтормаслянуїо кислоту, трихлоруксусную кислоту, ацетонитрил, полиэтиленимин, D-глюкоза, L-глутамин, апротинин, лейпептин («Sigma-Aldrich». США), CuS04, параформальдегид, Ca-Na-тартрат, соляную кислоту, толуол («Реахим», Россия), СаСЬ, реактив Фолина, тритон Х-100 («Merck», Германия), («Ferak Berlin»). Для работ с культурами клеток разного происхождения использовали пластиковую культуральную посуду фирм «Nunc» (Дания) и «Costar» (США). Фирмы-производители других использованных в работе материалов и реагентов указаны в соответствующих разделах. Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса и других пептидов Синтез гептапептида Семакс его аналогов и фрагментов проводилось в Отделе химии физиологически активных веществ (ОХФАВ) ИМГ РАН. Чистота препаратов проверялась методами тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ. Использовались препараты с чистотой не менее 99%. Меченный тритием Семакс (мечеиие проводилось в ОХФАВ) имел удельную радиоактивность 60-120 Ки/ммоль и хранился в 50%» водно-этанольном растворе при -20 С. Немеченныи Семакс и другие пептиды хранились в виде 1-5 мМ растворов в воде стандарта чистоты «Milli-Q» или в PBS при -70 С. Стерильные растворы пептидов получали фильтрованием через ацетат-целлюлозные фильтры (0,22 мкм) («Costar», США). Растворы пептидов после размораживания хранили при 4С и использовали в течение 24 ч. В качестве контролей использовали эквивалентный объем воды или PBS. Выделение плазматических мембран мозга Выделение плазматических мембран мозга проводили по методу Грэя и Виттакера с некоторыми модификациями [136]. Крыс линии Вистар (самцы) массой 200-250 г декапитировали, извлеченные базальные ядра переднего мозга промывали PBS (10 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl, рН 7,4) и гомогенизировали в 10 объемах 10 мМ Трис-HCl (рН 7,4), содержавшего 0,32 М сахарозу, 1 мМ EDTA, 1 мМ бензамидин и 0,1 мМ PMSF (буфер А) в гомогенизаторе тефлон-стекло. Гомогенизацию и все последующие операции проводили при температуре 4С. Гомогенат центрифугировали в течение 20 мин при 1000 g, осадок отбрасывали, а сулернатант подвергали повторному центрифугированию при 40000 g в течение 30 мин.
Выделение белковых гомогенатов из культур клеток РС12, глиальных и нейрональных культур. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг
Анализируемый белок выделяли из трансфицированных и контрольных клеток. Клетки млекопитающих (5-Ю млн.) снимали с подложки механически и осаждали центрифугированием в течение 5 мин. при 1000 об/мин. Осадок отмывали дважды путем ресуспендирования в 7 мл буфера PBS (137 мМ NaCI, 2,7 мМ KCI, 1,5 мМ КН2РО4, 8 мМ Na2HP04) и последующего центрифугирования (5 мин, 1000 об/мин). Затем осадок ресуспендировали в RIPA-буфере (10 мМ Трио НС1, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА), содержавшем ингибиторы протеаз (1 мМ бензамидин, 50 мкг/мл PMSF, 1 мкг/мл апротинина) из расчета 75 мкл на 10 млн. клеток и лизировали с помощью 3-кратного замораживания-оттаивания. Для механического разрушения мембраны клеточный лизат 12-15 раз пропускали через иглу Гамильтоновского микрошприца, добавляя на 10 млн. клеток по 25 мкл RJPA-буфера с детергентами (до конечной концентрации 0,1% SDS, 1% Тритон Х-100, 1% дезоксихолат Na) и инкубировали в течение ночи при 4С. Пробирку с гомогенатом центрифугировали в течение 1 ч при 14000 об/мин при 4С. Надосадочпуго жидкость переносили в чистую пробирку и хранили в кельвинаторе при -70С. Определение количества тотального белка в клеточных гомогенатах проводили с помощью метода Лоури в модификации Петерсона [256], используя в качестве стандарта BSA (Sigma, США). Электрофоретическое разделение проводили в 10-12% ПААГ. На каждую дорожку наносили по 30 мкг белка. Использовали камеру для электрофореза и оборудование для приготовления гелей фирмы «Hoeffer Scientific Instruments». После электрофоретического разделения белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL («Amersham») с помощью прибора Bio-Rad при 0,8 мА/см2 в течение 90 мин в буфере для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин и 15% метанол, рН 8,3). Для детекции белковых полос на нитроцеллюлозной мембране использовали первичные антитела к N-концевой части PS1 (а.о. 1-92). В качестве вторых антител применяли антитела против IgG кролика коньюгированные с пероксидазой хрена («Amersham»). Визуализацию комплексов проводили с использованием набора ECL («Amersham»). Анализ количества фосфорилированной формы МАР-киназы с помощью иммуноблотипга Определение количества фосфорилированной формы MAP киназы (р44/42) проводили в первичных нервных и глиальиых клетках, полученных из мозга крысы, с помощью иммуноблотинга как описано ранее [58].
Определение активности холинацетилтрансферазы Активность холинацетилтрансферазы измеряли, как было описано ранее [214]. Клетки собирали с 2-луночных плашек в 10 мкл буфера, содержавшего 0,5% (в/в) Тритона Х-100 в 10 мМ ЭДТА, рН 7,4. Клетки разрушали замораживанием-оттаиванием, и 2 мкл клеточного гомогената добавляли к 5 мкл среды инкубации. Реакционная среда (конечный объем 7 мкл) содержала: 50 мМ фосфат натрия, 20 мМ ЭДТА, 300 мМ NaCI, 8 мМ холиибромид, ОД мМ фигостигмин и 0,2 мМ [ С]-ацетил-СоА (100000 распадов/мин), рН 7,4. Пробы инкубировали 1 ч при 37С. Реакцию останавливали добавлением 5 мл 10 мМ фосфата натрия, рН 7,4. Реакционные пробирки переносили в сцинтилляционные флаконы, в которые добавляли 10 мл смеси ацетонитрил/ECONOFLUR, и радиактивность считали на счетчике Mark-3 («Nuclear Chicago», США) с эффективностью 30%. Оценка уровня экспрессии мРНК нейротрофинов в культуре глии Клетки глии после третьего пересева засевали на обработанные поли-L-лизином 4-луночные планшеты (диаметр лунки 6 см) в 5 мл среды DMEM, содержавшей 15% ЭСК, 2 мМ L-глутамин и 100 мкг/мл гентамицина, и после образования клеточного монослоя меняли среду на DMEM с 1% сыворотки и 2 мМ L-глутамином и 100 мкг/мл гентамицина. Через 48 ч в среду вносили 50 мкл стерильного раствора Семакса до указанной конечной концентрации или эквивалентный объем стерильной воды. В указанные промежутки времени культуральную среду отбирали и клетки промывали PBS (4С). Тотальную РНК выделяли фенол-хлороформной экстракцией с использованием набора Promega RNAgents Total RNA Isolation System («Promega», США), следуя методике и рекомендациям фирмы-производителя. После этанолыюго осаждения осадок РНК дважды промывали 70% этанолом и хранили при -70С. Для удаления возможной примеси геномной ДНК образцы РНК растворяли в обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC) воде и инкубировали 1 ч при 37С в присутствии ДНКазы, свободной от РНКаз. После дополнительной фенол-хлороформной экстракции РНК осаждали, промывали 70% этанолом, растворяли в обработанной DEPC воде и хранили при -70 С. Для проведения обратной транскрипции отбирали 2 мкг тотальной РНК и проводили реакцию 1 ч при 37С в 25 мкл среды, содержавшей 1 мкг oIigo(dT)]5 праймеров, 50 мМ Трис-НС1, 15 мМ (NH SO 5 мМ MgCI2, 0,01% желатины, 0,01% Tween-20, 0,2 мг/мл BSA, 5% глицерина, 2 мкМ dNTPs, 30 ед. ингибитора РНКазы (Fermetas) и 50 U Moloney Murine Leukemia Virus (М-МЬУ)-обратной траискриптазы ("Синтол", Россия).
После инкубации в течение 10 мин при 95С образцы кДНК замораживали и хранили при -20С. С полученными образцами кДНК проводили амплификацию, используя следующие праймеры и условия: Р-аАТР с помощью Т4-полинуклеотидкиназы («Силекс», Россия), 5 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTPs, 50 мМ Трис-НС1, 15 мМ (NH4)2S04, 5 мМ MgCl2, 0,01% желатины, 0,01% Tween-20, 0,2 мг/мл BSA, 5% глицерина. После начальной денатурации в течение 5 мин при 94С, в реакционную смесь вводили 2,5 Ед. Taq-полимеразы («Силекс», Россия) и после 28 циклов (число циклов соответствовало линейной зависимости количества продукта от количества исходной кДНК), и последующей инкубации в течение 10 мин при 72С, продукты разделяли в 8% неденатурирующем полиакриламидном геле в присутствии бромистого этидия. Полосы, соответствующие продуктам амплификации, вырезали и определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике "Mark-3" (Nuclear Chicago, США). Все образцы тестировались в трех параллелях. Полученные относительные количества продуктов для NGF и BDNF нормализовали по относительному количеству продукта для Р -актина. Оценка уровня экспрессии trkB мРНК в первичных культурах глиальных клеток Клетки глин гиппокампа двухдневной крысы после третьего пассажа засевали на обработанные полиорнитином 6-луночные планшеты в 5 мл среды DMEM, содержавшей 15% ЭСК и 100 мкг/мл гентамицина, и после образования примерно 80%-иого монослоя меняли среду на DMEM с 1% сыворотки. Через 48 ч в среду вносили 50 мкл раствора Семакса до указанной конечной концентрации или эквивалентный объем воды. Через 24 ч культуральнуго среду отбирали и промывали PBS (4С). Выделение РНК, обратную транскрипцию и определение уровня экспрессии мРНК для TrkB проводили аналогично описанному в предыдущем разделе. Оценка уровня экспрессии мРНК для bdn/и trkB in vivo Использовали самцов крыс линии Вистар, массой 250-300 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище и 12-ти часовым циклом освещения (включение света в 9:00, выключение - в 21:00). Были созданы все условия для минимизации стрессовых воздействий на животных. Животных содержали в клетках по 6 штук, таким образом, что каждая клетка содержала представителей и контрольных, и экспериментальных животных. Семакс вводили интраназально в объеме 100 мкл/кг массы тела животного однократно с 10:00 до 12:00. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. В каждой группе было по 4 животных. В указанные промежутки времени крыс забивали декапитацией, и сразу после этого выделяли исследуемые отделы мозга. Ткань помещали в консервирующий раствор EverFresh SOLID («Клоногеи», Россия) и хранили при 4С в течение 1 недели.
