Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Итоги и перспективы генетических исследований аллергических заболеваний: обзор литературы 18
1.1. Механизмы развития аллергического воспаления 18
1.2. Формально-генетические исследования аллергических заболеваний 25
1.3. Картирование генов аллергических заболеваний 28
1.3.1. Гены-кандидаты 30
1.3.1.1. Гены врожденного иммунного ответа и иммунорегуляции 33
1.3.1.2. Гены, связанные с дифференцировкой и функционированием Th2-лимфоцитов 34
1.3.1.3. Гены иммунитета слизистых оболочек и физиологии эпителия 36
1.3.1.4. Гены легочной функции 37
1.3.2. Гены, идентифицированные с помощью анализа сцепления и позиционного клонирования 38
1.3.3. Гены, картированные с помощью полногеномного анализа ассоциаций. 48
1.4. Генно-средовые взаимодействия 56
1.5. Межгенные взаимодействия 60
1.6. Функциональная геномика, профили генной экспрессии и эпигенетика 62
1.7. Практические приложения 67
1.7.1. Генодиагностика 67
1.7.2. Фармакогенетика 68
1.7.3. Генотерапия 76
1.8. Системная биология и медицина в исследованиях аллергических болезней.. 82
Резюме 85
Глава 2. Анализ общих и специфических генов аллергических заболеваний 89
2.1. Методы исследования 91
2.2. Результаты и обсуждение 92
2.2.1. Общие гены аллергических болезней 92
2.2.2. Специфичные гены аллергических болезней 114
Глава 3. Полногеномный анализ ассоциаций для аллергических болезней и признаков 124
3.1. Материал и методы 125
3.1.1. Характеристика обследованных групп 125
3.1.2. Молекулярно-генетический анализ 127
3.1.3. Статистический анализ 128
3.2. Результаты и обсуждение 129
3.2.1. Новые гены-кандидаты детской бронхиальной астмы и аллергического ринита 129
3.2.2. Другие возможные ассоциации 137
3.2.3. Валидация результатов полногеномного анализа ассоциаций 140
Глава 4. Генно-средовые взаимодействия в развитии аллергических заболеваний 150
4.1. Материал и методы 159
4.1.1. Характеристика обследованных групп 159
4.1.2. Клинико-лабораторные методы исследования 161
4.1.3. Иммунологические методы исследования 162
4.1.4. Молекулярно-генетические методы 163
4.1.5. Статистический анализ 166
4.2. Результаты и обсуждение 169
4.2.1. Оценка влияния описторхозной инвазии на иммунный ответ 169
4.2.2. Характеристика больных бронхиальной астмой, описторхозом и их сочетанием по полиморфизму генов-модификаторов иммунного ответа 177
4.2.3. Анализ ассоциации генетических полиморфизмов с аллергическими заболеваниями и признаками с учетом описторхозной инвазии 191
4.2.4. Межгенные взаимодействия как фактор риска аллергических заболеваний и признаков 203
Общее заключение 224
Выводы 230
Список литературы 235
Приложение 283
- Механизмы развития аллергического воспаления
- Генотерапия
- Валидация результатов полногеномного анализа ассоциаций
- Межгенные взаимодействия как фактор риска аллергических заболеваний и признаков
Введение к работе
Актуальность проблемы. Геномные исследования многофакторных заболеваний (МФЗ) являются приоритетным направлением современной медицинской генетики (Гинтер, 2003; Пузырев, 2011; Khoury, Gwinn, 2006; Gibson, 2009; Manolio et al, 2009). Это определяется двумя важными обстоятельствами. Во-первых, МФЗ составляют основную проблему здравоохранения во всем мире; предполагается, что понимание наследственных основ их этиологии и патогенеза поможет в формировании новых стратегий лечения и профилактики таких проблемных патологий, как сердечно-сосудистые, аллергические, инфекционные, аутоиммунные, психиатрические болезни. Во-вторых, МФЗ представляют собой комплексные фенотипы, генетический анализ которых может способствовать пониманию механизмов реализации наследственной информации на уровне сложных признаков, что является важной, нерешенной сегодня биологической проблемой, заключающейся в неоднозначности соответствия генотипа и фенотипа, в его вероятностном характере, основанном на многоступенчатости реализации генетической информации. В этом - основное отличие МФЗ от моногенных и хромосомных болезней, для которых гено-фенотипические взаимоотношения имеют детерминистский характер. В медико-биологических исследованиях ближе всего к анализу этой проблемы стоит понятие патогенетики, обозначающее генетические механизмы развития патологических признаков, то есть превращение аномального генома в фенотип болезни (Пузырев, 2001; Murphy, Pyeritz, 1996).
Последние десятилетия развития генетики и смежным дисциплин как в фундаментальном, так и в медицинском аспекте позволили накопить существенный объем фактических данных, касающихся патогенетики многих МФЗ. Совершен прорыв в технологиях генотипирования и секвенирования, которые теперь позволяют получить полную последовательность человеческого генома почти за сутки в условиях одной лаборатории (Kilpinen, Barrett., 2013). Аналогичным образом прогрессируют технологии масштабного анализа транскриптома, протеома, метаболома и других «омов» (Russell et al., 2013). Накопление огромных массивов биологических данных дает мощный стимул развитию биоинформатики, вычислительной биологии и многомерных статистических методов анализа биологических явлений (Goodman, 2002; Molidor
et al., 2003; Furlong, 2013). Накапливающиеся фактические данные по результатам генотипирования, анализа экспрессионного профилирования и других способов изучения молекулярной и фенотипической изменчивости архивируются в публично доступные базы и банки данных и знаний, позволяя проводить мета-анализ и получать информацию с помощью методов извлечения данных (Sommer et al, 2008; Yu et al., 2008). Отмечается рост интереса к рассмотрению проблемы генетики МФЗ с позиции системной биологии и сетевой медицины (Auffray et al., 2009; Chuang et al., 2010; Barabasi et al, 2011; Bousquet et al., 2011). Это позволяет говорить о смене парадигмы в исследовании сложнонаследуемых заболеваний и признаков - от редукционизма к холизму. К этому можно добавить тенденцию к рассмотрению в рамках одного исследования не отдельных болезней, а их групп, объединенных по принципам этиологического и патогенетического родства. Целью таких исследования является выявление общих и специфических генов, лежащих в основе целого ряда болезней. Очевидно, что такой подход будет способствовать не только лучшему понимаю механизмов развития МФЗ, но и поможет в создании естественной системы классификации болезней.
В контексте генетических исследований МФЗ аллергические болезни являются своего рода парадигмой, поскольку на их примере можно отследить все основные направления и идеи такого рода работ (Koppelman et al., 2008; Vercelli, 2008, 2011; Chuang et al, 2009; Maes et al, 2011; Zhang et al, 2012). Нужно отметить значительный вклад российских ученых в исследования наследственных основ аллергических болезней (Вавилин и соавт., 2002; Полоников и соавт., 2005; Карпова и соавт., 2007; Коненков и соавт., 2007; Огородова и соавт., 2007; Баранов и соавт., 2008; Черкашина и соавт., 2010; Тюменцева, 2011; Макарова, 2011; Карунас, 2012).
Отмечая несомненные успехи в области исследования генетики аллергических болезней, нужно указать на ряд трудностей и пробелов в существующих знаниях и методологии. Во-первых, очевидным фактом является недостаточность исследований межгенных и генно-средовых взаимодействий. Хотя роль факторов внешней среды в модификации генетических эффектов в развитии аллергических болезней не вызывает сомнений, непосредственные исследования этой проблемы немногочисленны и касаются в основном анализа факторов сельского образа жизни в рамках «гигиенической гипотезы» (von Mutius, Vercelli, 2010; Ober, Vercelli, 2011). Относительно межгенных
взаимодействий можно отметить значительный теоретический интерес, пока что слабо поддерживаемый фактическими экспериментальными данными (Cordell, 2009). Во-вторых, многочисленные полногеномные ассоциативные исследования, выполненные для аллергических болезней и признаков, показывают наличие выраженной этнической и популяционной специфики выявляемых ассоциаций (Willis-Owen et al, 2009; Akhabir, Sandford, 2011; Torgerson et al, 2011; Wjst et al, 2013). Это диктует необходимость систематического анализа ассоциаций в рамках полногеномного подхода в различных популяциях мира, учитывающих этническую специфику, а также факторы внешней среды. Во-третьих, хотя родственный характер аллергических болезней очевиден, до сих пор сделано мало попыток по выявлению их общих наследственных детерминант. Также практически отсутствуют работы по установлению общности генетической компоненты аллергических и других болезней. Такого рода анализ будет полезен для целей построения естественной классификации МФЗ. Среди перспективных направлений теоретических изысканий в этой области можно выделить концепцию болезней-синтропий, дающую ориентиры для выявления общих (синтропных) генов групп патогенетических общих, часто сочатающихся болезней, к которым, несомненно, относятся аллергические заболевания (Пузырев, 2008; Пузырев и соавт. 2009). Наконец, очевидно, что необходимы усилия в области практических приложений достижений генетических исследований аллергических болезней. В частности, перспективными, хотя и слабо разрабатываемыми, являются оценки предиктивной и диагностической значимости генетических маркеров с доказанной ассоциацией с аллергическими болезнями. Учитывая эти обстоятельства, сформулированы цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования: Комплексный анализ патогенетики синтропных аллергических болезней на основе исследования полногеномных ассоциаций, межгенных и генно-средовых взаимодействий.
Задачи исследования:
1. С помощью интернет-ресурса HuGE Navigator установить синтропные и
специфичные гены распространенных аллергических заболеваний
(бронхиальная астма, атопический дерматит, аллергический ринит,
лекарственная и пищевая аллергия, поллиноз, крапивница). Охарактеризовать
сферу компетенции общих и специфических генов аллергических заболеваний путем анализа генных онтологии и KEGG-путей.
-
Провести сопоставление генетической компоненты аллергических болезней и других распространенных много факторных заболеваний (аутоиммунных, инфекционных, метаболических).
-
Провести полногеномный анализ ассоциаций генетических маркеров с аллергическими фенотипами у жителей Западной Сибири. Провести валидацию результатов полногеномного анализа ассоциаций в независимых выборках.
-
Оценить влияние описторхозной инвазии на особенности течения аллергического воспаления. Проанализировать частоту аллелей и гаплотипическую структуру полиморфных вариантов генов-модификаторов иммунного ответа IFNGR2 (rs 17880053), ТВХ21 (rs 11652969), STAT5B (rs 16967593), IL4RA (rs 1805010), IFNG (rs2069705), PIAS4 (rs3760903), SOCS5 (rs6737848), IL4 (rs2070874), GAT A3 (rs 10905277), PIAS3 (rs 12756687) у жителей Томской области, дифференцированных по наличию аллергического заболевания (бронхиальной астмы) и описторхоза. Провести анализ ассоциации полиморфизмов генов-модификаторов иммунного ответа с аллергическими фенотипами с учетом описторхозной инвазии в качестве внешнесредового фактора.
-
С помощью подхода Multifactor Dimensionality Reduction построить модели межгенных и генно-средовых взаимодействий, существенных в развитии аллергических заболеваний, и оценить их предикторную и диагностическую значимость.
Научная новизна: Данные, полученные в ходе исследования, развивают генетический аспект концепции синтропных болезней и дополняют знания об основах патогенетики аллергических болезней. Впервые установлены синтропные гены распространенных аллергических заболеваний {TNF, IL13, IL4, IL4R, TGFB1, MS4A2, HLA-DRBl, HLA-DQBl, CD14, LTC4S, IL10, TLR2, CTLA4, HLA-DQAl) и предложена классификация аллергических болезней на основе данных об общих и специфических генах. Установлено положение аллергических болезней среди других много факторных заболеваний по степени участия одних и тех же генов в их развитии, в частности показано, что по общности генной компоненты аллергические болезни ближе к инфекционным, чем к аутоиммунным
патологиям. С помощью полногеномного анализа ассоциаций выявлены новые гены-кандидаты детской бронхиальной астмы (YWHAB и PPP1R12B) и аллергического ринита (KCNE4). Установлено влияние описторхозной инвазии на особенности течения аллергического воспаления, а также ее значительная роль в системе генно-средовых взаимодействий, существенных в развитии аллергических фенотипов. В качестве генетических факторов в этой системе наибольшее значение имеют полиморфизмы генов IFNG и SOCS5. С помощью процедуры MB-MDR получены модели межгенных и генно-средовых взаимодействий, имеющих существенное значение в развитии аллергии. В целом, полученные данные позволили впервые охарактеризовать общие и специфические гены синтропии «аллергические болезни», выявить новые гены-кандидаты аллергических заболеваний, установить ранее не известные ассоциации с генами-модификаторами иммунного ответа, а также показать важность межгенных взаимодействий и коморбидности, как компоненента генно-средовых взаимодействий в развитии аллергических фенотипов.
Научно-практическая значимость работы: По результатам исследования зарегистрированы два патента на изобретение: «Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы» (патент на изобретение № 2383019; приоритет изобретения 09.12.2008) и «Способ прогнозирования риска развития терапевтической резистентности у больных бронхиальной астмой» (патент на изобретение № 2433401; приоритет изобретения 15.07.2010). Данные работы, касающиеся генно-средовых взаимодействий с учетом описторхоза в качестве фактора внешней среды, могут быть учтены при разработке профилактических и диагностических мероприятий, а также приняты во внимание при построении эпидимиологических моделей для аллергических болезней в регионах, эндемичных по описторхозу. Модели межгенных и генно-средовых взаимодействий могут быть использованы в качестве ориентира при разработке способов генодиагностики аллергических болезней. Результаты исследования дополнили учебные программы для врачей-интернов, врачей-ординаторов кафедры факультетской педиатрии, а также для студентов кафедры медицинской генетики Сибирского государственного медицинского университета. Новые данные могут быть использованы в учебном процессе на факультетах биологического и медицинского профиля других вузов. Новые научные
результаты запрошены и переданы для размещения в УМКД по педиатрии для образовательных стандартов нового поколения. Положения, выносимые на защиту:
-
Генетическая компонента подверженности аллергическим заболеваниям представлена синтропными и специфическими генами. Сферой компетенции синтропных генов является инициация и регуляция иммунного ответа (преимущественно гуморального) в процессе аллергического воспаления, а также регуляция противоинфекционного иммунитета, в то время как специфические гены связаны с характерными для каждой болезни фенотипическими проявлениями (гладко-мышечное сокращение для бронхиальной астмы; развитие покровных тканей для атопического дерматита; реакции биотрансформации для лекарственной аллергии).
-
Аллергические болезни имеют общие гены с аутоиммунными, воспалительными, инфекционными, паразитарными и метаболическими болезнями. Большинство этих генов связано с регуляцией иммунного ответа и воспаления. По общности генетической компоненты подверженности аллергические заболевания близки к инфекционным болезням и дистанцированы от аутоиммунных патологий.
-
Детская бронхиальная астма ассоциирована с полиморфными вариантами гена PPP1R12B (lq32.1). Аллергический ринит связан с полиморфными вариантами гена KCNE4 (2q36.1); коморбидность с бронхиальной астмой важна для фенотипического выражения этой ассоциации.
-
Изменчивость аллергических фенотипов связана с межгенными и генно-средовыми взаимодействиями. Существенным компонентом системы генно-средовых взаимодействий является гельминтная инвазия Opisthorchis felineus; к генетическим факторам этой системы относятся: для бронхиальной астмы -IFNG и SOCS5; для атопического дерматита - GATA3 и IL4; для аллергического ринита - ТВХ21 и SOCS5; для поливалентной сенсибилизации - IFNG и IL4RA; для тяжести течения бронхиальной астмы - IFNG и PIAS3.
-
Межгенные и генно-средовые комбинации, включающие гены-модификаторы иммунного ответа и описторхозную инвазию, имеют диагностическую и прогностическую ценность в отношении оценки риска бронхиальной астмы и тяжести ее течения, атопического дерматита и поливалентной сенсибилизации.
Апробация работы: Основные положения диссертации представлены на межлабораторных семинарах НИИ медицинской генетики СО РАМН (г. Томск), а также на российских и международных конференциях: конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008), VI Съезд Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), конференции Европейского общества генетиков человека (Барселона, 2008; Нюрнберг, 2012), III и VI международные конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2007, 2009), научно-практическая конференция «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2012), конгресс Американского общества генетиков человека (Сан-Франциско, 2012), 8-я Международная конференция по биоинформатике геномной регуляции и структурной / системной биологии (Новосибирск, 2012), ежегодный конгресс Европейского респираторного общества (Вена, 2012), III международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012).
Декларация личного участия автора: В диссертационной работе использованы экспериментальные и аналитические материалы, полученные лично автором или под его непосредственным руководством. Автор являлся участником, организатором и куратором сбора биологического материала, а также координатором взаимодействия между российскими и европейскими организациями в рамках международных проектов, по результатам которых выполнен фрагмент диссертационной работы; выбирал гены и полиморфизмы для исследования; разрабатывал способ генотипирования маркеров генов-кандидатов аллергических болезней; проводил анализ баз данных по генам МФЗ; осуществлял статистический и биоинформатический анализ результатов; оформлял результаты исследований в виде статей.
Результаты, представленные в диссертации, получены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №06-04-58574, 05-04-98011-р_обь_а, 03-04-06053, 02-04-06911, 01-04-48213); грантов Президента РФ (МК-1287.2005.4, ВНШ-840.2003.4); ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники»
(госконтракты № 02.740.11.0716, 02.512.11.2281, 02.512.11.2162, 02.434.11.7117, 02.445.11.7001, соглашение № 8156); Администрации Томской области (проекты «Разработка генотипической тест-системы прогнозирования тяжести течения бронхиальной астмы», 2002-2003; «Формирование и развитие рынка услуг по геномной диагностике широко распространенных заболеваний», 2006); фонда INTAS (грант 05-1000004-7761); 6-й Рамочной программы Европейского Сообщества (грант LSH-2004-1.2.5-1 «GABRIEL»); фонда Wellcome Trust (грант № WT084703MA).
Публикации: По теме диссертационного исследования опубликована 41 научная работа, в том числе 22 статьи в рецензируемых научных журналах, 3 главы в коллективных монографиях, 1 учебное пособие, 13 тезисов в материалах зарубежных и отечественных конференций и 2 патента на изобретение.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав с результатами собственных исследований, включающих подразделы с описанием материала и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы включающего 502 источника (37 - отечественных и 465 - зарубежных авторов), и приложения. Диссертация изложена на 303 страницах, содержит 41 таблицу и 32 рисунка.
Механизмы развития аллергического воспаления
Аллергические болезни - группа широко распространенных патологий многофакторной природы, развитие которых обусловлено сложным взаимодействием генетических и средовых факторов.
Основой патогенеза аллергических болезней является воспаление, обусловленное взаимодействием лимфоцитов, дендритных клеток, эозинофилов, тучных клеток и базофилов (Barnes P.J., 2011). Паттерны воспаления могут быть разными для различных болезней, однако имеется ряд общих характеристик: аллергическое воспаление характеризуется экспансией CD4+ Т-лимфоцитов-хелперов типа 2 (Th2) и связанной с ней IgE-зависимой активацией тучных клеток и инфильтрацией тканей эозинофилами. В ряде случаев в воспалении участвуют нейтрофилы, ТЫ-лимфоциты и CD8+ цитотоксические лимфоциты. Клинические различия аллергических болезней обусловлены, главным образом, анатомическими и гистологическими особенностями участков развития воспаления. Так взаимодействие клеток и медиаторов воспаления с гладкомышечными клетками нижних дыхательных путей приводит к бронхоконстрикции - главному симптому бронхиальной астмы (Hamid Q., Tulic М., 2009); связанная с развитием воспаления вазодилатация в области верхних дыхательных путей ведет к симптомам аллергического ринита (заложенность носа, выделение слизи) (Broide D.H., 2010); активация кератиноцитов в участках кожи ассоциирована с симптомами атопического дерматита (Sicherer S.H., Leung D.Y., 2010). Тем не менее, общность механизмов аллергических болезней, обусловливает их частое совместное проявление - синтропию (Пузырев В.П., Фрейдин М.Б., 2009), одним из ярких проявлений которой является так называемый «атопический марш» у детей раннего возраста.
Считается, что аллергическое воспаление развилось в процессе эволюции как механизм противодействия гельминтной инвазии, направленный на быструю элиминацию паразитирующих червей и восстановление поврежденных тканей (Conrad D.H. et al., 2010). Это процесс самоограничивающийся, и его развитие должно останавливаться после устранения гельминта. Однако некоторые антигены (пыльца, клещ домашней пыли, шерсть домашних животных) также активируют аллергическое воспаление и, поскольку эти антигены постоянно поступают в организм, процесс не останавливается и приводит к патологическим последствиям в дыхательных путях и коже. Согласно другой гипотезе, учитывая, что аллергическая реакция развивается исключительно быстро, а также может быть направлена против очень широкого класса явно неродственных молекул, есть основания полагать, что аллергическое воспаление является эволюционно сложившимся механизмом защиты не только от паразитов, но также от ядов и ирритантов (Palm N.W. et al., 2012).
Детали развития аллергического воспаления до конца не ясны, но общая схема принципиально понятна (рис. 1.1). Вдыхаемые или проникающие через кожу аллергены активируют сенсибилизированные тучные клетки, связываясь с молекулами IgE на их поверхности, что приводит к высвобождению медиаторов воспаления, включая цистеиниловые лейкотриены и простагландин D2. В ответ на действие этих медиаторов клетки эпителия высвобождают фактор стволовых клеток (SCF), необходимый для поддержания уровня тучных клеток в дыхательных путях или на поверхности кожи. Аллергены процессируются миелоидными дендритными клетками, которые под действием лимфопоэтина стромы тимуса (TSLP), высвобождаемым эпителиальными и тучными клетками, секретируют хемокины CCL17 и CCL22. Эти молекулы привлекают Тп2-клетки, которые синтезируют ключевые цитокины аллергического воспаления: интерлейкины (ИЛ)-4 и -13 (стимулируют В-клетки на синтез IgE), ИЛ-5 (необходим для активации и хемотаксиса эозинофилов) и ИЛ-9 (стимулирует пролиферацию тучных клеток). Также клетки эпителия секретируют CCL11, который активирует эозинофилы.
Наследственной основой аллергических болезней является атопия -врожденная индивидуальная или семейная тенденция к продукции повышенного уровня IgE в ответ на малые дозы аллергенов и развитию типичных симптомов заболеваний, таких как астма, риноконьюктивит или экзема (Johansson S.G. et al., 2004). Термин «атопия», или «странная болезнь», предложен для обозначения семейных случаев этих болезней (Coca A.F., Cooke R.A., 1923). В клинической и исследовательской практике атопия определяется, как правило, по наличию специфической сенсибилизации к распространенным аллергенам (пыльца, шерсть животных, компоненты домашней или библиотечной пыли и т.д.) с помощью кожных прик-тестов, радиоаллергосорбентных тестов, анализа уровня аллерген-специфических антител IgE, а также по наличию специфической симптоматики атопических заболеваний. Кроме того, одним из наиболее распространенных критериев атопии является высокий уровень общего сывороточного IgE.
Около 10 лет назад предложен термин «сеть IgE» (IgE network) для обозначения совокупности молекул и рецепторов, участвующих в активации и контроле IgE (Sutton B.J, Gould H.J., 1993). Центральным элементом функционирования этой сети является процесс переключения классов антител, продуцируемых В-лимфоцитами и плазматическими клетками. Зрелые наивные В-клетки производят антитела классов М и D, однако в ответ на антигенную активацию и дополнительную стимуляцию, за счет соматических мутаций они переключаются на синтез антител классов A, G и Е (Kinoshita К., Honjo Т. et al., 2001).
Для переключения В-клеток на синтез IgE необходимы два ключевых сигнальных события (Potaczek D.P., Kabesch М., 2012). Первое событие осуществляется ИЛ-4 и ИЛ-13, действующими посредством рецепторов IL-4R или IL-13R. Оба рецептора включают общую у-субъединицу и, соответственно, специфическую для ИЛ-4 а-субъедицину или а 1-субъединицу, связывающуюся как с ИЛ-4, так и с ИЛ-13. Оба типа рецепторов связаны с киназами семейства Janus (JAK1, JAK2, JAK3, TYK1, TYK2), которые осуществляют фосфорилирование сигнального трансдуктора и активатора транскрипции STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription). Фосфорилированный STAT6 димеризуется и перемещается в клеточное ядро, где запускает синтез IgE.
Второй сигнал осуществляется путем взаимодействия СЭ40-лиганда Th2-клеток и CD40 на поверхности В-лимфоцитов. Одним из следствий активации CD40 является транслокация в ядро ядерного фактора-кВ (NF-кВ), который наряду со STAT6 запускает синтез IgE.
Продуцируемый плазматическими клетками IgE связывается с рецепторами на тучных клетках или базофилах, обеспечивая тем самым их сенсибилизацию. В качестве рецептора IgE могут выступать несколько молекул, однако основными являются FceRI (высоко-аффинный) and FceRII (низко-аффинный) (Bruhns P. et al., 2005). Высокоаффинный рецептор на тучных клетках и базофилах имеет тетрамерную структуру и состоит из а-, р- и двух у-субъединиц. Специфичной для IgE-рецептора является только а-субъединица, непосредственно связывающаяся с IgE; другие субъедицины обеспечивают проведение сигнала в клетку и его усиление. Низкоаффинный рецептор состоит из олигомеризованного трансмембранного белка CD23. IgE-сеть является молекулярной основой атопических реакций; ее сложность и многокомпонентность обусловливает многофакторную природу атопии и связанных с ней аллергических болезней. Наследственный характер атопии, зафиксированный в самом определении этого состояния, свидетельствует о роли генетических факторов в его детерминации. Генетические исследования атопии сосредоточены в основном на наиболее социально значимых болезнях (бронхиальная астма, атопический дерматит, аллергический ринит, лекарственная аллергия), а также на различного рода атопических признаках, таких как повышенный уровень общего и специфического IgE и положительные результаты кожные аллергопроб. Кроме того, имеются многочисленные работы по изучению наследственной основы специфических признаков аллергических заболеваний, например, бронхиальной геперреактивности при астме (Anderson G.G., Cookson W.O.C.M., 1999). Генетика атопии и аллергических болезней - одно из наиболее активно эксплуатируемых направлений исследований многофакторных заболеваний (МФЗ).
Генотерапия
Основными лекарственными средствами терапии аллергических заболеваний являются противовоспалительные препараты стероидного ряда, бронходилалаторы и антигистамины. Их использование позволяет в большинстве случаев добиться снижения интенсивности или устранения симптомов, однако полное излечивание аллергических заболеваний на сегодняшний день невозможно. Для достижения этой цели в настоящее время пытаются использовать индукцию иммунологической толерантности путем аллерген-специфической иммунотерапии. Лечение таким образом является длительной процедурой, сопряженной с риском анафилактического шока. Также разрабатываются различные специфические ингибиторы IgE и цитокинов, вовлеченных в развитие аллергических болезней (Barnes P.J., 2008).
Генная терапия рассматривается в качестве одной из наиболее многообещающих альтернатив имеющимся подходам к лечению этих болезней (Maes Т. et al., 2011). Основными преимуществами использования генно-терапевтических препаратов является направленность действия на конкретное патогенетическое звено и отсутствие системного эффекта, часто приводящего к негативным последствиям.
В настоящее время на разных стадиях разработки, преклинических и клинических испытаний находятся свыше 20 препаратов для лечения аллергических заболеваний (табл. 1.8). Для их разработки используют две основные технологии: сайленсинг генов и сверхэкспрессия генов.
Сайленсинг генов направлен на подавление транскрипции или трансляции генов с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, ДНКзимов и РНК-интерференции (Popescu F.D., Popescu F., 2007; Sel S. et al., 2008).
Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой короткие (15-25) одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, специфически связывающиеся с таргетной мРНК. Антисмысловые олигонуклеотиды модифицируют специальноым образом для активации фермента РНКазы Н, расщепляющей ДНК-РНК гетеро дуплексы, что приводит к подавлению генной экспресии.
Примерно по такому же принципу действуют ДНКзимы, однако расщепление гетеродуплексов ДНК-РНК осуществляется на основе энзиматической активности самих молекул ДНК. По сравнению с другими методами генного сайленсинга, ДНКзимы демонстрируют высокую эффективность на фоне отсутствия побочных эффектов (Sel S. et al., 2008).
РНК-интерференция осуществляется на посттранскрипционном уровне с помощью двухцепочечных некодирующих малых интерферирующих РНК (миРНК), малых РНК-ловушек и одноцепочечных микроРНК, комплементарных мРНК таргетного гена. Связывание интерферирующих РНК с таргетной мРНК запускает каскад событий, приводящих к деградации мРНК.
В отличие от антисмысловых олигонуклеотидов, миРНК более стабильны и более эффективны. Кроме того, доставка интерферирующих РНК в клетки может быть осуществлена путем прямой трансфекции без использования дополнительных носителей, а также в составе различных векторов (Popescu F.D., Popescu F., 2007). Эндогенные микроРНК привлекают значительный интерес в последние 5-7 лет. Они связаны с большим количеством биологических фукций через процесс пост-транскрипционной регуляции генной экспрессии. Одна микроРНК может контролировать трансляцию сотен генов. В качестве потенциального генно-терапевтического средства предложены антагомиры, синтетические антисмысловые микроРНК, специфически подавляющие таргетные микроРНК (Mattes J. et al., 2007).
Среди проблем, связанных с использованием технологий генного сайленсинга выделяют побочные эффекты, такие как воспалительные реакции за счет активации Toll-like рецепторов, реагирующих на чужеродные молекулы ДНК и РНК, а также иммунный ответ на системы доставки антисмысловых РНК (Popescu F.D., Popescu F., 2007). Другой проблемой является продолжительность действия эффектов генного сайленсинга. Для антисмысловых олигонуклеотидов он составляет не более недели. Терапевтической действие миРНК продолжается до 8 недель (Suzuki М. et al., 2010).
На основе технологии генного сайленсинга в настоящее время в разработке находятся десятки препаратов, подавляющих гены цитокинов, медиаторов воспаления, молекул адгезии, нерецепторных протеинкиназ и внутриклеточных сигнальных посредников (рецептор аденозина Al, Fc-eRIa; IL-5Ra; GM-CSF/IL-3/IL-5Rp; CD40, CD49d VLA-4; ICAM-1; gob-5; IL-4; IL-5; IL-13; SCF; TGF-01; TNF-a; Lyn; Syk; p38a MAP; p65 NF-кВ; GATA-3; STAT6) (Popescu F.-D., 2005; Popescu F.D., Popescu F., 2007; Maes T. et al., 2011).
В 2009 завершена первая фаза клинических испытаний препарата AIR645, основанного на ингибировании рецептора а-цепи рецептора ИЛ-4 с помощью респирабельного антисмыслового олигонуклеотида (Clinical Trial..., 2012). Установлена хорошая переносимость препарата, отсутствие системных эффектов и возможность его использования путем ингаляции раз в неделю.
Во второй фазе клинических испытаний находится препарат TPI ASM8, основанный на антисмысловом ингибировании рецептора CCR3 и 3-цепи рецептора ИЛ-3, ИЛ-5 и GM-CSF (Gauvreau G.M. et al., 2009). Препарат доставляется ингаляционным путем и снижает уровень эозинофилии и симпотомы заболевания у пациент с легкой астмой. В клиническом испытании показана эффективность и безопасность препарата в случае использования четырехкратной повышающей дозы.
Альтернативой генно-терапевтического подхода аллергий на основе сайленсинга генов-активаторов воспаления является является сверхэкспрессия генов, подавляющих воспаление. Терапевтический потенциал этого подхода показан для таких молекул как TGF-(3, IFN-y, IL-10, IL-12, IL-18, рецепторный антагонист IL-1, рецепторный антагонист IL-4, (Chuang Y.H. et al., 2009, Maet T. et al., 2011). В настоящее время не опубликованы результаты клинических испытаний препаратов, основанных на сверхэкспрессии генов.
В целом, использование генной терапии для лечения аллергических заболеваний представляется многообещающим направлением. Маловероятно, что генная терапия в скором будущем вытеснит терапию клюкокортикоидами для большинства больных аллергическими заболеваниями. Однако для определенных подгрупп пациентов с выраженной гиперэкспрессией специфических цитокинов и медиаторов и низким уровнем терапевтического контроля, генная терапия может стать действенным дополнением стандартного лечения.
Валидация результатов полногеномного анализа ассоциаций
Воспроизведение результатов ПГАА в независимых популяциях является важнейшим этапом генетического анализа МФЗ. Исследования, проведенные для A3 позволили выявить несколько десятков локусов, ассоциированных с этими болезнями (Akhabir L., Sandford A J., 2011), однако только в нескольких случаях ассоциации воспроизведены в независимых исследованиях. Недавно проведен систематический анализ 117 генов-кандидатов БА, большая часть из которых установлена с помощью ПГАА, у мексиканцев и пуэрто-риканцев (Galanter J.M. et al., 2011). В этом исследовании не удалось подтвердить ассоциации для 95 генов и только для трех генов установлена ассоциация с БА в обеих проанализированных этнически родственных популяциях. Эти и другие аналогичные данные позволяют предположить наличие небольшого числа общих генов БА, эффекты которых лишь слабо модифицируются межгенными и генно-средовыми взаимодействиями, в то время как более значительная часть генов подверженности проявляют скорее популяционно-специфические эффекты в отношении развития заболевания.
Проведенное исследование позволило выявить новые гены-кандидаты A3. Это исследование было выполнено, благодаря международному проекту GABRIEL, в состав которого вошли две другие российские группы - из г. Уфы и г. Курска. Уфимская выборка является этнически гетерогенной по составу, поэтому ее использование для воспроизведения результатов исследования у русских жителей Западной Сибири затруднено. В то же время, курская выборка представлена славянским населением Центральной России, поэтому в этническом плане сопоставима с томской выборкой. При этом Курск распложен примерно в 3800 км к западу от Томска в регионе с отличающимися климатическими условиями и особенностями этнической истории фомирования популяций.
Для курской выборки единственным доступным фенотипом является диагноз бронхиальной астмы, и не известен аллергический статус больных. Поэтому единственной корректной возможностью анализа явилась оценка ассоциации генов со взрослой и детской БА. Учитывая результаты исследования томской выборки, анализ проведен для трех генов - YWHAB, PPP1R12B и GPATCH2. Курская выборка представлена 279 здоровыми индивидами и 295 больными БА. Диагноз детской астмы поставлен 117 пациентам. Генотипирование выполнено с использованием той же платформы, что и для томской выборки в рамках проекта GABRIEL. Для анализы выбраны 15 ОНП гена YWHAB, 26 ОНП гена PPP1R12B и 112 ОНП для гена GPATCH2. Для оценки ассоциации генных маркеров с заболеванием провели сравнение частот аллелей у здоровых лиц с больными детской и взрослой астмой по отдельности, а также с общей группой больных. Для генов YWHAB и GPATCH2 ассоциации ни с одним из фенотипов не обнаружено, в то же время четыре ОНП гена PPP1R12B оказались связаны с детской, но не взрослой БА или БА без уточнения возраста начала (табл. 3.3). Для всех четырех ОНП редкий аллель был связан с повышенным риском развития детской БА (табл. 3.4). Важно отметить, что два ОНП (rs3817222 и rs 12734001) ассоциированы с Б А и в томской выборке, при этом направление ассоциации совпадает (табл. 3.1). Это является подтверждением значимости PPP1R12B в развитии детской, но не взрослой БА.
Анализ неравновесия по сцеплению в контрольной группе показал, что четыре ОНП, ассоциированные с детской БА, образуют два независимых кластера: rs 17438212 и rs3767423 образуют один блок, rs 12734001 и rs3817222 -другой (рис. 3.3А). Однако в группе с детской БА все четыре маркера находятся в сильном неравновесии по сцеплению (рис. З.ЗБ). Таким образом, можно предполагать важность гаплотипической структуры PPP1R12B в развитии детской БА. Для проверки этого предположения проведен анализ частот гаплотипов для четырех полиморфизмов гена PPP1R12B, связанных с астмой, у больных детской БА и здоровых лиц.
Выявлены три распространенных гаплотипа с частотой не менее 5% у больных и в контроле. Более редкие гаплотипы не рассматривали, чтобы избежать статистических артефактов. Наиболее частый гаплотип, представленный сочетанием распространенных аллелей Т-С-А-С, был протективным в отношении развития детской БА (ОШ = 0,2395; р = 4,14x10" ). Два других гаплотипа, G-C-G-С и Т-Т-А-Т, ассоциированы с повышенным риском развития заболевания (ОШ = 1,8350; р = 0,0168; ОШ = 1,9470; р = 0,0059 соответственно).
Важно отметить, что только гаплотип, представленный распространенными аллелями, является протективным в отношении развития БА, тогда как любая комбинация двух редких и двух частых аллелей повышает риск заболевания. Это позволяет предположить, что два выявленных гаплотипических блока являются независимыми факторами риска детской БА. Сочетание редких аллелей маркеров rsl2734001 и rs3817222, видимо, имеют более сильный эффект по сравнению с комбинацей редких аллелей двух других ОНП.
Интересно, что согласно данным проекта 1000 геномов (1000 Genomes Project) (1000 Genomes Project Consortium, 2010), несмотря на относительно высокую частоту редкого аллеля ОНП rs3817222, гомозиготность по этому аллелю обнаружена только в одном случае из 1167 генотипов. Также не найдено ни одного гомозиготного генотипа для редкого аллеля ОНП rs 12734001, хотя в этом случае изучено только 268 индивидов. На основании этих данных можно предположить летальный или слабо совместимый с нормальным развитием рецессивный эффект редких аллелей ОНП rs3817222 и rsl2734001. Дополнительным подтверждением этого предположения является эффект нарушения трансмиссии (transmission distortion), установленный для гена PPP1R12B, наряду с несколькими другими генами, участвующими в фосфорилировании белков (Deng L. et al., 2009).
ОНП rs3817222 является результатом миссенс-мутации, приводящей к замене аргинина на триптофан в 18 экзоне гена PPP1R12B. Функциональные последствия этой замены в настоящее время не известны. Три других ОНП расположены в интронах, при этом rs 1743 8212 и rs3767423 расположены в сайтах гиперчувствительности к ДНКазе I, что предполагает их возможный функциональный эффект посредством влияния на связывание транскрипционных факторов.
Продукт гена PPP1R12B является компонентом миозин-фосфатазного комплекса, регулирующего процессы сокращения мышечных и немышечных клеток (Ito М. et al., 2004). До сих пор не опубликованы данные о клинической важности этого гена, за исключением информации о снижении его экспрессии при спорадическом колоректальном раке (Zhou C.Z. et al., 2008). Также его экспрессия повышена при ряде патологических состояний сердечно-сосудистой системы, таких как ишемия, артериальная фибрилляция, инфаркт миокарда, кардиомиопатия (Lukk М. et al., 2010). Основываясь на известных данных о функции PPP1R12B, можно предположить два возможных механизма его ассоциации с развитием БА. Во-первых, учитывая важность PPP1R12B в регуляции гладкомышечных сокрещений, он может быть вовлечен в развитие бронхиальной гиперреактивности - повышенной сократимости бронхов в ответ на различные стимулы - один из главных клинических и диагностических признаков БА. Во-вторых, роль гена PPP1R12B в развитии БА может быть связана с его участием в воспалительных реакциях, регулируемых ССЯЗ-сигнальным путем, включающим интерлейкин-16-опосредованную модуляцию хемотаксических свойств гранулоцитов и формирование стрессовых волокон в клетках (Bannert N. et al., 2003).
Таким образом,, полученные данные убедительно подтверждают роль PPP1R12B в развитии детской БА. В то же время, не удалось воспроизвести ассоциацию генов YWHAB и GPATCH2 с детской и взрослой астмой соответственно. Возможно, эти гены либо не связаны с астмой, либо их эффект является специфичным для определенных популяций, то есть модифицируется межгенными и генно-средовыми отношениями, тогда как PPP1R12B в значительно меньшей степени чувствителен к влиянию этих факторов.
Межгенные взаимодействия как фактор риска аллергических заболеваний и признаков
Идентификация генов предрасположенности многофакторным заболеваниям является одной из наиболее проблематичных областей статистической генетики. Проблема определяется необходимостью анализа множества генных вариантов, эффекты которых связаны не только с действием индивидуальных полиморфизмов, но их с результатом их многомерных взаимодействий между собой и факторами внешней среды, которые трудно анализировать обычными статистическими методами. Например, анализ гено-фенотипических ассоциаций путем построения моделей логистической регрессии в случае многоуровневых взаимодействий сводится к построению таблиц сопряженности, многие ячейки которых будут содержать нулевые значения. Это может привести к значительному повышению коэффициентов уравнения регрессии, не отражающих реальных ассоциаций, но являющихся следствием ограниченности размера выборки. Проблема может быть решена формированием очень больших выборок для исследования, что не всегда технически возможно и практично. Альтернативным решением является разработка специальных методов статистики, позволяющих проводить анализ ассоциаций с учетом многоуровневых межгенных и генно-средовых взаимодействий. Одним из таких методов, ставших в последнее время очень популярным, является подход, называемый Multifactor-Dimensionality Reduction (MDR) (Ritchie M.D. et al., 2001). Сущность метода заключается в пулировании мультилокусных генотипов в группы высокого и низкого риска в отношении исследуемого фенотипа, что эффективно снижает количество предикторных переменных (генных комбинаций и генно-средовых комбинаций) до одномерного уровня. Новая одномерная предикторная переменная затем подвергается тестированию в отношении способности классифицировать и предсказывать фенотип с помощью регрессионного анализа или путем пермутации. Метод MDR является непараметрическим и не предполагает какой-то модели наследования признака, то есть может быть приложен к анализу любых фенотипов без априорных предположений.
Метод MDR с большим успехом используют в генетических исследованиях многофакторных заболеваний, в том числе аллергий (Kim S.H. et al., 2008; Lee J.H. et al., 2008; Bottema R.W. et al., 2010; Manachie John J.M. et al., 2010; Reijmerink N.E. et al., 2010; Yang K.D. et al., 2010; Wu X. et al., 2010; Su M.-W. et al., 2012; Szczepankiewicz A. et al., 2012; Choi W.A. et al., 2012). Известно несколько модификаций метода, ключая OR-MDR (Odds Ratio-based MDR; Chung Y. et al., 2007), GMDR (Generalized MDR; Lou X. et al., 2007) и MB-MDR (Model-Based MDR; Calle M.L. et al., 2008). По ряду параметров MB-MDR является предпочтительным для использования. В частности, метод обладает более высокой статистической мощностью в присутствии генетической гетерогенности, а также позволяет анализировать количественные признаки (Calle M.L. et al., 2010). Этот метод был использован в исследовании уровня специфического IgE у больных экземой и позволил установить эпистатический эффект двух вариантов гена FCER1A в отношении риска развития заболевания (Manachie John J.M. et al., 2010).
С помощью метода MB-MDR проведен анализ межгенных и генно-средовых взаимодействий в отношении риска аллергических заболеваний и признаков. Расчеты включают три этапа (Calle M.L. et al., 2010). На первом этапе выполняется тест на ассоциацию мультилокусных комбинаций с фенотипом. Для бинарных или мультиномиальных признаков используется логистическая регрессия, для количественных - линейная регрессия. По результатам анализа ассоциаций каждой генотипической (или генотип-средовой) комбинации присваивается категория риска: высокий риск, низкий риск или нет риска. При этом используется либеральный уровень значимости 0,1.
На втором этапе мультилокусные и генотип-средовые комбинации одной группы риска (высокий или низкий) объединяются и используются для анализа ассоциаций с фенотипом. В каждом тесте одна группа риска сравнивается с двумя другими, то есть, группа высокого риска с комбинацией низкого и нулевого риска, а группа низкого риска с комбинацией высокого и нулевого риска. Результатом расчетов являются статистики Вальда для каждой из категорий риска и соответствующие им уровни значимости ассоциации. На этом шаге выявляются несколько комбинаций с высоким или низким риском в отношении исследуемого фенотипа. Дальнейшему анализу могут быть подвергнуты комбинации с выбранным исследователем уровнем значимости. Нами протестированы двух-, трех- и четырехуровневые комбинации. Для двухуровневых комбинаций далее анализировали модели с величиной р 0,01, для трехуровневых - с р 0,001, для четырехуровневых - с р 0,00001.
На третьем этапе для каждой тестируемой комбинации выбирается вариант, соответствующий максимальному значению статистики Вальда и затем определяется экспериментальный уровень значимости с помощью пермутационного теста. Для двух- и трехкомпонентных моделей уровень статистической значимости принимали р 0,05, для четырехкомпонентных моделей - р 0,01.
Итогом расчетов является комбинация генотипов и факторов среды, связанная с высоким или низким риском развития заболевания или с высоким или низким уровнем количественного признака. Дополнительно для качественных переменных проведены расчеты чувствительности, специфичности и показателя AUC (area under curve) диагностической модели, установленной с помощью МВ-MDR. Учитывая мультиномиальный характер тяжести течения БА, расчеты чувствительности, специфичности и AUC проведены для различных комбинаций значений признака: легкая астма против среднетяжелои и тяжелой астмы по отдельности и их сочетания, среднетяжелая астма против легкой и тяжелой астмы по отдельности и их сочетания, тяжелая астма против легкой и среднетяжелои астмы по отдельности и их сочетания. Для уровня IgE проведены расчеты коэффициента детерминации.
Для БА идентифицировано 5 статистически значимых двухфакторных моделей, 14 - трехфакторных и 2 - четырехфакторных (табл. 4.14). Описторхозная инвазия входит в 8 моделей, причем в 7 случаях - в сочетании с геном SOCS5. В зависимости от сочетаний с генотипами модели с описторхозом связаны как с высоким, так и с низким риском БА. Аналогично, одни и те же генотипы могут входить в модели разной направленности (высокого или низкого риска) в зависимости от сочетания с другими генотипами, то есть, от генетического окружения.
Судя по величине AUC, модели SOCS5 11FNG I OPI и 1L4 I ТВХ21 I SOCS5 являются наиболее ценными для диагностики высокого и низкого риска БА. В целом значения AUC для всех моделей довольно низкие (0,53-0,61), свидетельствуя о невысоком диагностическом потенциале полученных моделей. Основная проблема заключается в низкой специфичности, что означает, что при использовании моделей в диагностических целях уровень выявления истинно положительных случаев БА невысок - 48% для наилучшей модели. В то же время, для этих моделей получены большие значения специфичности, то есть при их использовании в диагностических целях можно ожидать эффективного определения лиц без БА.
