Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Организация фотосинтезирующего аппарата пурпурных бактерий 9
1.1. Морфология пигментсодержащих мембран пурпурных бактерий 9
1.2. Химический состав пигментсодержащих мембран . II
1.3. Пигменты фототрофных бактерий 15
1.3.1. Бактериохлорофилл .15
1.3.2. Каротиноиды 17
1.3.3. Состояние пигментов в клетках и пигментсодержащих мембранах пурпурных бактерий 18
1.3.4. Функции пигментов 20
1.4. Методы фракционирования фотосинтезирущего аппарата бактерий 22
1.5. Характеристики различных типов пигмент-белковых комплексов пурпурных бактерий 27
1.5.1. Реакционные центры 27
1.5.2. Светособирающие комплексы 870 30
1.5.3. Светособирающие комплексы 800-850 33
1.5.4. Комплексы Б 890 39
Глава II. Изменения в фотосинтезирующем аппарате пурпурных бактерий в зависимости от условий среды 43
Глава III. Объекты и методы исследования 54
111.1. Объекты исследования и культивирование бактерий 54
111.2. Выделение пигментсодержащих мембран 55
111.3. Выделение пигмент-белковых комплексов 56
111.3.1. Выделение Б 890 и ССК 800-850 c.minutis-simum и Rh.palustris методом электрофореза В ПААГ 56
111.3.2. Выделение Б 890 и ССК 800-850 методом гель-фильтрации на сефарозе 6Б и биогеле А-1,5м 58
111.3.3. Выделение ССК 870 R.rubrum 58
111.4. Определение концентрации пигментов 59
111.5. Определение веса сухой биомассы 59
111.6. Определение количества липидов 59
111.7. Определение общего количества углеводов . 59
111.8. Определение общего количества белка 61
111.9. Оценка молекулярных масс пигмент-белковых комплексов 61
111.9.1. Методом электрофореза в ПААГ 61
111.9.2. Методом гель-фильтрации на сефарозе 6Б . 62
111.10. Оценка молекулярных масс белков пигмент-белковых комплексов 64
111.11. Определение аминокислотного состава ССК 800- 850 68
111.12. Определение и-концевых аминокислот ССК 800- 850 68
111.13. Определение отношения масс двух белков ССК . 68
111.14. Измерение спектров поглощения 68
111.15. Измерения фотохимической активности РЦ . 68
111.16. Определение содержания цитохромов 68
111.17. Электронная микроскопия клеток пурпурных бактерий 69
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава ІV. Характеристика свойств пигмент-белковых комплексов Б 890 и ССК пурпурных бактерий 70
ІУ.І. Спектральные характеристики ССК 800-850 и Б 890 пурпурных бактерий 73
ІУ.2. Определение молекулярных масс ССК 800-850 и Б 890 78
ІУ.З. Химический состав пигментсодержащих мембран и выделенных из них Б 890 и ССК 800-850 82
ІУ.4. Характеристика белков пигмент-белковых комплексов 84
ІУ.5. Характеристика ССК 870 R.rubrum 90
Глава V. Изменения в фотосинтезирующем аппарате пурпурных бактерий в зависимости от интенсивности света .100
У.І. Влияние интенсивности света на рост, синтез белка И пигментов Rh.palustris И G.minutissimum .100
У.2. Содержание пигментов в мембранах пурпурных бактерий в зависимости от освещенности 114
У.З. Влияние интенсивности света на организацию пигмент белковых комплексов Б 890 и ССК 800-850
пурпурных бактерий 120
У.4. Влияние изменения освещенности на рост и пигментную систему Rh.palustris .126
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 134
ВЫВОДЫ 141
ЛИТЕРАТУРА 143
- Морфология пигментсодержащих мембран пурпурных бактерий
- Изменения в фотосинтезирующем аппарате пурпурных бактерий в зависимости от условий среды
- Объекты исследования и культивирование бактерий
- Спектральные характеристики ССК 800-850 и Б 890 пурпурных бактерий
- Влияние интенсивности света на рост, синтез белка И пигментов Rh.palustris И G.minutissimum
Морфология пигментсодержащих мембран пурпурных бактерий
Длительное время не было данных о структурах, в которых локализованы пигменты фототрофных бактерий. Попытки выделить и охарактеризовать состояние пигментов у пурпурных бактерий начались с работ Френча (French, 1938). Применяя осаждение сульфатом аммония, он выделил "бактериохлорофилл-белковый комплекс" из водных экстрактов Rhodospirillum rubrum со спектром поглощения, аналогичным для целых клеток. Позднее (schachman et ai., 1952) в результате использования дифференциального центрифугирования была получена фракция, содержащая все пигменты R.rubrum со спектром, характерным для целых клеток. Она была гомогенной, имела константу седиментации 190S и состояла из везикулярных частиц диаметром 60-110 нм, названных хроматофорами. Вскоре было показано, что хроматофори обладают фотофосфорилирущей активностью (Prenkei, 1954). С этого времени и начались интенсивные исследования структуры и функций пигментсодержащих мембран пурпурных бактерий.
В настоящее время установлено, что наличие внутриклеточных пигментсодержащих мембран характерно для большинства пурпурных бактерий при их росте в присутствии света в анаэробных и микро-аэрофильных условиях (Remsen, 1978). Исключение составляют R. tenue и Rh.geiatinosa. Их фотосинтвзирующий аппарат локализован в цитоплазматическои мембране (wakim et ai., 1978).
Показано также, что пигментсодержащие мембраны возникают в результате разрастания внутрь клеток цитоплазматическои мембраны. Это подтверждается как данными электронно-микроскопических исследований, так и опытами по включению меченых предшественников (32в-фосфолипидов и 14с-ацетата) в мембранные структуры Rh. capsulata и R.rubrum (Oelze, Drews, 1972).
Внутриклеточные мембранные структуры пурпурных бактерий по своему внешнему виду очень разнообразны. У ряда видов они имеют форму пузырьков с диаметром 20-100 нм, которые, как уже отмечалось, ПОЛУЧИЛИ название хроматофоров (R.rubrum, Rhodopseudomonas sphaeroides, Rh.capsulata, Chromatium shp., Thiocapsa roseoper-sicina), у некоторых ламелЛЫ (Ectothiorhodoshira, Rh.palustris, Rh.viridis) или трубочки (T.pfennigii) (Черни и др., 1969; Кондратьева, 1972; Oelze, Drews, 1972; Remsen, 1978).
Следует отметить, что иногда форма внутриклеточных пигмент-содержащих мембран у одного и того же вида может изменяться. Так, у бескаротиноидного мутанта Rh.sphaeroides R-26 обнаружены
И хроматофори И ЛамеЛЛЫ (Lommen, Takemato, 1978), ХОТЯ у штамма дикого типа ламеллы отсутствуют. Возможно, что наличие ламелл наряду с хроматофорами у Rh.sphaeroides R-26 связано с нарушениями в синтезе каротиноидов. Так, в клетках R.rubrum отмечено образование концентрических ламелл при ингибировании синтеза каротиноидов 2-ГИДр0КСИбифенИЛ0М (Maudinas et al., 1973).
Показано, что не только форма, но и число пигментсодержащих мембран, а также их локализация зависят от условий роста бактерий, и, в первую очередь, - от интенсивности света и наличия кислорода (см. главу II).
Объекты исследования и культивирование бактерий
Из факторов внешней среды, оказывающих влияние на организацию ФСА пурпурных бактерий, следует отметить такие, как интенсивность света (Gobel, 1978), парциальное давление о2 (Drews, Oeize, 1981), ИСТОЧНИКИ азота (Morita et al., 1981), серы (Hayashi, Мо-rita, 1980; Hayashi et al., 1981), температуру (Lien er al., 1973; Kaiser, Oeize, 1980; Mechler, Oeize, 1978a,b) (рис.3).
Величина насыщающей интенсивности света для фотосинтеза у одного и того же вида пурпурных бактерий зависит от таких параметров, как плотности клеток, температуры, концентрации С02, наличия органических веществ, характера доноров электронов и приходится на область от 5-Ю3 до 60»І03 эрг/см «сек (Кондратьева, 1963; Gobel, 1978).
Эта величина также может сильно варьировать у разных видов бактерий (Максимова, 1957, 1958; Нестеров и др., 1966; Mechler, Oeize, 1978а). Как правило, порог светового насыщения более высокий при росте пурпурных бактерий на минеральных средах, содержащих бикарбонат в качестве источника углерода (Ерохин и др., 1964; Осницкая, Чудина, 1971).
Известно, что интенсивность света оказывает влияние на содержание пигментов, белков, скорость размножения клеток и эффективность фотосинтеза (Кондратьева, 1956; Cohen-Bazire et al., 1957; Шапошников И др., 1961; Aiking, Soika, 1979; Schumacher, Drews, 1979; Golecki et al., 1980; Цыганков И др., 1982). При высокой интенсивности света отмечена более высокая скорость размножения некоторых пурпурных бактерий и образование значительно большего количества суммарного белка. Количество мембран и содержание БХЯ в пурпурных бактериях находится в обратной зависимости от интенсивности света, при которой они растут (Cohen-Bazi-re et al., 1957; Gohen-Bazire, Kunisawa, 1963; Drews, Oelze, 198l).
В зависимости от интенсивности света у пурпурных бактерий может изменяться не только содержание пигментсодержащих мембран, но и их форма. Например, в клетках Ch romatium ар. штамм D, выращенных при интенсивности света 80000 лк, вместо везикул формируются ламеллы (Fuller et al., 1963).
Поскольку количество пигментсодержащих мембран изменяется обратно пропорционально интенсивности света, то можно предположить, что удельное содержание БХЛ в них будет постоянным. Однако прямые определения показали, что фототрофные бактерии могут регулировать содержание пигментов на клетку различным! путями: во-первых, путем изменения количества мембран с фиксированным содержанием ЕХЛ; во-вторых, путем изменения содержания БХЛ в одном и том же количестве мембран или комбинацией этих способов (Cohen-Bazire, Sistrom, 1966).
Объекты исследования и культивирование бактерий
Объектами наших исследований были пурпурные несерные бактерии Rh.palustris штамм 1К и штамм АБ, R.rubrum штамм R-1 и пурпурная серная бактерия c.mirmtissimum из коллеіщии культур кафедры микробиологии Московского государственного университета. Культуры c.minutissimum выращивали на минеральной среде Ларсена, содержащей ацетат натрия (0,2%) и сульфид или тиосульфат (0,05-0,3/0 (Кондратьева, 1963). Для выращивания Rh.palustris использовали среду Хатнера (Cohen-Bazire et ai., 1957) с малатом и среду Гриффитса и Станиера (Griffiths, stanier, 1956) с малатом.
R.rubrum культивировали на среде Ормеруда (Ormerod et al., 1961) с малатом. Все среды готовили на дистиллированной воде и стерилизовали в автоклаве при I атм. рН сред устанавливали равными 6,8-7,5.
Культивирование пурпурных бактерий проводили в периодических условиях в микробиологических матрацах емкостью 1,6 л в стерильных анаэробных условиях. Матрацы помещали в камеры, через которые с помощью термостата "У-10" прокачивали воду (t 28-30С). В качестве источника света применяли биепиральную лампу накаливания ПЖ-1000 в I квт. Освещение варьировали от 500 до 30000 лк, изменяя расстояние от источника света или помещая перед матрацами с бактериями ослабляющие, нейтральные фильтры. Эти значения лежат заведомо за пределами насыщающей интенсивности света. В качестве посевного материала использовали культуры бактерий, выращенных при освещении 1000 лк.
Биомассу собирали из культур в экспоненциальной и стационарной фазах роста, которые определяли:
1) по образованию клетками БХІ;
2) прямым счетом клеток в камере Горяева с помощью микроскопа МБИ-6 (Владимирова, Семененко, 1962);
3) по синтезу клетками белка;
4) по содержанию ДНК, которую определяли в суммарном экстракте
Клетки осаждали на проточной центрифуге и хранили при -4-1 не более I месяца.
C.minutissimum, R.rubrum ИМЄЮТ Внутриклеточные ПИГМеНТСОДер-жащие мембраны везикулярного типа, называемые хроматофорами (oeize, Drews, 1972). Для их выделения клетки разрушали растиранием с окисью алюминия в течение 15-20 мин или озвучиванием на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-І в течение 1-2 мин (частота 15 кгц, ток 0,4 А) при 0-н-4С в 0,05 М трис-нсі буфере (рН 8,0).
Неразрушенные клетки и крупные осколки отделяли двухкратным центрифугированием в течение 20 мин при гоооо g. Полученный супер-натант подвергали центрифугированию при 144000 g в течение 90 мин. Осадок, представляющий грубую фракцию хроматофоров, ресуспендиро-вали в рабочем буфере для электрофореза (0,01 М трис-глициновый буфер, рН 7-8).
Спектральные характеристики ССК 800-850 и Б 890 пурпурных бактерий
Значения ММ комплексов Б 890 при использовании большинства способов варьируж в пределах 200000-300000 д (табл.6). Большие значения ММ Б 890 (в среднем около I млн), полученные гель-фильтрацией на сефарозе 6Б пигментсодержащих мембран, обработанных тритоном Х-100, могут быть связаны агрегацией комплексов.
Значения ММ комплексов Б 890 C.minutissimum И Rh.palustris (250000+50000 д) меньше в 2-3 раза величин, которые были найдены для близких по свойствам ПЕК, выделенных из мембран с.vinosum обработкой ДСН (Thornber, 1970), ДСН И Бридж-58 (Halsey, Byers, 1975), а также ИЗ Rh.sphaeroides С ПОМОЩЬЮ тритона Х-100 (Reed, 1969). По-видимому, полученные указанными авторами значения ММ относятся к димерам комплекса, которые образуются в присутствии неионного детергента тритона Х-100. В присутствии ДСН комплексы Б 890, по всей вероятности, находятся в мономерной форме. Это предположение подтверждают близкие значения ММ Б 890, рассчитанные с помощью данных электронной микроскопии, а также измерения соотношения белков РЦ с другими белками комплекса (по окраске в геле или из прямого определения количества белка) (Ерохин и др., 1978).
Определение ММ ССК 800-850 пурпурных бактерий методом электрофореза в ПААГ с ДСН показало значительное расхождение между результатами, полученными при использовании гелей с различной пористостью (табл.6, рис.5). Значение ММ ССК 800-850, полученное методом гель-фильтрации на колонках с сефадексом Г-200 и сефарозой 6Б в присутствии ДСН, совпадает со значением, полученным при использовании крупнопористого 5%-ного ПААГ (табл.6).
Сопоставление этих результатов позволяет объяснить существенное завышение ММ при использовашш 10%-ного ПААГ "торможением" комплексов по сравнению с белками-маркерами в этом мелкопористом геле, что может быть вызвано различием их формы в присутствии ДСН. Данный метод определения ММ применим для гидрофильных белков, тогда как в данном случае анализировались гидрофобные белки.
При определении ММ ССК 800-850 c.minutissimum, выделенного электрофорезом, гель-фильтрацией на сефадексе Г-100 в присутствии 0,1%-ного тритона Х-100, было получено среднее значение -105000 д, что примерно в 2 раза выше значения, полученного при использовании 5%-ного ПААГ. Столь большое расхождение между данными, полученными с применением ДСН и тритоном Х-100, обусловлено, скорее всего, тем, что в присутствии тритона Х-100 ССК находится в виде димера.
Влияние интенсивности света на рост, синтез белка И пигментов Rh.palustris И G.minutissimum
При культивировании Rh.palustris штамм 1К в условиях сильного освещения (30000 лк) наблюдается более высокая скорость роста. Размеры клеток как по весу, так и согласно данным электронной микроскопии больше и содержат больше белка (табл.11, рис.23, 24, 25) по сравнению с клетками этого же вида, выращенными при 500 лк. Напротив, содержание пигментов как в расчете на мл культуры (рис. 25), так и на мг белка (рис.26) значительно ниже в клетках Rh.pa-lust ris при росте в условиях высокой освещенности, чем при слабой. Удельное содержание пигментов в таких клетках резко уменьшалось в первые часы роста вследствие быстрого синтеза белков (рис.26, табл.11). Синтез же пигментов при освещении 30000 лк начинался после некоторого лаг-периода (до 12 час).
Измерение штамм 1К, выращенных при слабом (500 лк) и сильном (30000 лк) освещении, показало сходство в ИК-области поглощения и небольшие изменения в каротиноидной области (рис.27А). Это связано с изменением состава каротиноидов. Незначительные изменения отмечены в отношении Ag68 804: 16 151 клеток» выращенных при 500 лк и 1,36 - при 30000 лк. Подобные спектральные изменения отмечены (Pirsow, Drews, 1977) У Rh.palustris штамм 1е5 при выращивании при различной интенсивности света (10 эрг»см «сек - 10 эрг» 2 —Т см сек ). Положение полос поглощения в ИК-области не зависит от условий освещения. Следует отметить, что у Rh.palustris штамм 1К наблюдалось изменение в соотношении пигментов БХЛ/кар. (М/М), причем оно было выше в клетках, выросших при слабом освещении.
