Содержание к диссертации
Введение
I. Фототрофные бактерии
1.1. Общая характеристика 6
1.2. Ноше виды 13
1.3. Роль пурпурных бактерий в эволюции 16
II. Вклад современных методов в систематику фототрофшх пурпурных бактерий 19
II.І . Анализ семантид у пурпурных бактерий 21
II.І.І. Анализ нуїсяеотидшх последовательностей и 5S РРНК пурпурных бактерий 21
II.1.2. Анализ аминокислотных последовательностей ндтохромов и ферредоксинов пурпурных бактерий 24
II.1.3. Сравнение рибооомальных белков пурпурных бактерий 30
II.1.4. Сравнение свойств ферментов пурпурных бактерий 32
II. 2. Хемотаксономические исследования пурпурных бактерий 34
III . Исследование генома пурпурных бактерий 37
III. I. Сравнение нуклеиновых кислот in vitro
III.І.І. Нуклеотидный состав ДНК 38
III. 1.2. Молекулярная гибридизация ДНК 40
III.І.З. Гибридизация ДНК пурпурных бактерий с рРНК 44
III.2. Генетический анализ in vivo 45
IV. Материалы и методы 51
ІV.I. Объекты исследования 51
ІV. 2. Выделение и очистка препаратов ДНК 58
ІV. 3. Характеристика полученных препаратов ДНК 59
ІV.4. Определение нуклеотидного состава 61
ІV.5. Гибридизация ДНК на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах 62
ІV. 5.1. Получение фрагментированной ДНК 62
ІV.5.2. Приготовление репершх ДНК, меченых in vitro методом тритиевого обмена .' 63
ІV.5.3. Приготовление репершх ДНК, меченых in vitro методом ферментативного метилирования 64
ІV.5.4. Иммобилизация высокополимерной ДНК на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах 66
ІV.5.5. Реакция гибридизации ДНК и обнаружение гибридных дуплексов 68
ІV.5.6. Термоэлюция гибридных дуплексов с нитроцеллю лозных мембранных фильтров 69
ІУ.6. Гибридизация ДНК с рРНК на мембранных фильтрах 70
V. Нуклютйдный состав днк пурпурных бактерий 73
VI Гибридизация днк пурпурных несерных бактерий 75
VII. Идентификация новых штаммов пурпурных несерных бактерий 97
VIII. Гибридизация днк пурпурных серных бактерий 100
IX . Определение систематического статуса рода ectothiorhodo-Spira 104
X. Заключение 124
Выводы 129
Список литературы 131
- Общая характеристика
- . Анализ семантид у пурпурных бактерий
- Нуклеотидный состав ДНК
- Выделение и очистка препаратов ДНК
Введение к работе
Таксономия микроорганизмов до сих пор является одним из наименее разработанных разделов микробиологии. Существующие классификации, основанные на результатах изучения фенотипических признаков, носят в значительной степени эмпирический характер и не претендуют на отражение естественных филогенетических связей между микроорганизмами. Именно такая классификация положена в основу "Руководства Берги ПО определению бактерий" (Bergey s Manual, 1974). Недостатки знаний в этой области прямо сказываются на развитии таксономии микроорганизмов, в частности бактерий.
Не являются исключением в данном отношении и пурпурные бактерии. Система этих фототрофов неоднократно менялась и претерпевает существенные изменения в настоящее время в связи с открытием большого числа новых видов, а также привлечением новых физиологических и биохимических признаков. В последние годы в работах по классификации фототрофных бактерий, как и других микроорганизмов, наряду с исследованием фенотипических свойств применяются новые методы сравнительного анализа: определение нуклеотидного состава ДНК, исследование нуклеотидных последовательностей 16S рРНК и наборов олигонуклеотидов 5S рРНК, исследование состава рибосомальных белков и определение аминокислотных последовательностей в цитохро-мах типа с, а также хемотаксономические исследования. На основании полученных результатов сделано заключение о тесной эволюционной взаимосвязи фототрофных пурпурных бактерий, некоторых аэробных хемотрофных бактерий и митохондрий эукариот.
Однако до настоящего времени при разработке филогенетической системы пурпурных бактерий практически не был применен такой результативный метод оценки генетического родства микроорганизмов как определение степени гомологии ДНК с помощью гибридизации их ДНК. Этот метод успешно используется в таксономии разных групп бактерий, и хотя еще нет единых общепринятых критериев использования данных по гомологии ДНК в токсономии, очевидно, что чем выше уровень геномного сходства у изучаемых микроорганизмов, тем более они родственны. Такой подход способствует приближению к естественной системе, основанной на определении родственных связей между микроорганизмами исходя из сходства или различия их геномов.
Цель работы
В задачу настоящего исследования входил анализ таксономического положения и родственных взаимоотношений ряда фототрофшх пурпурных бактерий на основе применения метода гибридизации ДНК с целью дальнейшего упорядочения системы этих микроорганизмов.
Общая характеристика
К прокариотным микроорганизмам способным к фотосинтезу от- . носятся бактерии, имеющие существенные различия в своей морфоло- \ гии, составе пигментов, организации фотосинтезирующего аппарата. Они различаются также по своей физиологии и процессам метаболизма, в том числе характеру фотосинтеза. Самая обширная группа фо-тосинтезирующих прокариотов - цианобактерии, и недавно открытая группа прохлорофитов осуществляют оксигенный фотосинтез, то есть с выделением молекулярного кислорода. В отличие от этого у пурпурных и зеленых бактерий фотосинтез имеет аноксигенныи характер, т.е. происходит без выделения кислорода. Объясняется это тем,что организмы, у которых фотосинтез сопровождается выделением кислорода, имеют две фотосистемы и поэтому способны использовать в качестве доноров электронов воду. У пурпурных и зеленых бактерий по имеющимся данным функционирует только одна фотосистема. В результате этого они могут использовать в качестве доноров электронов не воду, а более восстановленные соединения, как - то: сульфид, тиосульфат, элементарную серу, молекулярный водород или некоторые органические вещества, причем у разных видов возможности в этом отношении не всегда одинаковы. Большинство пурпурных и зеленых бактерий являются одноклеточными. В восьмом издании определителя бактерий Берги (Bergey s Manual, 1974) ОНИ были выделены В ПОРЯДОК Rhodospirillales(c двумя ПОДПОряДКамИ - Rhodospirillineae И Chlorobiineae), КОТОРЫЙ насчитывал 39 видов, объединенных в 18 родов. Однако, в на - 7 стоящее время этих фототрофов предлагается объединять в два порядка: Rhodospirillales (Pfennig, Trtlper, 1971» 1983) И Chlo-rohiales (Gibbons, Murray, 1978). Порядок Rhodospirillales включает два семейства - Chromatiaceae и Rhodospirillaceae, что соответствует прежним названиям Thiorhodaceae (пурпурные серобактерии) И Athiorhodaceae, ИЛИ пурпурные несерные бактерии (Trttper, Pfennig, 1981; Pfennig, TrUper, 1983).
Деление пурпурных бактерий на серные и несерные было предложено еще Молишем (Moiisch, 1907) на том основании, что первые при окислении сульфида способны откладывать в клетках элементарную серу. Однако, по мере накопления данных о свойствах этих микроорганизмов их характеристика по данному признаку менялась. Показано, что представители рода Ectothiorhodospira, впервые описанные Пельшем (1936), хотя и окисляют сероводород и тиосульфат, но серу в клетках не накапливают (Кондратьева, 1963; Raymond, sistrom, 1969). Установлено также, что способность использовать сульфид и тиосульфат как доноры электронов при фотоассимиляции С02 довольно широко распространена у пурпурных несерных бактерий (Hansen, Gemerden, 1972; Hansen, Veldkamp,1973; Pfennig, 1975; Кеппен, Горленко, 1975). Некоторые из них, например Rhodopseudomonas palustris» Rh.sulfoviridis, Rh.sul fidophiia окисляют сульфид до сульфата без промежуточного образования Серы, другие (Rh.sphaeroides, Rh.capsulata, R.rubrum) только до серы, но накапливая ее вне клеток.
Поэтому В ВОСЬМОМ издании определителя Берги (Bergey s Manual, 1974) Пурпурные Несерные бактерии (семеЙСТВО Rhodospirillaceae) охарактеризованы как микроорганизмы, которые могут использовать в качестве донора электронов сероводород и тиосуль - 8 фат с образованием либо элементарной серы (без накопления ее в клетке), либо сульфатов, но без промежуточного образования серы. Тем самым подчеркивается, что серу данные микроорганизмы не окисляют. При характеристике же пурпурных серных бактерий (семейство chromatiaceae) отмечается, что все виды этого семейства могут использовать в качестве донора электронов сульфид или элементарную серу, окисляя их до сульфатов.
Однако, за последние годы были выделены пурпурные бактерии, близкие по ряду морфологических и физиологических свойств к несерным, но окисляющие сульфид сначала до серы, а затем до сульфатов (Hansen et al., 1975» Neutzling et al.,1984; Компанцева її I др. 1985).
Пурпурные несерше бактерии обладают выраженной тенденцией к фотогетеротрофному образу жизни. Они предпочтительно используют органические вещества - ацетат, пируват, лактат и ряд других как Н-доноры и источники углерода. Кроме,того, для большинства типична потребность в витаминах группы В. Но, многие виды способны расти и в фотоавтотрофных условиях, хотя хуже, чем при наличии органических веществ (pfennig, 1969 а,ъ).
Напротив, все пурпурные серные бактерии можно рассматривать как автотрофов, так как они растут на чисто минеральных средах, содержащих углекислоту, или при добавлении к ним витамина Вго» но не требуя при этом субстратных количеств органических соединений. Более того, часть этих микроорганизмов относят к категории так называемых облигатных автотрофов, так как их возможности ассимилировать кроме углекислоты другие соединения углерода весьма ограничены. МНОГИе ВИДЫ Rhodospirillaceae МОГУТ раСТИ В ТЄМНОТЄ В - э аэробных и (или) микроаэробных условиях (Кондратьева, 1963; pfennig, Trttper, 1973). Пурпурные серные бактерии более чувствительны к кислороду, но и среди них есть виды, растущие в темноте в присутствии кислорода. К их числу относятся, например, Thiocapsa roseopersicina, Amoebobacter roseus И некоторые ВИДЫ Chromatium (Богоров, 1974; Горленко, 1974; Кондратьева и др., 1976).
За последние годы показано, что ряд пурпурных серных и несерных бактерий способен расти, в темноте в присутствии кислорода не только на органических средах, но и в хемолитоавтотрофных условиях, получая энергию при окислении сульфида, тиосульфата или молекулярного водорода. В темноте как и на свету они ассимилируют СО2 в результате функционирования рибулезобисфосфатно-го цикла (Богоров, 1974; Кондратьева и др., 1975). Показана кроме того способность некоторых пурпурных серных и несерных бактерий к росту в темноте в анаэробных условиях. При этом они осуществляют брожение или анаэробное дыхание (SchSn, 1968; uffen, Wolfe, 1970; Красильникова и др., 1975).
Таким образом, в настоящее время трудно провести четкую границу между серными и несерными пурпурными бактериями, и вопрос о том, следует ли их разделять на два семейства, а также на основании каких признаков, остается открытым. В течение долгого времени важным признаком при классификации фототрофных пурпурных бактерий считалась форма микроколоний, г то есть агрегатов клеток, которые они образуют. Однако, такой .1 признак ненадежен для систематики, так как зависит от условий их роста (pfennig, 1977). В восьмом издании определителя бактерий Берги (1974) в качестве главного признака при выделении ро - 10 дов рассматривается морфология индивидуальных клеток с учетом способности к движению и, соответственно, способов жгутикования, образованию газовых вакуолей и некоторых других свойств. Однако, этот принцип не всегда выдержан.
Пурпурные бактерии представлены микроорганизмами очень разнообразными по морфологическим признакам. Три рода пурпурных не-серных бактерий Rhodospirillum, Rhodomicrobiura, Rhodocyclus ХОРОШО различаются морфологически, а четвертый род Rhodopseudo-monas включает морфологически различные бактерии - с формой клеток ОТ Сферической ДО овальной (Rh.capsulata, Rh.sphaeroides Rh.sulfidophila, Rh.globiformis), С палочковидными И ИЗВИТЫМИ клетками (Rh.geiatinosa) и представляющие собой разных размеров палочки (Rh.palustris, Rh.viridis, Rh.sulfoviridis, Rh.aci-dophila). они различаются также по способу размножения, типу фотосинтезирующей мембраны (Pfennig, 1977) и по сложности жизненных циклов.
. Анализ семантид у пурпурных бактерий
Исследование первичной структуры высокомолекулярных рибосо-мальных РНК, несомненно, является очень полезным при реконструкции путей филогенеза. Эти макромолекулы наилучшим образом удовлетворяют требованиям, предъявляемым к филогенетическим маркерам: они универсально распостранены, функционально постоянны, консервативны И достаточно ЛеГКО ВЫДеЛЯЮТСЯ (Stackebrandt, Woese, 1981). Построения дендрограмм основаны на использовании коэффициента ассоциации s , который отражает сходство последовательностей 16S ррнк при попарном сравнении. Значения S B варьируют от I для идентичных РНК до 0 для абсолютно различных последовательностей (Stackebrandt, Woese, 1981).
По наборам олигонуклеотидов в 16S рРНК пурпурные бактерии образуют три группы (Gibson et al, 1979). В первую группу (I класс РНК) входит большинство видов рода Rhodopseudomonas, а такясе других родов - Rhodo spirillum rubrum И Rhodomicrobium vannielii. Ко второй группе (П КЛаСС РНК) ОТНОСЯТСЯ бактерии трех РОДОВ - Rhodopseudomonas gelatinosa, Rho-dospirillum tenue, Rhodocyclus purpureus. К третьей группе (Ш класс РНК) до недавнего времени относили только два вида пурпурных серных бактерий - chromatium vi-nosum и Thiocapsa roseopersicina как единственные, охарактеризованные по значениям sAB. Однако, недавно были получены значения коэффициента ассоциации для бактерий восьми из десяти родов семейства chromatiaceae(Powier et al., 1984). Все исследован - 22 ные бактерии также относятся к третьей группе. Все три группы находятся друг от друга примерно на равном эволюционном расстоянии (SAB = 0,35). Пурпурные бактерии каждой из групп имеют близких "родственников" среди грамотрицательных аэробных хемотрофов (Fox et al., 1980; Gibson et al., 1979). Так, первую группу, включив в нее ряд хемотрофных бактерий, можно разбить на три подгруппы: I. paracoccus denitrificans и Rh.capsulata ( S g = 0,7), Rh.sphaeroides. 2. Rhizobium leguminozarum и Rh.viridis (S.B = 0,54)» Uitrobacter winogradskyiи Rn.palustris (SAB= 0,76), Rm.vannielii (Seewaldt, 1982). 3. Aquaspirillum itersonii, R.rubrum.Ko второй подгруппе относятся также недавно выделенные почвенные бактерии НОВОГО рода Phenylobacterium immobile, ис пользующие как источники углерода, гербициды и анальгетики (budwig et al., 1984). Вторая Группа СОДерЖИТ ДВа НефОТОТрофНЫХ Вида - Alcaligenes faecalis и Sphaerotilia natans. Последний очень близок к Rh.ge-latinosa (SAB - 0,72) Наконец, третья, самая многочисленная группа, включает наряду с фототрофами большинство таких грамотрицательных форм как энтеробактерии, вибрионы, флюоресцирующие псевдомонады и других. Полученные результаты опровергают традиционные представления о филогенетической обособленности фотосинтезирующих бактерий, согласно которым все организмы произошли от общего анаэробного гетеротрофного нефотосинтезирукщего предка, а способность к фотосинтезу возникла однажды в одной из сильно дивергированных линий развития (van ніеі, 1946).
Они являются прямым подтверждением "конверсионной" гипотезы Броды (Broda, 1975) о возникновении грамотрицательных хемотрофных бактерий ОТ фОТОТрофнОГО анаэробного предка (Gibson et al., 1979; Stackebrandt, Woese, 1981; Woese et al., 1980). Более того, сравнительный анализ каталогов 16s рРНК позволил группе Вуза, по-иному поставить вопрос об общем бактериальном предке (Fox et ai., 1980).в филогенетических схемах, построенных исходя из этих даншх, четыре из восьми основных линий развития прокариот представлены фотосннтезирующими формами; минимальные значения коэффициента ассоциации (ЗдВв о »31) в группе пурпурных бактерий такие же низкие как в группе клостридий (S&g- О »29) , кроме того первичным и важнейшим источником энергии на Земле является солнечный свет (Woese, 1979). Все это позволило Вузу с соавторами выдвинуть на роль предшественника истинных бактерий фотосинтезирущие, возможно автотрофные, организмы 0?ox et al., 1980).
При исследовании низкомолекулярных 5S рРНК также может быть получена ценная информация, но применение ее для выявления филогенетического родства организмов ограничено из-за малых размеров (всего П6-І20 нуклеотидных пар) этих молекул. По результатам определения последовательностей 5S рБЖ строят филогенетические дендрограммы, используя метод матриц (Hori, osawa, 1979) или метод предковой последовательности (Ktintzei et al., 1983). Несмотря на некоторые различия, в целом дендрограммы, построенные по данным 16S И 5S рРЩ совпадают (KUntzel 1982 ; DeWachter et al., 1984). Первое ветвление на дендрограмме 5S рРНК эубактерий, архе-бактерий, эукариот и их клеточных органелл, отделяет эубактерий и митохондрии от группы, содержащей общие предковые последовательности архебактерий и эукариот. У самого основания в группе эубак-терий-митохондрий ответвляются линии, ведущие к бактериям рода Thermus, Rhodospirillum rubrum, Paracoccus denitrificans и к митохондриям. При этом R. rubrum и p. denitrificans обнаруживают очень высокое сходство последовательностей 5S рРНК с 5S рРНК митохондрий, гораздо большее, чем с другими группами эубактерий (KUntzei et ai., 1983). Это свидетельствует в пользу симбиотиче-ской теории происхождения митохондрий.
Нуклеотидный состав ДНК
Нуклеотидный состав ДНК - существенный таксономический признак, который нередко оказывается общим не только для штаммов одного рода, а и разных, но близкородственных родов. Широкому использованию этого признака в геносистематике положили начало работы Белозерского и ли с соавторами. Они показали, что ДНК близких в систематическом отношении видов характеризуется сходными значениями величин отношения Г + Ц / А + Т, показателя специфичности состава ДНК (Lee et ai., 195б; Белозерский, 1957; Спирин и др., 1957). Сейчас с помощью этого критерия уже уточнено систематическое положение целого ряда групп микроорганизмов, выявлена гетерогенность многих фенотипически однородных таксонов, идентифицированы ноше штаммы (Блохина, Леванова, 1976).
Нуклеотидный состав ДНК варьирует у бактерий в очень широких пределах - от 25 до 75$ГЦ. Штаммы, принадлежащие к одному виду, обычно имеют практически одинаковый состав ДНК. Бактерии, относящиеся к видам одного рода, как правило, имеют близкие значе Чения ГЦ - различия не превышают Ю% (Sueoka, 1961; DeLey, van Muylem, 1963; Marraur et al., 19бЗ)- Таксономическая ОДНОРОДНОСТЬ родов с различием в ГЦ содержании более 15$ в лучшем случае сомнительна (DeLey, 1978). Если различия в составе ДНК составляют 20-30 моль$ ГЦ, то организмы можно считать лишь очень отдаленно родственншли, т.к. это значит, что в их ДНК из-за значительной дивергенции практически нет общих нуклеотиднБіх последовательностей (DeLey, 1969). Однако, близкие значения ГЦ не обязательно свидетельствуют о родстве организмов. Иногда одинаковым нуклеотидным составом обладают бактерии, принадлежащие к отдаленным таксономическим группам (Блохина, Леванова, 1972).
Нуклеотидный состав ДНК пурпурных несерных бактерий семейства Rhodospiriiiaceae варьирует в довольно узких для таксона такого ранга пределах - от 60 до 67 моль$ ГЦ у видов Rhodospi rillum; 64-70$ ГЦ У ВИДОВ Rhodopseudomonas и 62-65$ ГЦ У Rm. vannielii (Hill, 1966; Pfennig, 1967; Silver et al., 1971;
Mandei et al., 1971). Нуклеотидный состав серных бактерий варьирует в пределах от 45 до 70 моль$ ГЦ, причем наибольший интервал варьирования наблюдается у рода chromatium: от 48$ у крупноклеточных ВИДОВ Chr.okenii, Chr.weissei до 70$ У Chr.gracile(BaHDIDHH, Белозерский, I960; Pfennig, 1967; Mandei et al., 1971).
Использование данных по нуклеотидному составу помогает в решении проблем иерархии и эквивалентности таксонов в системе. Однако этот критерий не позволяет судить о рангах таксонов и их взаимосвязи. В этом отношении неоценимую помощь может оказать метод молекулярной гибрдизапии ДНК.
Метод молекулярной ДНК-ДНК гибридизации не позволяет определить порядок чередования нуклеотидов в последовательностях ДЖ, однако дает возможность интегральной оценки степени сходства генетического материала сопоставляемых видов организмов, и в этом его главное достоинство. Суть метода заключается в том, что денатурированные ДНК разного происхождения реассоциируют совместно и при этом образуются двухцепочечные гибридные ДНК. Сравнивая эффективность образования гибридных молекул в такой гетерологичной реакции с результатами реассоциации гомологичных молекул, можно определить относительное число общих (гомологичных) нуклеотидных последовательностей в ДЖ разных видов. Измеряя термостабильность этих гибридных молекул ДНК, можно оценить степень соответствия гомологичных последовательностей. Степень и правильность реассоциации в значительной мере зависят от условий эксперимента - правильно подобранные условия позволяют определить относительные количества "близко" и "отдаленнородственных" последовательностей ДНК. В настоящее время используются два основных метода гибридизации, для каждого из которых описан целый ряд модификаций: ре-ассоциация ДЖ исследуемых видов в растворе с последующим отделением гибридов на гидроксиапатите (Brenner et ai.,i969), и гибридизация между ДЖ, иммобилизованной на мембранном фильтре и меченой ДЖ В растворе (Gillespie, Spiegelman, 1965; Denhardt, 1966; Legault-Demare et al., 1967; DeLey, TiD tgat, 1970). В pactbope возможна также гибридизация с использованием немеченных ДНК и обнаружением гибридов оптическим способом (DeLey et al., 1970).
На степень реассоциации влияет целый ряд параметров; это и нуклеотидный состав, и размер реагирующих фрагментов, соотношение меченой и немеченой да, природа и концентрация солей, концентрация формамида и дтютилсульфоксида (Брэдли, Эквист, 1977; Валъехо-Роман, 1980). Но решающшл фактором является правильный выбор температуры. Оптимальной для реассоциации является температура примерно на 25 ниже температуры плавления нативной ДНК (Johnson, Ordai, 1968; Anderson, ordai, 1972). Теоретически, можно строить фнлодендрограммы, отражающие родство организмов и основанные на степени гомологии ДНК, используя широкий диапазон температур, от 40 до 10 ниже температуры плавления, но разрешающая способность их при этом различна и выбор температуры определяется целями исследования. Использование повышенной по сравнению с оптимальной температуры, на 15 ниже Т плавления (для видов с высоким содержанием ГЦ это составляет 75-80) позволяет шбридизацию только строго комплементарных последовательностей, в результате чего степень гибридизации уменьшается, но возрастает доля термостабильных гибридов. Гомологии ДНК в этом случае отражают близкое родство организмов на видовом и внутривидовом уровнях (БеЪеу, 1978). Правда, при таких высоких температурах возрастает опасность смыва ДНК с фильтров. Поэтому целесообразно в данном случае проводить гибридизацию при оптимальной температуре, а для более точной оценки степени родства организмов,(когда процент связывания в гомологичной и гетерологичной реакции различается на величину, меньшую, чем ошибка определения) определять совершенство образовавшихся гибридов по снижению термостабильности гибридных дуплексов.
Показано, что снижение Т плавления гетерологичного дуплекса на 0,7-1,6 по сравнению с гомологичным соответствут 1% не-спареншх оснований в сравниваемых последовательностях (Laird et ai., 1969; McCarthy, Parquhar, 1972). Снижение точки плавления ( д Т) очень удобный критерий при изучении близкородственных форм еще и потому, что не зависит от способа определения степени гибридизации, тогда как относительная степень гибридизапии может существенно изменяться в зависимости от используемого метода (Grimont, Popoff, 1980; Grimont et al., 1980).
При температурах инкубации ниже Топтимальной наряду с комплементарными участками двойных цепей образуются гибриды между дальнородственными последовательностями, которые за счет неспецифических связей дают "ложные" пары оснований, что ведет к увеличению степени гибридизации. Число ложноспарешшх основании сильно возрастает с понижением температуры и при проведении гибридизапии на 50 ниже температуры плавления (или на 25 ниже Топт#) оно достигает 33$ (Howley et al., 1979).
Выделение и очистка препаратов ДНК
Выделение и очистка препаратов ДНК для выделения ДНК бактериальную массу промывали раствором, содержащим 0,15 М Had + 0,1 М этилендиаминтетрацетата (ЭДТА), рН = 8,3-8,5,центрифугировали и ресуспендировали в стандартном солевом растворе, содержащем 0,15 М Naci+ 0,015 М цитрат натрия, рН = 8,0 (I х ssc). Замороженные в жидком азте клетки разрушали при помощи Френч-пресса (избыточное давление 10 - 15 атм.), а затем лизировали в присутствии проназы ("Serva", 100 мкг/мл) и 1% додецилсульфата натрия при 37С в течение 30 минут. Об окончании лизиса судили по резкому повышению вязкости, просветлению раствора, а также по формированию осадка ДНП при внесении капли лизата в 96$ раствор этанола.
В лизат добавляли постепенно масі в порошке до конечной концентрации 1-2 М. Раствор инкубировали еще в течение 15-30 минут, периодически встряхивая. Вязкость раствора при этом несколько понижалась за счет разрушения нувяеопротеидного комплекса.
Затем проводили депротеинизацию, добавляя равный объем хлороформа С ИЗОамиЛОВЫМ СПИРТОМ В ОТНОШеНИИ 24:1 (Мататг,19б1) и встряхивая смесь в течение нескольких минут. Смесь центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 мин. при 4С, отбирали слой, содержащий ДНК, а промежуточную фракцию промывали I М Nad для экстракции адсорбированных белком нуклеиновых кислот и водные растворы объединяли. Операцию повторяли до исчезновения слоя денатурированных белков (3-4 раза).
Из очищенного таким образом водного раствора двумя объемами охлажденного 96$ этанола осаждали ДНК. Для этого медленно вливали раствор в спирт при постоянном перемешивании, на этой стадии обычно происходила очистка от пигментов. ДНК, содержащую значительные примеси РНК, белков и полисахаридов, перерастворяли в стандартном солевом растворе и осуществляли последовательные инкубации при 37С в течение 30 мин с рибонуклеазо! (панкреатическая рибонуклеаза, предварительно прогретая в течение Ю мин при 80С для подавления ДНКазной активности в 0,15 М касі), конечная концентрация 50 мкг/мл,и в течение 2 часов с проназой (100 мкг/мл). После этого доводили концентрацию uaci до 2 М и окончательно депротеинизировали хлороформом до исчезновения промежуточного слоя белков.для очистки ДНК от полисахаридов применяли главным образом изопропаноловое осаждение по Мармуру (Marmur,i96i). для этого ДНК растворяли в 0,1 х ssc, добавляли l/lQ раствора ЗМ ацетата на + 0,001 М ЭДТА, (рН =7,0) и при энергичном перемешивании добавляли по каплям 0,54 объема изопропилового спирта. При этом "медуза" ДНК успевала сформироваться до выпадения в осадок большей части примесей. Цри значительном содержании полисахаридов в растворе ДНК их удаление производили центрифугированием при 18000 об/мин в течение 2 часов. Иногда полисахариды хорошо удалялись при последовательном применении обоих способов. Очищенные препараты ДНК осаждали этанолом и хранили на холоду в 70$ этаноле. Выход очищенной ДНК составлял обычно 8-Ю мг на Ю г сырой массы бактерий;. Характеристика полученных препаратов ДНК
Чистота препаратов ДНК оценивалась исходя из величин отношения оптических плотностей ее растворов при 260, 280 и 230 нм; При этом добивались, чтобы отношение Е 260/Е 230 было больше 1,8 (очистка от белка), а Е 260/Е 230 больше 2,0 (очистка от полисахаридов) . О степени нативности препаратов судили по характеру кривых плавления и по гиперхромному эффекту. Спектры поглощения образцов ДНЕС снимали на спектрофотометре "unikam SP-800" в интервале длин волн от 225 до 300 нм в стандартном солевом растворе. Кривые плавления были получены на спектрофотометре "unikam SP-800", оборудованном обогревающим устройством и термостатированной кюветой, при плавном повышении температуры от 25 до Ю0С. Образец ДНК растворяли в 0,1 х ssc, диализовали против 500 объемов того же раствора для удаления низкомолекулярных примесей. Для снятия кривых плавления использовали растворы дж с концентрацией 25 мкг/мл, что соответствует поглощению при 260 нм около 0,5 о.е. Температуру плавления определяли как температуру, при которой относительная величина поглощения раствора ДНК при 260 нм достигает половины максимальной. Гиперхромный эффект определяли, выражая в процентах разницу между величинами оптической плотности при максимальной температуре и при 25С. Он составлял 30-35$, что свидетельствовало о нативности препаратов ДНК. Степень полимерности и гомогенности по молекулярной массе оценивали с помощью седиментационных характеристик ДНК, полученных методом аналитического центрифугирования при рН 7,0 на ультрацентрифуге с адсорбционной оптикой марки "Beckman" при длине волны 265 нм, скорости вращения ротора 48000 об/мин и температуре 20С. Дяя проведения ультрацентрифугирования раствор ДНК в I х ssc с концентрацией 10-15 мкг/мл (поглощение 0,2-0,3 о.е.) диализовали в течение ночи против 500 объемов этого же солевого раствора с целью удаления низкомолекулярных примесей. - 61 По полученной седиментограмме определяли коэффициент седиментации, молекулярная масса ДНК, согласно формуле расчета по коэффициенту седиментации (studier, 1965)» составляла-в среднем 7 х ТО6 дальтон (коэффициенты седиментации ДЗК в двухцепочечном состоянии 19-24 s ), что соответствует требованиям эксперимента по молекулярной гибридизации ДНК-ДНК.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
