Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние комплексных заболеваний проблемы картирования
1.1. Основные проблемы генетического картирования комплексных заболеваний 11
1.2. Современное состояние картирования генов заболеваний шизофренического спектра 14
1.2.1. Нейробиологические исследования 15
1.2.2. Ассоциативные исследования 19
1.2.3. Поиски генетических сцеплений шизофрении 21
Глава 2. Материал и методы 31
2.1. Краткая историческая и этногенетическая характеристика Дагестана 31
2.2. Методы исследования 36
2.2.1. Генетико-демографические методы изучения обследованных изолированных популяций 36
2.2.2. Молекулярно-генетические методы исследования в изолятах 39
2.2.3. Методы клинических исследований 42
2.2.4. Генетико-статистические методы анализа экспериментального материала 45
Результаты и обсуждение 51
Глава 3. Отбор популяций для картирования генов изучаемых заболеваний 51
3.1. Отбор генетических изолятов с агрегацией больных шизофреническим спектром заболеваний 51
3.2. Генетико-демографическая характеристика изолятов с агрегацией заболеваний шизофренического спектра 62
3.3. Генетическая и демографическая структура родословных 73
3.4. Влияние инбридинга на накопление и проявление изучаемых клинических фенотипов 78
Глава 4. Анализ сцепления геномных маркеров с заболеваниями шизофренического спектра 90
4.1. Анализ гаплотипов в отягощенных родословных 90
4.2. Непараметрический и параметрический анализы сцепления
геномных маркеров с изучаемым клиническим фенотипом 107
4.2.1. Непараметрический анализ генетического сцепления НО
4.2.2. Параметрический анализ генетического сцепления 113
4.3. Кросс - популяционный анализ генетических сцеплений 121
Заключение 125
Выводы 126
Список литературы 128
Приложение 152
- Основные проблемы генетического картирования комплексных заболеваний
- Краткая историческая и этногенетическая характеристика Дагестана
- Отбор генетических изолятов с агрегацией больных шизофреническим спектром заболеваний
- Анализ гаплотипов в отягощенных родословных
Введение к работе
СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ
КОМПЛЕКСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ПРОБЛЕМЫ КАРТИРОВАНИЯ
Основные проблемы генетического картирования комплексных заболеваний
К числу основных трудностей генетического картирования генов комплексных заболеваний, из-за которых успехи в этой области науки еще не столь велики, относят следующие [Kruglyak, 1997; Terwilliger, Ott, 1994; Пузырев, Степанов, 1997]:
Генетическая гетерогенность. Один и тот же клинический фенотип может быть обусловлен мутациями разных генов. Например, мутация, нарушающая функцию любого из генов, контролирующих определенную метаболическую цепочку, может привести к отсутствию или уменьшению концентрации конечного продукта этой цепочки, что обусловит один и тот же клинический фенотип. Генетическая гетерогенность характерна для многих комплексных заболеваний человека. Однако для некоторых болезней степень гетерогенности может быть очень высокой. Например, показано, что пигментный ретинит может быть следствием мутаций, по меньшей мере, 14 различных генов, а болезнь Целльвегера - 13. Следствием такой генетической гетерогенности для картирования генов является то, что болезнь может оказаться сцепленной с определенным генетическим маркером в одной родословной и совершенно с другим - в другой. От собственно генетической гетерогенности (гетерогенности локусов) следует отличать аллельную гетерогенность, когда различные мутации внутри одного генетического локуса затрагивают одну и ту же функцию, но в разной степени и с разными клиническими последствиями. Так, "тяжелые" мутации гена дистрофина проявляются клиническим фенотипом миодистрофии Дюшенна, а более "лёгкие" - миодистрофии Беккера [Пузырев, Степанов, 1997].
Неполная пенетрантность. Следствием неполной пенетрантности, характерной для всех комплексных заболеваний, является то, что отличный от нормы фенотип демонстрируют не все носители мутантного генотипа. Мутантный ген может проявиться клиническим фенотипом лишь с определенной, отличной от единицы, вероятностью. Эта вероятность может определяться как генетическим окружением ("фоном"), так и средовыми влияниями.
Наличие фенокопий. Клинический фенотип может проявиться у носителей нормального генотипа по причинам не генетических, а средовых факторов.
Неменделевские механизмы передачи генетической информации. В последние годы стало очевидно, что наследование по Менделю - лишь один из вариантов механизма передачи генетической информации. Сейчас описано множество болезней, в основе которых лежат: митохондриальное наследование (офтальмонейропатия Лебера, митохондриальная миопатия, синдром Кернса-Сайра и др.); экспансия тринуклеотидных повторов (синдром фражильной Х-хромосомы, миотоническая дистрофия и др.); явление геномного импринтинга (синдром Прадера-Вилли/Ангельмана, синдром Видемана-Беквитта, синдром Сильвера-Рассела).
Высокая частота в популяции аллеля, сцепленного с болезнью. Нежелательные последствия высокой частоты аллеля для картирования заключаются в том, что в родословной может присутствовать несколько копий одного и того же аллеля, но разного происхождения [Terwilliger, Ott, 1994; Пузырев, Степанов, 1997]. Например, попытки картировать ген болезни Альцгеймера методом анализа сцепления в родословных долгое время были неудачными. Причина этого стала очевидной, когда выяснилось, что основным генетическим фактором болезни является аллель Е4 гена аполипопротеина Е, который в европеоидных популяциях встречается с довольно высокой частотой (15-20%). Только дифференциация групп больных с относительно молодым возрастом манифестации данного заболевания, позволила установить конкретный генотип, обуславливающий данный клинический фенотип.
Клиническая гетерогенность. Достоверное определение клинического фенотипа является ключевым в картировании генов заболеваний. Ошибки в клинической диагностике, особенно характерные для психических заболеваний, которые исследуются с помощью интервью и интроспективных методик, могут привести как к гипердиагнозу, так и гиподиагнозу (фальш-негативной диагностике), что одинаково негативно сказывается на перспективе генетического картирования.
Таким образом, целый ряд объективных трудностей ждет исследователей при картировании генов комплексных заболеваний. Это требует поиска методологических путей, которые бы позволили минимизировать указанные проблемы при поиске генов таких заболеваний. При этом разные комплексные заболевания имеют некоторую специфику не только клинических фенотипов, но и в генетической и в средовой подверженности. В связи с этим, проблемы и состояние картирования генов заболеваний шизофренического спектра требуют более детального освещения, которое проводится в следующем разделе работы.
Краткая историческая и этногенетическая характеристика Дагестана
Дагестан отличается уникальной этнической пестротой на Кавказе: из 50 коренных народов Кавказа 26 являются народами Дагестана. Территория Дагестана занимает 50,3 тыс. кв. км и протянута с северо-запада на юго-восток вдоль Главного Кавказского хребта. В республике различают 3 географические зоны: горная, предгорная и равнинная. Равнинная зона преимущественно занимает весь север республики. 2/3 территории Дагестана - это высокогорные и горные районы. Наибольшая этническая пестрота отмечается в горной зоне. На востоке республика омывается Каспийским морем.
Археологические исследования показывают, что горная территория была заселена более 10 тыс. лет назад [Гаджиев, Шихсаидов, Давудов, 1996]. Здесь обнаружены памятники всех эпох, начиная с периода нижнего палеолита и кончая средневековьем [Котович, 1961].
В силу своего стратегически важного расположения Дагестан часто являлся объектом иноземных нашествий. Арабские завоевания этой территории относятся к VII-XII векам. После завоевания Дербента, Табасарана, Кайтага и Зирехгерана, которые были подвергнуты разгрому, арабы в первой половине VIII века вторглись в Средний Дагестан и дошли до Аварии, где до основания разорили Хунзах. Помимо насильственного насаждения ислама, арабы в Дагестане проводили грабительскую налоговую политику. Дальнейшая история народов Дагестана, связана с периодом татаро-монгольского нашествия и включением части Дагестана в состав Золотой Орды. Однако в горах татаро-монголам не удалось утвердить свою власть [Лавров, 1951].
Разорительными для Дагестана были нашествия Тамерлана в 1395г. Покорив Средний и Нагорный Дагестан, Тамерлан вернулся в Тарки, и отсюда он двинулся на Зирехгеран (Кубачи), а затем в Кайтаг, народ которого, по свидетельству историков, запросил о пощаде и потому был помилован. Из Кайтага Тамерлан пошел в Дербент, где приказал укрепить крепость, и ушел из пределов Дагестана. Хотя Тамерлан и недолго был в Дагестане, но это время тяжело отразилось на положении горцев. После смерти Тамерлана в Дагестане началось хозяйственное возрождение. В это время стали образовываться крупные населенные пункты путем слияния мелких аулов. Скудность пахотных и пастбищных земель, суровость природы, бедность края, недостаток земли и средств, получаемых от земледелия и животноводства, избыток рабочих рук и пр. способствовали развитию во многих горных аулах домашних промыслов и ремесел, а также - отходничества, при котором взрослая часть мужчин из аулов уезжали в поисках заработка в отдаленные регионы и города.
Горная зона Дагестана являлась центром наиболее прославленных промыслов: оружейного, ювелирного, кожевенного и суконного. Так, между соседними аулами Кубачи и Харбук сложилось своеобразное разделение труда в производстве металлических изделий. Харбук специализировался на изготовлении орудий труда и оружия, которые затем окончательно украшались в Кубачи. Таким же поставщиком для Кубачи было и селение Амузги, клинки которого считались лучшими в Дагестане.
Столица Дагестана город Махачкала является в настоящее время типичным крупным промышленным городом с характерной инфраструктурой, железной дорогой и внутригосударственными и международными авиалиниями. Численность населения г. Махачкалы по данным Всесоюзной переписи 1989 года - 349 тыс. чел. Этнический состав населения г. Махачкала в целом отражает таковой по республике. В Махачкале проживают представители всех коренных народов Дагестана, а также представители других этнических групп России. История возникновения данного города в Дагестане связана с именем Петра 1.
Заключенный в результате похода в 1723 году мир между Россией и Ираном постоянно нарушался. Почти 100 лет продолжалась борьба между Россией, Ираном и Турцией за господство на Кавказе и в Прикаспийском регионе. Однако и Российское царское правительство проводило на Кавказе жесткую колониальную политику, вызывавшую недовольство свободолюбивых горцев, которое все чаще выражалось в вооруженном сопротивлении отдельных аулов и общин, а в 1824 году переросло в общенародную национально-освободительную войну.
Изучение данных переписи 1897 года обнаруживает, что в то время население Дагестана различали не по национальностям, а по наречиям, т.е. по числу лиц, говорящих на конкретном наречии. В соответствии с этими данными, наиболее многочисленным в конце 19 века в Дагестане было население с авароандийским наречием (27,45% мужчин и 28,09% женщин), далее: даргинским (21,05% мужчин и 21,45% женщин), кюринским (15,79% мужчин и 17,32% женщин) и казикумухским (11,97% мужчин и 14,75% женщин). Затем значительное место приходится на тюркоязычные наречия. Все остальные языки и наречия были незначительны (ЦГА, ф. 22).
Отбор генетических изолятов с агрегацией больных шизофреническим спектром заболеваний
Отбор популяций, в рамках которых изучаются родословные (для анализа сцепления), или выборки не родственников (больных и здоровых, для анализа ассоциаций и неравновесия по сцеплению), имеет ключевое значение для результатов генетического анализа. Как известно, генетическая архитектоника комплексных фенотипов в большей мере зависит от генетической структуры конкретной популяции [Гинзбург, 1984; Гиндилис и др., 1989; Falconer, 1981; Животовский, 1984; Булаева, 1991; Jorde 2000]. Большинство исследований в данной области проводится в генетически гетерогенных популяциях США или Европы. Такая генетическая гетерогенность популяций, в рамках которых отбирается выборка больных или их родословные, создает значительные сложности в определении воспроизводимого генетического сцепления по многим причинам. Главными причинами являются генетическая гетерогенность самого заболевания и эффекты взаимодействия между генами множества основателей в родословной. Эффекты пенетрантности и фенокопий существенно выше в таких гетерогенных (аутбредных) популяциях из-за многообразия и динамичности средовых факторов, что также значительно затрудняет выявление генетических сцеплений и создает эффекты фальш-позитивных или фалып-негативных сцеплений и ассоциаций, в том числе, и из-за стратификации самих популяций.
Указанные трудности, свойственные генетике комплексных заболеваний, требуют четкой клинической диагностики заболеваний и тщательного изучения генетической и демографической структуры популяций, в которых проводятся исследования генетики таких болезней [Булаева, 1991; 2002; Bulayeva et al., 2000; 2005а]. Это обусловило поиск генетических гомогенных изолятов, в которых эффект родоначальника и дрейф генов способствовали высокой частоте гаплотипа с патогенным геном. Такие генетические процессы значительно облегчают выявление патогенных локусов в современном поколении больных [Kruglyak 1999; Terwilliger, Ott, 1994; Jorde et al., 1995; Peltonen, 2000].
Генетическая структура популяций человека в существенной степени обусловлена этнической подразделенностью [Cavalli-Sforza, Bodmer, 1971; Рычков, Яшук, 1985]. Этнически и географически подразделенные популяции человека, как правило, имеют ограниченное количество общих родоначальников и могут обладать спецификой генетической структуры. Как отмечал Т. Добжанский, «социальные преобразования влекут за собой генетические, так как определяют выбор брачных партнеров» [Dobzhansky, 1973]. Такие этнические популяции могут различаться редкими вариантами аллелей, которые обнаруживаются только в некоторых из них. Наряду с этим, следует иметь в виду, что генетические различия между популяциями человека существенно ниже и составляют всего 10-15% по сравнению с межиндивидуальными различиями внутри них (85-90%) [Lewontin, 1973]. Однако эти 10-15% межпопуляционной изменчивости представляют большой интерес для понимания проблем как этногеза и популяционной подразделенности, так и для генетико-эпидемиологических различий между изолятами при картировании генов комплексных заболеваний.
Исключительные возможности для идентификации генов комплексных заболеваний предоставляют генетические изоляты, основанные небольшим числом родоначальников и характеризующиеся стабильным тотальным объемом, брачной изоляцией и дрейфом генов в течение сотен поколений. В силу указанных специфических генетических процессов, в таких изолятах существенно снижается аллельная или локусная гетерогенность, что облегчает выявление генов подверженности данным заболеваниям [Kruglyak, 1997; Terwilliger, Ott, 1994; Jorde, 1995]. Эффективность таких изолятов для картирования генов комплексных заболеваний связана также с тем, что их историческое развитие происходит, как правило, в стабильных и зачастую экстремальных экологических условиях (пустыня или джунгли, высокогорье или Крайний Север). Это способствует снижению влияния факторов пенетрантности и фенокопий на проявление изучаемых комплексных заболеваний, затрудняющих установление генов подверженности [Jorde, 2000]. Чем выше степень генетической изоляции и более длительна демографическая история популяции, тем больше должна быть доля больных, унаследовавших гаплотип с патогенным локусом от общего предка. Соответственно, в таких изолятах возрастает вероятность того, что причиной выявленных сцеплений является физическое сцепление маркера с геном заболевания [Jorde, 2000].
Анализ гаплотипов в отягощенных родословных
Одним из преимуществ картирования генов комплексных заболеваний в генетических изолятах является высокая частота гаплотипа с патогенным локусом или аллелем, полученным современными поколениями больных от родоначальника. Эта повышенная частота гаплотипа родоначальника в изолятах может быть установлена при изучении полиморфизма локусов, необходимого для анализа генетического сцепления. Длительная изоляция таких популяций и особенности протекающих при этом генетических процессов были положены в основу концепции гомозиготного картирования (homozygosity mapping), согласно которой инбредные и гомозиготные больные получают гаплотип родоначальника без рекомбинаций [Smith, 1963; Lander, Botstein, 1986].
Как известно, гаплотип - это линейное расположение аллелей на хромосоме и потому задачей анализа гаплотипов является выявление аллельных комбинаций в гаметах, которые потомки получают от родителей. Наряду с этим, анализ гаплотипов помогает установлению ошибок генотипирования. Анализ гаплотипов важен и для определения случаев рекомбинаций, так как при этом появляется возможность установить отцовские и материнские гаметы и идентифицировать рекомбинации между маркерами и геном заболевания. Значимость данного анализа также в том, что он позволяет визуально определить изменения в участках гаплотипов (в результате рекомбинаций) между родственными или отдаленно родственными больными в родословной. Поэтому предварительный анализ гаплотипов до проведения анализа сцепления является целесообразным этапом в картировании генов комплексных болезней.
В связи с большим объемом геномных маркеров (около 400 маркеров для каждого обследованного члена родословных) в данном разделе работы приводится анализ гаплотипов на примере нескольких хромосом. Изучение гаплотипов проводилось с использованием программы «Анализ гаплотипов» (Haplotype analysis) из компьютерного пакета Simwalk 2. При этом анализе на базе обследованных и генотипированных ныне живущих больных и здоровых членов родословных восстанавливаются наиболее вероятные (правдоподобные) материнские и отцовские гаплотипы каждого индивидуума в предыдущих поколениях. Полученные результаты анализа гаплотипов вносили в родословные с использованием компьютерного пакета PROGENY. Рекомбинации внутри гаплотипа каждого члена родословной отмечаются в данном пакете специальным цветом.
Гаплотипы хромосомы 22:
На рисунке 10 приводится фрагмент родословной из изолята № 6005 с гаплотипами хромосомы 22. Все больные члены данной родословной имеют общих родоначальников и, как правило, являются потомками родственных браков. Приведенные результаты анализа показывают, что больные наследовали гаплотип 6-6- в регионе 0-20 сМ от pter прародителя № 24, существовавшего 7 поколений назад (около 210 лет назад) (рис. 10). Изучение родовой истории данного тухума (рода) свидетельствует в пользу определенных психических отклонений у ряда непосредственных предков современных больных. Согласно результатам интервью с использованием клинического опросника FIGS -шесть из умерших членов данной родословной проявляли те или иные психопатические признаки.
Эти предки отмечены точками на рисунке 10. После восстановления гаплотипов при анализе SIM WALK ом эти предки оказались носителями указанного гаплотипа в хромосоме 22 (рис. 10). Все больные современных поколений, диагностированные в дагестанских психиатрических больницах и в наших экспедиционных исследованиях, отмечены сплошной окраской в родословной на рис. 10. Как видно из приведенного рисунка, гаплотип прародителя под номером 24 был унаследован 12 его потомками в 7 поколениях без рекомбинации (рис. 10). У больных современных поколений №№ 72 и 69 и возможно у № 65 отмечается рекомбинации в данном гаплотипе (рис. 10).
