Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10-35
1.1. Молекулярные основы этиопатогенеза хронического калькулезного холецистита 10-19
1.2. Интерлейкины и их рецепторы: молекулярно-генетические характеристики и медико-биологические эффекты .19-30
1.3. Генетические исследования хронического калькулезного холецистита 30-35
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .36-43
2.1. Характеристика обследованных групп 36-37
2.2. Молекулярно-генетические методы .37-41
2.3. Биометрические и генетико-статистические методы .41-43
ГЛАВА 3. Анализ роли генетических полиморфизмов интерлейкинов в формировании ХКХ 44-87
3.1. Исследование ассоциаций генетических вариантов интерлейкинов с развитием ХКХ 44-51
3.2. Изучение особенностей вовлеченности генов-кандидатов в формирование ХКХ в зависимости от пола .51-61
3.3. Ассоциации генетических полиморфизмов интерлейкинов с морфологическими характеристиками желчного пузыря у больных ХКХ 61-66
3.4. Генетические полиморфизмы и клинико-лабораторные показатели у больных ХКХ .66-76
3.5. Ассоциации полиморфных маркеров интерлейкинов с интенсивностью болевого синдрома у больных ХКХ в раннем послеоперационном периоде .77-87
Обсуждение .88-100
Выводы .101-102
Список литературы .103-130
- Интерлейкины и их рецепторы: молекулярно-генетические характеристики и медико-биологические эффекты
- Генетические исследования хронического калькулезного холецистита
- Молекулярно-генетические методы
- Ассоциации генетических полиморфизмов интерлейкинов с морфологическими характеристиками желчного пузыря у больных ХКХ
Интерлейкины и их рецепторы: молекулярно-генетические характеристики и медико-биологические эффекты
Соли кальция играют в этом процессе своеобразную, связывающую роль. Фосфат, билирубинат и карбонат кальция, также могут выступать в роли начальных ядер для кристаллизации холестерина.
Мелкие кристаллы холестерина, до формирования конкрементов, способны поступать в кишечник с током желчи, поэтому нарушение сократительной способности желчного пузыря является предрасполагающим фактором к образованию камней [Dowling R.H., 2000; Ильченко А.А., 2004].
К концентрации желчи в желчном пузыре приводит всасывание слизистой оболочкой Na, Cl, HCO. Слизистая оболочка желчного пузыря обладает одной из наиболее выраженных в организме способностью к абсорбции воды. Благодаря активному транспорту натрия и пассивной абсорбции воды объем желчи в органе уменьшается на 80-90%. При этом, фактически непроницаемая для холестерина, билирубина и желчных кислот, стенка желчного пузыря, обуславливает сгущение желчи, и увеличение концентрации ее основных компонентов в 5-10 раз. Концентрирование желчи положительно влияет на формирование везикул [Ветшев П.С., 1998; Дадвани С.А. и др., 2009].
Механизм гипомоторной дискинезии желчного пузыря при желчнокаменной болезни остается до конца невыясненным. Снижение сократительной способности связывают с нарушением нервного контроля за опорожнением желчного пузыря (парасимпатическая система усиливает его сократимость, симпатическая – релаксацию), изменением гормональной регуляции (снижение уровня холецистокинина), непосредственным влиянием холестерина на сарколемную мембрану гладкой мускулатуры стенки желчного пузыря. Усиливают сокращение желчного пузыря бомбезин, секретин и гастрин. Тормозят его сокращение кальцитонин, глюкагон, вазоинтестинальный пептид, панкреатический пептид и антихолецистокинины [Ветшев П.С., 1998].
Сохраненная сократительная функция желчного пузыря обеспечивает постоянное опорожнение его содержимого, в том числе и от билиарного сладжа, способного спровоцировать процесс камнеобразования. Образование билиарного сладжа наблюдается, например, при повреждении спинного мозга, длительном парентеральном питании и голоде, приеме октреатида (сандостатина) [Ильченко А.А., Вихрова Т.В., 2003].
Важное значение в развитии ХКХ имеет воспалительный механизм. При этом происходят воспалительно-дистрофические и склеротические процессы в стенке желчного пузыря при участии иммунокомпетентных клеток, миграция нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов в слизистую оболочку, и высвобождение медиаторов тканевого повреждения [Царегородцева Т.М., 2003, 2009; Никитенко Т.М., 2006].
Воспалительно-дистрофические изменения слизистой оболочки желчного пузыря, могут вызывать различные факторы: инфекция (кокки, кишечная палочка, другие микробные факторы); патогенная флора, попавшая в желчный пузырь из кишечника, а также с током крови или лимфы из очага воспаления (хронический тонзиллит, пародонтоз, аппендицит, пиелит, правосторонний аднексит и др.); заболевания желудочно-кишечного тракта [Лейшнер У., 2001; Короваев В.М., 2005].
Комплекс цитокинов на первых этапах воспалительного процесса обеспечивает общность механизмов его развития, не зависящую от характера повреждающего агента. Тканевые макрофаги в очаге воспаления в течение нескольких часов после воздействия патогенов запускают синтез цитокинов, которые стимулируют функцию всех иммунных клеток, экспрессируют их рецепторы, активируют синтез молекул адгезии эндотелиальными клетками и лейкоцитами, а также синтез факторов роста [Шичкин В.П., 1998]. Кроме этого, происходит выброс низкомолекулярных медиаторов воспаления (простагландинов, гистамина и др.), определяющих развитие воспалительного ответа в полной мере [Симбирцев А.С., 2013].
Инициация острой воспалительной реакции происходит вследствие активации оседлых макрофагов и секреции провоспалительных цитокинов: IL-1, IL-6 [Титов В.Н., 2003, Ernest H.S. et al, 2001]. Под влиянием IL-1 запускается действие локального иммунного ответа, что обуславливает вовлечение большей части клеток-эффекторов воспаления в устранение патогена и регенерацию целостности ткани [Данилов Л.Н. и др., 2003].
В результате медиаторной реакции происходят изменения русла микроциркуляции, миграция лейкоцитов и их хемотаксис в стенку желчного пузыря [Царегородцева Т.М., 2003; Никитенко Т.М., 2006; Майборода А.А. и др., 2006]. Сосудистые реакции воспаления начинаются с вазоконстрикции, осуществляемой тромбоксаном А2 [Лысикова М. и др., 2004] и катехоламинами (норадреналин) [Титов В.Н., 2003], после которой происходит, вызванная оксидом азота, вазодилатация. Продукция оксида азота осуществляется эндотелиальной NO-синтазой в ответ на стимуляцию эндотелия провоспалительными цитокинами (IL-1, IL-6), и брадикинином, который, повышая сосудистую проницаемость, стимулирует развитие отека слизистой оболочки желчного пузыря [Лысикова М. и др., 2004]. В результате отека, происходит изменение pH в кислую сторону. Стенка пузыря уплотняется, слизистая оболочка атрофируется вследствие образования полиповидных изменений складок.
Генетические исследования хронического калькулезного холецистита
В группе женщин с ХКХ также выявлена более высокая концентрация аллеля -511Т IL-1В (41,71%) по сравнению с группой контроля (32,40%, 2=6,73, р=0,01) (табл. 6).
Таким образом, полученные данные указывают на важную роль полиморфного маркера IL-1В -511С Т в формировании хронического калькулезного холецистита как у мужчин, так и у женщин. Наличие у мужчин генетических вариантов -511Т IL-1В и -511ТТ IL-1В обусловливает повышенный риск развития данного заболевания (OR=3,54; 95% CI=1,64-7,67 и OR=7,71; 95% CI=1,39-56,14 соответственно). Тогда как генотип -511СС IL-1В является протективным фактором развития хронического калькулезного холецистита у мужчин (OR=0,25; 95% CI=0,08-0,75). Наличие у женщин генетического варианта -511Т IL-1В также определяет повышенный риск формирования ХКХ (OR=1,49; 95% CI=1,10-2,03).
Далее нами была изучена роль сочетаний полиморфных вариантов генов интерлейкинов (IL-1А -889Т С, IL-1В -511С Т, IL-4 -584С Т, IL-5 -703С Т, IL-6 -174G С, IL-8 -251А Т, IL-9 Т113М, IL-10 -592С А) при развитии хронического калькулезного холецистита у индивидуумов разного пола (табл. 7-8). В результате проведенного исследования носительства комбинаций аллелей и генотипов исследуемых локусов интерлейкинов, также установлен ряд достоверных отличий больных от контроля.
Выявлено, что в группе мужчин в формировании значимых сочетаний аллелей и генотипов участвуют 4 полиморфизма (IL-1А -889Т С, IL-1В 511С Т, IL-4 -584С Т, IL-5 -703С Т), они образуют четыре комбинации, которые являются факторами риска развития ХКХ (табл. 7). Таблицa 5 Распределение генетических вариант интерлейкинов среди больных ХКХ и в контрольной группе мужского пола (начало)
В группе женщин с ХКХ значимые комбинации аллелей и генотипов формируют 7 полиморфизмов (IL-1А -889Т С, IL-1В -511С Т, IL-4 -584С Т, IL-5 -703С Т, IL-8 -251А Т, IL-9 Т113М, IL-10 -592С А), они образуют шесть сочетаний, четыре из которых определяют повышенный риск развития хронического калькулезного холецистита, а два обладают протективным действием (табл. 8).
Среди мужчин установлены достоверные различия между больными ХКХ и контролем по частоте комбинации аллелей -889T IL-1А, -511T IL-1B и -703С IL-5. В группе больных данное сочетание встречается в 71,43% случаев, а в контрольной группе лишь в 33,33%. Эта комбинация является фактором риска развития хронического калькулезного холецистита (рf=0,003; ррerm=0,01; ОR=5,0; 95% CI 1,67-14,93).
Показано, что сочетание генетических маркеров -511Т IL-1В и -703С IL-5 встречается у 66,67% мужчин больных ХКХ, что в 1,8 раз чаще, чем в контрольной группе (36,36%). Данная комбинация генетических вариантов интерлейкинов определяет повышенный риск формирования хронического калькулезного холецистита (рf=0,003; ррerm=0,01; ОR=4,8; 95% CI 1,64-14,12). Сочетание генетических маркеров -889Т IL-1А, -511Т IL-1В и -584Т IL-4, которое отмечается у 35,48% мужчин больных ХКХ и у 8,33% контроля, также является фактором риска развития данного заболевания (рf=0,004; ррerm=0,02; ОR=6,6; 95% CI 1,65-26,46).
Зарегистрированы различия между мужчинами больными ХКХ и контрольной группой по концентрации сочетания аллелей -889T IL-1А и -511T IL-1B. Среди больных данная комбинация встречается у 71,88%, а в контрольной группе лишь у 38,46%. Наличие данного сочетания является фактором риска развития хронического калькулезного холецистита у мужчин (рf=0,005; ррerm=0,02; ОR=4,1; 95% CI 1,5-11,17).
Выявлено, что среди женщин с ХКХ, сочетание генотипа -889ТT IL-1А с аллелями -511Т IL-1В, -113Т IL-9 отмечается в 42,69% случаев, что в 2,2 раз чаще, чем в контрольной группе (19,54%). Данная комбинация определяет повышенный риск развития хронического калькулезного холецистита у женщин (рf=0,0001; ррerm=0,002; ОR=3,1; 95% CI 1,67-5,65).
Установлена ассоциация сочетания аллеля -511Т IL-1В и генотипа -113ТТ IL-9 с риском развития хронического калькулезного холецистита у женщин. У 48,28% больных ХКХ имеется данная комбинация генетических маркеров, тогда как в контрольной группе она выявлена у 19,15% (рf=0,0002; ррerm=0,002; ОR=3,9; 95% CI 1,78-8,74). Сочетание трeх генeтических маркeров -889С IL-1А, -511С IL-1B и -703С IL-5, которое отмечается у 20,65% женщин больных ХКХ и у 38,46% контрольной группы, служит протективным фактором формирования данного заболевания (рf=0,0007; ррerm=0,005; ОR=0,42; 95% CI 0,25-0,7).
Наряду с этим, установлены различия в распространенности сочетания аллелей -511Т IL-1B, -113Т IL-9, -592C IL-10 и -251Т IL-8 между группой больных ХКХ и контролем. Эта комбинация отмечается у 48,8% женщин с ХКХ и у 28,4% лиц контрольной группы и определяет повышенный риск развития хронического калькулезного холецистита (рf=0,002; ррerm=0,01; ОR=2,4; 95% CI 1,36-4,25).
Также, зарегистрированы различия в частотах сочетания двух генетических маркеров -511C IL-1B и -703С IL-5 между женщинами больными ХКХ (71,15%) и контролем (84,21%). Данная комбинация полиморфных вариантов генов интерлейкинов является протективным фактором формирования данной патологии (рf=0,006; ррerm=0,05; ОR=0,46; 95% CI 0,26-0,83). Установлено, что сочетание аллелей -511Т IL-1B, -703Т IL-5 и -584C IL-4 является фактором риска развития хронического калькулезного холецистита у женщин. Данная комбинация генетических маркеров отмечается у 38,16% больных ХКХ, что 1,6 раз чаще, чем в контрольной группе (23,66%), (рf=0,006; ррerm=0,05; ОR=1,99; 95% CI 1,18-3,34).
Молекулярно-генетические методы
Далее нами был изучен характер поражения желчного пузыря при ХКХ в зависимости от полиморфизмов генов интерлейкинов. Для оценки морфологических показателей желчного пузыря у больных ХКХ были использованы результаты трансабдоминального ультразвукового сканирования [Палмер П.Е.С., 2000]. Признаки проявления хронического калькулезного холецистита при ультразвуковом исследовании определяются степенью воспалительных, пролиферативных, дегенеративных и склеротических процессов в стенке желчного пузыря [Бурков С.Г., 2006]. В норме желчный пузырь представляет собой эхонегативное образование овоидной формы с четкими контурами. Его длина от наиболее узкой части (шейки) до дна составляет 60-100 мм, ширина (поперечник) - 30-50 мм, толщина стенок не должна превышать 3 мм. При хроническом калькулезном холецистите обнаруживаются следующие эхографические признаки: диффузное утолщение, уплотнение или слоистость стенок желчного пузыря, снижение объема и негомогенность полости органа [Блок Б., 2007].
Нами были проанализированы следующие морфологические характеристики: продольный и поперечный размер желчного пузыря, толщина его стенки, диаметр холедоха, а также средний диаметр камней [Палмер П.Е.С., 2000; Блок Б., 2007].
Изучение анализируемых количественных признаков показало, что их распределение в исследуемой группе больных не соответствует закону нормального распределения: значения критерия Шапиро-Уилка составили W=0,63-0,99; c уровнем их статистической значимости p 0,001 (таблица 9). Таким образом, для описания рассматриваемых количественных показателей, нами применялась медиана (Ме) и интерквартильный размах (Q25-Q75), а при сравнении пациентов с разными генотипами по анализируемым показателям использовался непараметрический метод – критерий Манна-Уитни [Реброва О.Ю., 2006].
Выявлено, что у больных ХКХ (n=253) Ме продольного размера была равна 75,0 мм (Q25-Q75=66,0-85,0 мм), Ме поперечного размера – 35,0 мм (Q25-Q75=27,0-40,0 мм), Ме толщины стенки желчного пузыря – 4,0 мм (Q25-Q75=3,0-4,5 мм), Ме диаметра холедоха – 5,0 мм (Q25-Q75=5,0-6,0 мм), Ме диаметра камня – 15,0 мм (Q25-Q75=10,0-20,0 мм).
Распределение показателей, характеризующих морфологические особенности желчного пузыря у больных хроническим калькулезным холециститом
Ассоциации генетических вариантов локуса IL-6 -174G С с поперечным размером желчного пузыря у больных ХКХ
При изучении роли генетических вариант интерлейкинов IL-1В -511С Т, IL-4 -584С Т, IL-5 -703С Т, IL-8 -251А Т, IL-9 Т113М, IL-10 -592С А в формировании морфологических характеристик желчного пузыря у больных ХКХ статистически достоверных ассоциаций не установлено. Средний диаметр камня у пациентов с ХКХ в зависимости от генетического полиморфизма IL-1А -889Т С
Далее мы изучили особенности связей морфологических показателей желчного пузыря у больных ХКХ с полиморфными маркерами интерлейкинов в зависимости от пола. В группе мужчин статистически достоверных ассоциаций генов-кандидатов с данными показателями не выявлено.
Среди женщин обнаружена связь генотипов -889ТТ и -889СТ гена IL-1А с большим диаметром камня (Ме=15 мм, Q25-Q75=10-20 мм). У пациенток с генотипом -889СС по этому локусу данный показатель составил Ме=12 мм, Q25-Q75=9-18 мм, р=0,009 (рис. 6). Также с наибольшим диаметром камня ассоциирован и генотип -174СС IL-6 (Ме=16 мм, Q25-Q75=10–20 мм). У женщин с генотипами -174GG и -174GC IL-6 диаметр камня был достоверно (р=0,03) меньше (Ме=15 мм, Q25-Q75=10-20 мм) (рис. 7).
Выявлено, что генетический полиморфизм IL-4 -584С Т связан с толщиной стенки желчного пузыря. У пациенток с генотипом -584СС толщина стенки желчного пузыря была наибольшая (Ме=4 мм, Q25-Q75=3-4,5 мм) по сравнению с женщинами с генотипами -584СС и -584СТ (Ме=3,5 мм, Q25-Q75=3-4 мм, р=0,03) (рис. 8).
Ассоциации генетических полиморфизмов интерлейкинов с морфологическими характеристиками желчного пузыря у больных ХКХ
При оценке связи генетических вариантов интерлейкинов IL-1В -511С Т, IL-4 -584С Т, IL-6 -174G C, IL-8 -251А Т, IL-9 Т113М и IL-10 -592С А с интенсивностью послеоперационного болевого синдрома у больных ХКХ статистически достоверных ассоциаций не установлено.
Далее мы рассмотрели связи генетических полиморфизмов интерлейкинов с интенсивностью боли в зависимости от пола пациентов. В группе мужчин с диагнозом ХКХ с интенсивностью болевого синдрома ассоциирован только один полиморфный маркер - IL-6 -174G С. У лиц с генотипами -174GC и -174СС Ме величины боли в 14 часов первых суток равна 7 баллам (Q25-Q75=6-8 баллов), что достоверно выше (р=0,02) аналогичного показателя пациентов с генотипом -174GG (Ме=6 баллов, Q25-Q75=6-7 баллов) (рис. 25).
В группе женщин больных ХКХ с интенсивностью боли ассоциированы два генетических полиморфизма: IL-1А -889Т С и IL-5 -703С Т. Установлено, что у пациенток с генотипами -703СТ и -703ТТ гена IL-5 Ме величины боли в 14 часов первых суток равна 7 баллам (Q25-Q75=6-8 баллов), что достоверно выше (р=0,05) аналогичного показателя лиц с генотипом -703СС (Ме=6 баллов, Q25-Q75=5-7 баллов) (рис. 26).
Получено, что женщины с генотипами -889ТТ и -889СТ гена IL-1А в 18 часов первых суток испытывали более выраженную боль (Ме=6 баллов, Q25-Q75=5-7 баллов), чем пациентки с генотипом -889СС (Ме=5 баллов, Q25-Q75=5-6 баллов, р=0,05) (рис. 27).
Итак, обобщая полученные данные можно заключить, что в формировании послеоперационного болевого синдрома у пациентов с ХКХ участвуют три полиморфных маркера: IL-1А -889Т С, IL-5 -703С Т и IL-6 -174G С. Причем, выявлено, что генетические варианты -889ТТ, - 889СТ IL-1А и -703СТ, -703ТТ IL-5 ассоциированы с более выраженной болью у пациентов общей выборки и у лиц женского пола, тогда как у мужчин интенсивный болевой синдром связан с генотипами -174GG и -174GC IL-6.
Связь генетических вариантов локуса IL-1А -889Т С с интенсивностью послеоперационного болевого синдрома у женщин с ХКХ (время измерения: 18 ч) Выявив значимые ассоциации ряда исследуемых генетических полиморфизмов интерлейкинов с интенсивностью послеоперационного болевого синдрома у пациентов с ХКХ на следующем этапе настоящего исследования мы, с использованием методов математического моделирования, разработали способ прогнозирования степени выраженности болевого синдрома в послеоперационном периоде у больных ХКХ.
Методом бинарной логистической регрессии, построены статистические модели прогнозирования выраженного болевого синдрома в 18 часов и в 22 часа первых суток после холецистэктомии у больных ХКХ. Нами учитывались следующие индивидуальные особенности пациентов: пол, возраст, индекс массы тела, морфологические характеристики желчного пузыря (продольный размер, поперечный размер, толщина стенки, диаметр холедоха, диаметр камня), клинико-лабораторные показатели (уровень лейкоцитов, общий и прямой билирубин, холестерин, АСТ, АЛТ, ЩФ, глюкоза крови, ПТИ, МНО, ТВ, АЧТВ и фибриноген), а также генетические характеристики по изучаемым локусам.
Группу исследования составили - 104 больных ХКХ с болевым синдромом небольшой интенсивности и 149 пациентов с выраженным болевым синдромом (в 18 часов первых суток после холецистэктомии); 169 индивидуумов с незначительными болевыми ощущениями и 84 пациента со значительным болевым синдромом (в 22 часа первых суток после холецистэктомии).
Статистически значимой для прогнозирования интенсивности болевого синдрома в 18 часов первых суток после холецистэктомии является модель со следующими предикторами: международное нормализованное отношение, толщина стенки желчного пузыря, характер течения заболевания, генетический вариант по полиморфному маркеру IL-1А -889Т С, генетический вариант по полиморфному маркеру IL-5 -703С T, генетический вариант по полиморфному маркеру IL-8 -251А Т.
Величина отношения шансов для данной регрессионной модели составляет 5,96. Этот показатель свидетельствует о том, чо увеличение на единицу значения i-го признака повышает вероятностть высокого уровня боли почти в 6 раз. Указанная модель корректно предсказывает в 58% случаев риск развития у больных ХКХ выраженного болевого синдрома в 18 часов первых после холецистэктомии и в 81% случаев правильно классифицирует индивидуумов с болевым синдромом небольшой интенсивности. Диагностическая чувствительность данной модели составляет 67%, диагностическая специфичность - 65% и диагностическая эффективность - 66%.
