Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Роль остеопоротических нарушений в процессах регенерации и репарации костной ткани 13
1.2 Влияние микроциркуляции и сосудистого эндотелия на ремоделирование и репаративную регенерацию костной ткани 18
1.3 Фармакотерапия нарушений функционирования сосудистого эндотелия L-аргинином, эналаприлом и лозартаном 28
2. Материалы и методы 35
2.1 Моделирование экспериментального остеопороза 35
2.2 Моделирование закрытых остеопоротических переломов бедренных костей и их остеосинтез 35
2.3 Измерение уровня микроциркуляции в кости, проведение функциональных сосудистых тестов 38
2.4 Гистоморфометрическая оценка развития экспериментального остеопороза и эффективности его коррекции 40
2.5 Обоснование доз препаратов и дизайн исследования 41
2.6 Статистическая обработка первичных данных исследования 42
3. Результаты собственных исследований 48
3.1 Изучение развития экспериментального остеопороза с использованием результатов измерения уровня костной микроциркуляции, функциональных сосудистых проб и гистоморфометрического исследования 48
3.2 Изучение остеопротективного действия препарата Кальций-Д3 Никомед при экспериментальном остеопорозе 58
3.3 Изучение остеопротективного действия L-аргинина при экспериментальном остеопорозе 63
3.4 Изучение остеопротективного действия L-аргинина в комбинации с эналаприлом при экспериментальном остеопорозе 68
3.5 Изучение остеопротективного действия L-аргинина в комбинации с лозартаном при экспериментальном остеопорозе 75
3.6 Изучение влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах 84
3.7 Изучение влияния препарата L-аргинин на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах 92
3.8 Изучение влияния L-аргинина в комбинации с эналаприлом на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах 96
3.9 Изучение влияния L-аргинина в комбинации с лозартаном на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах 99
Заключение 104
Выводы 113
Практические рекомендации 115
Список сокращений 116
Список литературы 117
- Влияние микроциркуляции и сосудистого эндотелия на ремоделирование и репаративную регенерацию костной ткани
- Моделирование закрытых остеопоротических переломов бедренных костей и их остеосинтез
- Изучение остеопротективного действия препарата Кальций-Д3 Никомед при экспериментальном остеопорозе
- Изучение влияния L-аргинина в комбинации с лозартаном на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах
Введение к работе
Актуальность исследования. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет остеопороз как «системное заболевание скелета, характеризующееся низкой плотностью костной ткани и нарушением ее микроархитектуры», что приводит к увеличению хрупкости костей и риску возникновения переломов (Genant H.K., 1999; Беневоленская Л.И., 2004). К модифицируемым факторам развития остеопоротических нарушений относят низкое содержание кальция и витамина D, сидячий образ жизни, курение, чрезмерное потребление алкоголя, длительный прием глюкокортикоидов, ревматический артрит; к немодифицируемым факторам можно отнести преклонный возраст, генетическую предрасположенность, снижение веса и менопаузу (Johnell O., 2005; Миронов С.П., 2006; Шилин Д.Е., 2008).
По данным Национального фонда остеопороза (NOF), 10 миллионов человек в США страдают остеопорозом, 80% из них – женщины. Переломы являются одной из основных причин гиподинамии у пожилых женщин, что значительно снижает качество их жизни (Abrahamsen B., 2009; Adachi J.D., 2010). В Соединенных Штатах около 40% женщин в возрасте старше 50 лет страдают от переломов бедер, позвонков или костей запястья, причиной этому является остеопороз. Годовая стоимость лечения переломов в США к 2015 году прогнозируется на уровне более 20 млрд долларов (Burge R., 2007).
Отечественные и зарубежные травматологи-ортопеды утверждают, что
смертность при характерном для остеопороза осложнении – переломе шейки
бедра – в течение первых 6 месяцев после перелома достигает 30% (Михай
лов Е.Е., 1999; Center J.R., 2007; Adachi J.D., 2010). С каждым годом растет
число проводимых оперативных вмешательств по поводу переломов костей с
применением разнообразных имплантатов, включая использование
эндопротезов крупных суставов. По имеющимся данным, на каждую пятую
операцию первичного эндопротезирования приходится одно
реэндопротезирование, что чаще всего связано с развитием асептической нестабильности на фоне остеопоротических нарушений (Миронов С.П., 2006; Родионова С.С., 2007; Goldhahn J., 2008).
Как известно, пусковой механизм для манифестации остеопороза – это нарушение равновесия между двумя главными процессами ремоделирования костной ткани: резорбцией и остеогенезом (Беневоленская Л.И., 2008). Существенным звеном в патогенезе развития остеопоротических нарушений, в частности связанных с длительной иммобилизацией, является нарушение трофики кости, приводящее к уменьшению активности и количества остеобластов, а также к активации остеокластов (Alagiakrishnan K., 2003; Carano R.A., 2003; Murphy W.L., 2004; Madeddu P., 2005).
Кровоснабжение кости играет значительную роль в процессах как костного ремоделирования, так и репарации повреждений костной ткани (Alagiakrishnan K., 2003; Murphy W.L., 2004; Гудырев О.С., 2008). Микрососуды костной ткани представлены монослоем эндотелиоцитов и не имеют мышечного и соединительнотканого слоев, следовательно, именно эндотелий опосредует гуморальную регуляцию обмена между остеоцитами и кровью
(Streeten E.A., 1990; Madeddu P., 2005). Следовательно, причиной нарушения кровоснабжения костной ткани может быть дисфункция эндотелия сосудов, которая, таким образом, может приводить к нарушениям образования кости и репаративной регенерации, вызывая остеопороз.
В свою очередь, современная патогенетическая терапия остеопороза включает препараты, как замедляющие костную резорбцию (эстрогены, кальцитонин) и стимулирующие костеобразование (фториды, анаболические стероиды), так и препараты многопланового действия (например, витамин D) (Рожинская Л.Я., 2007; Lyritis G.P., 2010; Марченкова Л.А., 2010; Стабровс-кая Н.В., 2011; Файтельсон А.В., 2012). Это разграничение является условным, так как все препараты так или иначе воздействуют на оба процесса ремоделирования. Однако неуклонный рост частоты остеопороза и остеопоротических переломов демонстрирует, что надежных способов терапии и профилактики этого заболевания не существует.
В то же время современные фармакологические исследования показали положительное остеопротективное действие препаратов, корригирующих дисфункцию эндотелия. К ним в первую очередь относятся ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эналаприл, блокатор ангиотензиновых рецепторов лозартан и фитоалексин резвератрол (Гудырев О.С., 2008; Стабровская Н.В., 2011; Файтельсон А.В., 2012).
Это указывает на актуальность дальнейшего поиска фармакологических агентов для воздействия на процессы костного ремоделирования, а также обосновывает избранное нами направление исследования.
Цель исследования: сравнительное изучение остеопротективного действия L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном для фармакологической коррекции экспериментального остеопороза и нарушений консолидации переломов на его фоне.
Задачи исследования:
1. Изучить антиостеопоротическое действие L-аргинина на модели
экспериментального остеопороза с использованием результатов изучения
кровоснабжения костной ткани, функциональных сосудистых тестов и
морфометрического исследования в сравнении с препаратом Кальций-Д3
Никомед.
-
Изучить антиостеопоротическое действие комбинации L-аргинина с эналаприлом при экспериментальном остеопорозе с использованием результатов изучения кровоснабжения костной ткани, функциональных сосудистых тестов и морфометрического исследования в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед.
-
Изучить антиостеопоротическое действие комбинации L-аргинина с лозартаном при экспериментальном остеопорозе с использованием результатов изучения кровоснабжения костной ткани, функциональных сосудистых тестов и морфометрического исследования в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед.
4. Изучить влияние L-аргинина на репаративную регенерацию кости при
экспериментальных остеопоротических переломах проксимального отдела
бедра у крыс в сравнении с препаратом Кальций-Д3 Никомед.
-
Изучить влияние комбинации L-аргинина с эналаприлом на репаративную регенерацию переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед.
-
Изучить влияние комбинации L-аргинина с лозартаном на репаративную регенерацию переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед.
Научная новизна исследования. Впервые показано, что через 12 недель после операции овариэктомии развивается экспериментальный остеопороз, характеризующийся признаками дисфункции сосудистого эндотелия – повышением коэффициента эндотелиальной дисфункции, значительным снижением уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра и отрицательной динамикой морфометрических показателей.
В работе впервые продемонстрировано, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг в
качестве монотерапии и его комбинации с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и
лозартаном в дозе 6 мг/кг, обладая эндотелиопротективной активностью,
предотвращали локальное ухудшение микроциркуляции в кости
проксимального отдела бедра. Таким образом, L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном способствовали замедлению истончения трабекул в губчатой кости и предотвращению возникновения микроповреждений трабекул, то есть обладали остеопротективным действием.
Настоящее исследование впервые показало, что в группах животных, получавших Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг в течение четырех недель по прошествии восьми недель после произведенной билатеральной овариэктомии, не наблюдалось достоверного влияния препарата на функционирование эндотелия сосудов костной ткани и состояние регионарной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра экспериментальных животных. Кроме того, Кальций-Д3 Никомед не оказывал остеопротективного воздействия при экспериментальном остеопорозе, что выражалось в отсутствии статистически значимого влияния препарата на среднюю ширину костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости.
В работе впервые показано, что L-аргинин и его комбинации с
эналаприлом и лозартаном, вводимые в течение четырех недель после
воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных переломов на фоне
остеопороза, повышали показатели микроциркуляции в формирующейся
костной мозоли проксимального отдела бедра у крыс не только по сравнению с
животными с остеопоротическими переломами бедра, а также животными,
получавшими Кальций-Д3 Никомед, но также и по сравнению с контрольными
животными. Тем самым L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и
лозартаном статистически значимо улучшали частоту консолидации
экспериментальных переломов проксимального отдела бедра на фоне гипоэстрогенного остеопороза.
Научная новизна исследования подтверждается подачей двух заявлений на выдачу патентов РФ на изобретения (заявки № 2013143106 и № 2013143107).
Научно-практическая значимость работы. В диссертационном исследовании обоснована эффективность L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном для коррекции остеопоротических изменений костей скелета и фармакотерапии остеопоротических переломов.
Экспериментально доказано, что использование L-аргинина и его
комбинаций с эналаприлом и лозартаном позволяет нормализовать изменения
соотношений сосудистых реакций эндотелийзависимой и
эндотелийнезависимой вазодилатации.
L-аргинин в качестве монотерапии и в сочетании с эналаприлом и
лозартаном способствует увеличению кровоснабжения костной ткани при
экспериментальном остеопорозе, замедлению отрицательной динамики
гистоморфометрических показателей кости и улучшению процессов
консолидации переломов на фоне экспериментального остеопороза.
Результаты работы позволяют рекомендовать проведение клинических испытаний L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном при распространенном остеопорозе и переломах на его фоне.
Внедрение результатов исследования. На основании данных
диссертационной работы запланировано проведение целенаправленных клинических исследований L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном в фармакологической коррекции остеопоротических нарушений при переломах костей.
Полученные результаты используются в курсах лекций кафедр травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии и фармакологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» и кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».
Связь диссертационного исследования с темами научно-
исследовательских работ организации. Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов лечения и профилактики остеопоротических нарушений с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни пациентов» на 2010-2014 гг., номер государственной регистрации темы – 01201153218.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. L-аргинин в дозе 200 мг/кг при экспериментальном остеопорозе оказывает эндотелиопротективное действие, предотвращая повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции; позволяет избежать снижения локального кровоснабжения бедренной кости; обладает статистически
значимым остеопротективным действием, проявляющимся замедлением уменьшения ширины костных трабекул и предотвращением возникновения их микроповреждений.
2. Комбинированное применение L-аргинина в дозе 200 мг/кг с
эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг при
экспериментальном остеопорозе оказывает более выраженное по сравнению с
монотерапией L-аргинином эндотелиопротективное действие, снижая
коэффициент эндотелиальной дисфункции; эффективно предотвращает
уменьшение кровоснабжения костной ткани бедренной кости; обладает
статистически значимым остеопротективным действием, проявляющимся
замедлением уменьшения ширины костных трабекул и предотвращением
возникновения их микроповреждений.
-
L-аргинин в дозе 200 мг/кг статистически значимо повышает уровень микроциркуляции в зоне экспериментального остеопоротического перелома проксимального отдела бедра по сравнению с крысами с экспериментальными остеопоротическими переломами, что положительно сказывается на процессах репарации костных повреждений. L-аргинин увеличивает число позитивных результатов консолидации переломов на фоне экспериментального остеопороза у крыс.
-
Комбинированная терапия L-аргинином в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг позволяет предотвратить снижение уровня микроциркуляции в межотломковой области перелома проксимального отдела бедра у крыс, что положительно сказывается на результатах регенерации костни. Исследуемые комбинации препаратов увеличивают число позитивных результатов сращения экспериментальных переломов на фоне остеопороза у животных.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
полученных в ходе проведения исследования результатов обеспечивается
выбором современных лабораторных и инструментальных методов получения
экспериментальной информации, адекватных методов статистической
обработки первичных научных данных.
Материалы диссертации были доложены на 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (г. Курск, 2011); на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Республика Татарстан, г. Казань, 2012); на X научно-практической конференции студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвященной 10-летию Института последипломного медицинского образования, «Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины» (г. Белгород, 2012); на IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (г. Волгоград, 2012); на VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (г. Курск, 2013); на заседаниях Курского отделения Ассоциации травматологов-ортопедов Российской Федерации (Курск, 2011, 2012, 2013).
Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр
фармакологии; клинической фармакологии; травматологии, ортопедии и
военно-полевой хирургии; гистологии, эмбриологии, цитологии; оперативной
хирургии и топографической анатомии им. профессора А.Д. Мясникова;
хирургических болезней № 2; НИИ экологической медицины Государст
венного бюджетного образовательного учреждения высшего профес
сионального образования «Курский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Публикации. По материалам диссертационного исследования
опубликовано 16 работ, в том числе три из них – в изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, две – в иностранных изданиях. Поданы две заявки на выдачу патентов РФ на изобретения.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в составлении плана и дизайна исследования, в постановке цели и поиске путей ее достижения. Им проведен подробный анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, выполнялись экспериментальные исследования на 240 самках белых крыс линии Вистар с разделением их на группы: основные, сравнения и контрольные; выбраны критерии рандомизации. Диссертантом самостоятельно производились анализ и обобщение полученных результатов, составление графиков, таблиц и диаграмм, написание диссертации, сопоставление с литературными данными. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия 70-90%.
Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования развития и фармакологической коррекции экспериментального остеопороза и экспериментальных остеопоротических переломов и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 50 рисунков. Библиографический список включает 199 источников, в том числе 119 – на иностранных языках.
Влияние микроциркуляции и сосудистого эндотелия на ремоделирование и репаративную регенерацию костной ткани
В последнее время в научной литературе появляется все больше эпидемиологических, экспериментальных и клинических данных, свидетельствующих о взаимосвязи сосудистой патологии и остеопороза [12, 66]. Существует теория, что ухудшение васкуляризации костной ткани может приводить к развитию ряда остеологических заболеваний, таких как остеопороз [103, 176], на фоне которого замедляются процессы регенерации кости при травматических повреждениях [13, 20].
Кровоснабжение костей происходит за счет разветвленных питающих сосудов метафизарных, эпифизарных и периостальных артериальных сетей [105], включающих в себя артериолы, которые, в свою очередь, делятся на анастомозирующую капиллярную сеть и синусоидные сосуды [187]. В костном мозге синусоиды обладают тонкой высокопроницаемой стенкой, состоящей из монослоя эндотелиальных клеток. Эти клетки поддерживаются сосудистой мембраной, периоцитами и ретикулярными клетками [164]. Сами синусоидные сосуды в окружении ретикулярных клеток, продуцируют значительное количество хемокина (SDF-1), требуемого для поддержания сохранности стволовых клеток [154]. Эти микрососуды соединяются с отдельными венулами, следующими параллельно артериолам, возвращаются к перихондральному сплетению [131]. Через сосудистую сеть в костную ткань поступают питательные вещества, необходимые хондроцитам и мезенхимальным клеткам для адекватного течения хондрогенеза и остеогенеза [154, 185, 193].
Травмы костной ткани всегда сопровождаются повреждением сети сосудов, что ведет к прогрессированию гипоксии близлежащих тканей с последующей их гибелью [129]. При нарушении васкуляризации в зоне травматической патологии происходит активация тромботических факторов свертывания крови и формирования гематомы. Продукты распада тканей в области перелома и воспалительная реакция активируют такие факторы, как цитокины и факторы роста, вследствие чего к месту травмы подтягиваются мезенхимальные и остеопрогениторные клетки. Усиление эндостального кровообращения в зоне поврежденной кости дает возможность мезенхимальным клеткам, связанным с растущими капиллярными сосудами, проникать в область перелома со стороны эндоста и костного мозга [176, 193]. При этом в межотломковой области достаточно быстро развивается грануляционная ткань, которая впоследствии замещается фиброзно-хрящевой, тем самым формируется первичная спайка. Впоследствии начинаются процессы интрамембранозного костеобразования в надкостнице, ведущие к образованию внешней костной мозоли [102], во внутренних слоях фиброзно-хрящевая ткань минерализуется и образуется рыхлая губчатая кость [185], которая стабилизирует костные фрагменты. В этот момент в зоне перелома активируются все процессы ремоделирования, при которых лизис некротизированной кости остеокластами сопровождается ангиогенезом с поэтапной заменой массивной костной мозоли на пластинчатую кость. Конечным результатом этих процессов является восстановление нормального кровоснабжения и уменьшение размера межотломковой костной мозоли [143].
В восстановлении костной ткани участвует большое количество медиаторов [187], которые связаны с эмбриональным и постнатальным развитием кости, играющих значительную роль в регенерации кости. К ним можно отнести BMP-2, BMP-4 [93, 136,196], VEGF [172, 179], bFGF, PDGF [96, 98, 101, 177].
Примером этому могут быть исследования, в которых выявлены признаки медиатора VEGF на клетках хрящевого происхождения [186], остеопрогениторных клетках и предшественниках клеток костного ряда в костной мозоли [191]. В свою очередь, остеокласты продуцируют гепариназу, которая способствует выделению активных форм VEGF из гепарина, что приводит не только к усилению ангиогенеза, но и к активизация остеокластов, тем самым стимулируя ремоделирование костной мозоли во время эндохондральной оссификации [133, 140].
Фактор роста эндотелия сосудов – VEGF – является ключевым протагонистом, участвующим в неоангиогенезе. Данное положение подтверждается исследовательскими работами, в которых была выявлена первостепенная роль ингибирования фактора роста эндотелия сосудов при переломах костей задней конечности у мышей в развитии значительного снижения кровоснабжения в зоне повреждений за счет уменьшения прорастания кровеносных сосудов, благодаря чему ухудшается минерализации межотломковой костной мозоли и нарушается перестройка костных трабекул [172, 192, 195, 196]. Также фактор VEGF и его рецепторы имеют функцию основных регуляторов молекулярных и клеточных взаимодействий, которые формируют зрелую сосудистую сеть в поврежденных тканях [123, 170, 179, 183, 192]. Данный фактор, влияя на ангиогенез, взаимодействует с двумя мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 VEGF и рецептором-2 VEGF), активирует их, при этом запускается механизм, приводящий к усилению роста клеток эндотелия сосудов и их пролиферации. Благодаря этим свойствам медиатор VEGF значительно влияет на рост [170, 178, 194] и репарацию повреждений костной ткани [115, 118, 191].
Морфологическое строение костных микрососудов имеет существенные отличительные особенности от структуры сосудов остальных тканей организма. У них отсутствуют мышечный и соединительнотканый слои, они имеют только эндотелиальный слой, из этого следует, что именно через сосудистый эндотелий происходит вся гуморальная регуляция обменных процессов. Таким образом, эндотелий, будучи неотъемлемой частью костной ткани, играет важную роль во взаимодействиях между клетками эндотелия и клетками костей, направленных на поддержание целостности костных структур [142].
Эндотелий сосудов состоит из эндотелиальных клеток и представляет собой непрерывную однослойную плоскую структуру мезенхимального происхождения, выстилающую всю кровеносную систему [5, 11, 25], а также и лимфатические сосуды [34, 35, 122, 132], является активной динамической структурой, контролирующей множество важных функций [29, 72, 76, 147]. Сосудистый эндотелий обладает функцией барьера между сосудистой стенкой и кровью, реагирует на воздействие тока крови и на напряжение сосудистой стенки, чувствительной к различным нейрогуморальным факторам, также продуцирует большое количество существенных биологически активных веществ: как вазодилататоров (NO, фактор гиперполяризующий эндотелиальный, простациклин), так и вазоконстрикторов (ангиотензин II, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, эндотелин, простагландин F2- и тромбоксан А2), то есть является гигантским паракринным органом человеческого организма [16, 38, 79]. Основная роль эндотелиальных клеток определяется поддержанием васкулярного гомеостаза посредством регуляции равновесия главенствующих процессов: сосудистого тонуса (вазоконстрикция и вазодилатация), гемоваскулярного гемостаза (продуцирование антикоагулянтных и прокоагулянтных медиаторов), пролиферации клеток в различных тканях, активацией или замедлением действий ростовых факторов, локального воспаления (производство противо- и провоспалительных факторов). Также через эндотелий сосудов окружающие ткани обеспечиваются гормонами, цитокинами, хемокинами и метаболитами. В случае необходимости сосудистый эндотелий является барьером, ограничивающим движение молекул, а также клеток, и обеспечивает взаимодействие с другими слоями сосудистой стенки. Многие факторы-аттрактанты, которые представлены на поверхности сосудистого эндотелия костей, привлекают из кровеносного русла гематопоэтические клетки в костный мозг, где последние, связываясь с различными агентами, принимают активное участие в процессах регенерации кости.
Моделирование закрытых остеопоротических переломов бедренных костей и их остеосинтез
Исследование проводили на 120 белых крысах-самках Вистар с массой тела 200-300 г. Для моделирования экспериментального остеопороза крыс предварительно подвергали наркотизации посредством внутрибрюшинной инъекции водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг, после чего осуществляли операцию двусторонней овариэктомии [138]. По прошествии восьми недель у данных животных развивается системный остеопороз [20]. Исследуемые препараты и комбинации препаратов для коррекции остеопоротических изменений костей применяли с девятой по двенадцатую неделю эксперимента включительно (рис. 2.1).
В качестве контроля использовали животных, которым была проведена ложная операция овариэктомии (вскрытие под наркозом брюшной полости без удаления яичников, послойное зашивание раны).
Степень выраженности остеопоротических изменений анализировали спустя 12 недель после проведения овариэктомии посредством проведения гистоморфометрии (рис. 2.1).
Исследование было проведено на 120 белых крысах-самках Вистар с массой тела 200-300 г. У всех крыс (за исключением контрольной группы) моделировали экспериментальный остеопороз путем удаления обоих яичников (в соответствии с методикой, описанной в п. 2.1 настоящей диссертации).
Далее, по прошествии восьми недель после овариэктомии, на фоне развившегося остеопороза [13, 20] моделировали переломы бедренных костей подопытных животных (остеопоротические переломы) (рис. 2.2).
Для этого крыс предварительно наркотизировали (водный раствор хлоралгидрата внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг). После наркотизации животных без разреза мягких тканей, при помощи крампонов с надетыми на режущие поверхности силиконовыми трубками, производилось внешнее воздействие на проксимальный отдел бедренной кости (между большим и третьим вертелами бедренной кости). Нагрузка осуществлялась перпендикулярно оси кости до появления в ней перелома.
В дальнейшем для фиксации и стабилизации переломов производили закрытый миниинвазивный интрамедуллярный остеосинтез следующим способом.
Со стороны дистального эпифиза бедренной кости при согнутой в коленном суставе задней конечности животного, вдоль оси кости в асептических условиях через прокол кожи и кортикальный слой, а далее интрамедуллярно, проводили спицу Киршнера, имеющую диаметр, соответствующий ширине внутреннего диаметра костномозгового канала бедра, с помощью струбцины. Во время остеосинтеза спица проходила сквозь ткань дистального метафиза, диафиз, зону перелома и прочно фиксировалась в костномозговом канале и проксимальном метафизе бедренной кости (рис. 2.3).
– Схема интрамедуллярного остеосинтеза бедра. Красным цветом обозначено место перелома, синим – спица Киршнера, введенная в костномозговой канал бедренной кости крысы
Контроль прочности фиксации определяли по отсутствию патологической подвижности в области перелома. Фрагмент спицы, выстоящий за пределы эпифиза кости, коротко скусывали и полностью погружали в ткань кости. На прокол кожи в месте введения спицы накладывали один шов капроновой нитью, рану обрабатывали кожным антисептиком.
Исследуемые препараты в качестве монотерапии и комбинации препаратов применяли с первой по четвертую неделю после воспроизведения и остеосинтеза переломов включительно (рис. 2.2). Таким образом, результаты консолидации переломов оценивали визуально и рентгенографически по прошествии четырех недель после остеосинтеза переломов или через 12 недель после начала эксперимента.
Уровень микроциркуляции на модели экспериментального остеопороза оценивали в ткани проксимального отдела бедра, на модели остеопоротических переломов – в ткани формирующейся костной мозоли через 12 недель после начала эксперимента (проведения операции удаления яичников).
Для этого после наркотизации (водный раствор хлоралгидрата внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг) производили хирургический доступ к проксимальному отделу бедренной кости крысы. После формирования отверстия в кортикальном слое кости или на поверхности костной мозоли глубиной до 2 мм, вводили в него игольчатый датчик для исследования состояния регионарной микроциркуляции.
Уровень микроциркуляции костной ткани или в костной мозоли исследовали с помощью аппаратного комплекса Biopac systems, включающего блок полиграфа MP100, LDF100C – блок лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) и датчик TSD144, который после хирургического доступа вводился в ткань проксимального отдела бедра.
Метод лазерной допплеровской флоуметрии – это способ диагностики, при котором применяется зондирование тканей лазерным лучом. Обработка отраженного излучения от тканей основана на выделении из зарегистрированного сигнала допплеровского сдвига частоты отраженного сигнала, пропорционального скорости движения эритроцитов. В ходе проводимых исследований обеспечивается регистрация изменения потока крови в микроциркуляторном русле (рис. 2.4, 2.5) [49].
На модели экспериментального остеопороза после измерения уровня микроциркуляции в кости, проводили функциональные сосудистые тесты эндотелийзависимой (ЭЗВД) и эндотелийнезависимой (ЭНВД) вазодилатации в ответ на одномоментное внутривенное введение растворов ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг и нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг соответственно [30, 31] для оценки степени развития дисфункции сосудистого эндотелия [20].
Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии при исследовании микроциркуляции и проведении функциональных сосудистых тестов осуществляли в программе AcqKnowledge версий 3.8.1-4.2.0, показатели локального кровоснабжения выражались в перфузионных единицах (ПЕ).
Изучение остеопротективного действия препарата Кальций-Д3 Никомед при экспериментальном остеопорозе
Согласно дизайну эксперимента, путем проведения операции двусторонней овариэктомии у самок крыс Вистар моделировали экспериментальный остеопороз. В течение восьми недель после овариэктомии животные получали ежедневно внутрижелудочно 1% крахмальную слизь, затем еще в течение 4 недель – Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг в виде суспензии в 1% крахмальной слизи в качестве препарата сравнения для фармакологической коррекции сформировавшегося за восемь недель остеопороза [13, 20].
Кальций-Д3 Никомед был выбран в качестве препарата сравнения как наиболее распространенный, доступный конечному потребителю и наиболее часто назначаемый врачами для профилактики возникновения и фармакологической коррекции остеопороза препарат.
Результаты проведенного экспериментального исследования
продемонстрировали отсутствие у препарата Кальций-Д3 Никомед влияния на показатели кровоснабжения проксимального отдела бедра крыс (рис. 3.9). Значения изученного показателя не отличались статистически значимо от результатов в группе животных с остеопорозом (р=0,675).
При проведении фукциональных сосудистых проб у крыс с остеопорозом, получавших терапию препаратом Кальций-Д3 Никомед, было обнаружено следующее:
- при проведении реакции эндотелийзависимой вазодилатации снижение показателей микроциркуляции происходило в среднем на 33,4±2,1 ПЕ, а время восстановления до исходных параметров составило в среднем 13,8±2,4 секунды, площадь треугольника ЭЗВД в среднем была равна 250,46±73,17 усл. ед.;
- у животных, которым вводился раствор нитропрусида натрия (реакция ЭНВД), было выявлено падение параметров микроциркуляции в среднем на 28,3±7,6 ПЕ, а возврат к исходным значениям происходил за 43,1±6,2 секунды. Исходя из этого средняя площадь треугольника эндотелийнезависимой вазодилатации равна 587,86±153,4 усл. ед.
По результатам расчета коэффициент эндотелиальной дисфункции у крыс, получавших Кальций-ДЗ Никомед, равен 2,64±2,7, что позволило констатировать отсутствие эндотелиотропной активности у данного препарата (рис. 3.10).
На рисунке 3.11 представлена цифровая фотография гистологического среза проксимального отдела бедра в группе животных, получавших препарат Кальций-ДЗ Никомед в дозе 85,7 мг/кг. Гистологическая картина очень сильно напоминала таковую у животных с остеопорозом, не получавших лечения: визуально костные трабекулы были истончены, межтрабекулярные пространства расширены, имелись единичные микропереломы костных трабекул, что свидетельствует об отсутствии у препарата Кальций-Д3 Никомед остеопротективной активности на выбранной модели патологии (рис. 3.11).
Морфометрическое исследование гистологических препаратов, несмотря на имеющуюся тенденцию к превышению показателя над значением у животных с остеопорозом, подтвердило отсутствие статистически значимого влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на среднюю ширину костных трабекул проксимального отдела бедра крыс (рис. 3.12). Средняя ширина костных трабекул была статистически значимо меньше показателя контрольных животных и не отличалась от значений, зарегистрированных у животных с экспериментальной патологией (р=0,240).
По результатам интегрального векторного анализа установили, что Кальций-Д3 Никомед не усиливал интегральную остеопротективную активность при развившихся и прогрессирующих остеопоротических нарушениях, что выражается в увеличении значения площади диаграммы (46863 усл. ед.) по сравнению со значениями контрольных животных и крыс с остеопорозом (рис. 3.13).
Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг, ежедневно вводимый самкам крыс Вистар внутрижелудочно на протяжении четырех недель по прошествии восьми недель после овариэктомии, ожидаемо не обладает эндотелиопротективным действием (что выражается в увеличении КЭД по результатам ЛДФ), а также не предотвращает снижения уровня локальной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра.
Несмотря на имеющуюся положительную тенденцию, препарат не оказал статистически значимого влияния на протекание процессов костного ремоделирования при развившихся экспериментальных остеопоротических изменениях, подтверждением чему явилось отсутствие достоверного влияния препарата на замедление истончения трабекул в губчатой кости и возникновение микроповреждений трабекул.
Изучение влияния L-аргинина в комбинации с лозартаном на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах
В соответствии с протоколом экспериментального исследования, в группе животных, получавших комбинированную терапию L-аргинином в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг, указанную комбинацию препаратов вводили экспериментальным животным ежедневно внутрижелудочно на протяжении четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза.
Через четыре недели исследовали уровень микроциркуляции в костных мозолях консолидированных переломов и проводили визуальную и рентгенографическую оценку количества и качества сращений экспериментальных остеопоротических переломов.
Выявили, что изученная комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг позитивно влияет на значение уровня кровоснабжения костной мозоли экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра (рис. 3.40).
Было установлено, что у крыс, получавших комбинацию L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг, средний уровень микроциркуляции достоверно превышал таковой у животных с переломами бедра на фоне остеопороза, не получавших лечения, и у крыс с переломами бедра на фоне остеопороза, получавших в качестве терапии Кальций-Д3 Никомед (p 0,001).
Кроме того, абсолютные значения микроциркуляции в группе животных, получавших комбинированную терапию, превышали показатели как контрольных животных с экспериментальными переломами без остеопороза, так и показатели у крыс, получавших монотерапию L-аргинином (рис. 3.40).
При этом в группе животных, получавших лечение комбинацией L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг, не наблюдалось статистически значимых отличий от показателей в группе крыс с переломами бедра без остеопороза (р=0,064) и значений у животных, получавших монотерапию остеопоротических переломов L-аргинином (р=0,151).
Таким образом, L-аргинин в дозе 200 мг/кг в комбинации с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза у крыс существенно повышал средний уровень кровоснабжения костной мозоли перелома бедра, обеспечивая тем самым благоприятные условия для сращения экспериментальных переломов.
При визуальной и рентгенологической оценке результатов сращения остеопоротических переломов выявили, что после введения комбинации L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг крысам в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных переломов на фоне остеопороза неудовлетворительных результатов сращения не наблюдалось: сращение остеопоротических переломов отмечалось в 100% наблюдений (рис. 3.41, 3.42).
Следовательно, комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза увеличивает частоту консолидации экспериментальных переломов на фоне остеопороза. Изучаемая комбинация препаратов оказывала положительное воздействие на процессы остеорепарации при переломах на фоне остеопороза.
Ежедневное внутрижелудочное введение L-аргинина в дозе 200 мг/кг в комбинации с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза предотвращает ухудшение показателей кровоснабжения костной мозоли перелома проксимального отдела бедра более выражено, чем терапия препаратом Кальций-Д3 Никомед или L-аргинином в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии.
Изученная комбинация L-аргинина с эналаприлом положительно воздействует на протекание процессов костного ремоделирования при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального отдела бедра у крыс, увеличивая число позитивных результатов консолидации переломов до 100%, при этом отличий в эффективности от L-аргинина в качестве монотерапии не наблюдается.
Изучение влияния L-аргинина в комбинации с лозартаном на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах
Согласно протоколу экспериментального исследования, в группе животных, получавших комбинированную терапию L-аргинином в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг, указанная комбинация препаратов вводилась экспериментальным животным ежедневно внутрижелудочно на протяжении четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза.
Через четыре недели исследовали уровень микроциркуляции в костных мозолях консолидированных переломов и проводили визуальную и рентгенографическую оценку количества и качества сращений экспериментальных остеопоротических переломов.
Выявили, что сочетанное применение L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг позитивно влияет на значение уровня кровоснабжения костной мозоли экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра (рис. 3.43).
