Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Суточное мониторирование артериального давления 12
1.2. Эндотелиальная дисфункция 14
1.3. Фармакологическая коррекция эндотелиальной дисфункции 22
1.4 Эндотелиопротективные свойства L-аргинина 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и суточное мониторирование артериального давления 37
2.2 Оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций 37
2.3. Проведение миокардиальныйх проб в острых экспериментах на наркотизированных крысах 38
2.4.Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции 38
2.5. Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME- индуцированной ЭД 39
2.6. Исследуемые химические соединения и дизайн эксперимента 40
2.7. Статистическая обработка результатов исследования 41
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1. Комплекс методических подходов для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов суточного мониториро-вания артериального давления, функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований 46
3.2. Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина, амлоди-пина и индапамида при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов суточного мониторирования артериального давления, функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 68
3.3. Суточное мониторирование артериального давления и изучение эндоте-лиопротективной активности сочетанного применения L-аргинина и амлоди-пина при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO 81
3.4. Суточное мониторирование артериального давления и изучение эндоте-лиопротективной активности сочетанного применения L-аргинина и тиази-доподобного диуретика индапамида при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO 95
Заключение 108
Выводы 119
Список литературы 121
- Эндотелиальная дисфункция
- Проведение миокардиальныйх проб в острых экспериментах на наркотизированных крысах
- Исследуемые химические соединения и дизайн эксперимента
- Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина, амлоди-пина и индапамида при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов суточного мониторирования артериального давления, функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Введение к работе
В современном мире, особенно в развитых странах, артериальная ги-пертензия (АГ) является одним из основных факторов, повышающих инва-лидизацию и смертность за счет таких грозных осложнений, как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и инсульт (Бойцов С.А., 2005; Гогин Е.Е., 2002). Прогноз и терапевтические последствия изменений АД днем и ночью до настоящего времени до конца не изучены. Анализируя данные литературы, становится очевидным, что показатели суточного профиля АД, т.е. среднесуточные, среднедневные, средненочные, индексы нагрузки давлением, более информативны для оценки степени тяжести артериальной гипер-тензии, чем данные разовых измерений АД (Харченко О.О., 2003). Было высказано предположение, что у больных с артериальной гипертензией, у которых не отмечено ночное снижение АД, высокий риск возникновения инсульта. Результаты исследований Л.Н. Задорожной и соавторов, проведенных в 2000 г., свидетельствуют, что при повышенном АД ночью у больных более выражено поражение органов-мишеней (гипертрофия миокарда, сердечная недостаточность, ретинопатия и др.). В ходе длительных наблюдений (более 7 лет) было установлено, что у больных с нарушенным суточным ритмом («нон-диппер», «найт-пикер», «гипер-диппер»), особенно у женщин, частота развития сердечно-сосудистых осложнений достоверно выше (Mancia G. et al., 2004).
P. Verdecchia и соавторы в ходе исследований, проведенных до 2008 г., установили, что уровень смертности от сердечно-сосудистых заболеваний ниже у больных, у которых при суточном МАД не выявлено повышение среднего АД, а также то, что этот показатель повышается у больных, у которых ночное АД выше дневного («найт-пикеры») или недостаточно снижено («нон-дипперы»).
В России распространенность АГ среди взрослого населения превышает 30%; наша страна занимает одно из первых мест в Европе по смертности от инсультов и ИБС (Беленков Ю.Н., 2005; Гавриков Н.А., 2001).
Одной из основных причин АГ является эндотелиальная дисфункция (ЭД) и в первую очередь - нарушение релаксационных свойств эндотелия (Остроумова О.С., 2005; Зодионченко B.C., 2002). Впервые о самостоятельной роли сосудистого эндотелия в регуляции сосудистого тонуса было заявлено в статье Furchgott и Zawadzki, опубликованной в журнале «Nature» в 1980 г.
Основным механизмом, лежащим в основе ЭД, является снижение образования и биодоступности оксида азота (NO) при одновременном повышении уровня супероксиданиона и продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х.М., 2005).
Таким образом, дисфункция эндотелия проявляется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндо-телийзависимых процессов (Небиеридзе Д.В., 2005).
Патогенез сердечно-сосудистых заболеваний, в частности АГ, вероятно, связан с нарушением баланса эндотелиальных субстанций. Основное значение в развитии ЭД имеют свободнорадикальное окисление, продукция мощных вазоконстрикторов (эндопероксидов, эндотелинов), а также цитоки-нов, которые подавляют продукцию NO (Марков Х.М., 2005; Heitsch Н., Brovkovych S., Malinski Т., Wiemer G., 2001; Bautista L.E., 2003; Wyatt A.W., 2004.)
Эндотелий секретирует мощные вазоактивные вещества: вазодилатато-ры (NO, эндотелиальный гиперполяризующий фактор, простациклин) и вазо-констрикторы (AT II, эндотелии, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, простагландин Р2альфа и тромбоксан А2) (Агеев Ф.Т., 2001; Бойцов С.А., 2005; Кательницкая Л.И., 2005). Наиболее важным вазодилата-тором считается NO.
NO синтезируется из L-аргинина под влиянием эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы L-аргинина (Граник В.Г., 2004).
7 Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения ЭД является важной клинико-экспериментальной задачей, но вместе с тем в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции эндотелиальной дисфункции.
В настоящее время одним из наиболее осуществимых методов повышения уровня N0, устранения его дефицита и вызываемой этим дефицитом дисфункции эндотелия сосудов является введение в организм L-аргинина. Однако его роль как обязательного эндотелиотропного аддитива к базисной антигипертензивной терапии не достаточно определена и изучена.
В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение эндотелио-протективных свойств L-аргинина с гипотензивными препаратами, обладающими эндотелиотропной активностью (блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином и тиазидоподобным диуретиком -индапамидом) при экспериментальном дефиците оксида азота.
В настоящее время достаточно большое внимание уделяется L-аргинину как предшественнику N0, а вот изучение комбинации L-аргинина с гипотензивными препаратами, обладающими эндотелиотропностью (блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином и тиазидоподобным диуретиком - индапамидом), при экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции в литературе нами не обнаружено.
Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Изучение патологических состояний сердечно-сосудистой системы. Разработка современных медицинских технологий профилактики, диагностики и лечения болезней системы кровообращения» на 2006-2010 гг. Номер государственной регистрации темы - 01.2.00 950904
Цель исследования: провести оценку эндотелиопротективного эффекта L-аргинина и его комбинаций с амлодипином и индапамидом в эксперименте.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:
Изучить влияние L-агринина, амлодипина, индапамида и их комбинаций на суточный профиль давления.
Изучить эндотелиопротективную активность L-аргинина при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.
Изучить эндотелиопротективную активность блокатора кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипина при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.
Изучить эндотелиопротективную активность тиазидоподобного диуретика индапамида при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.
Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения L-аргинина и блокатора кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипина при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.
Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения L-аргинина и тиазидоподобного диуретика индапамида при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0.
Научная новизна исследования. В работе впервые проведено суточное мониторирование артериального давления при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс. Продемонстрировано что у интактных крыс тип суточного профиля артериального давления пред-ставлет из себя диппер тип, у крыс с L-NAME-индуцированной патологией -нон-диппер тип. Установлено что монотерапия амлодипином и индапамидом не приводит к нормализации суточного профиля артериального давления, а комбинированное использование данных препаратов с L-аргинином нормализует суточный профиль давления и приводит его к диппер типу.
В работе показано, что L-аргинин в дозах 30 и 200 мг/кг (однократно в сутки внутрижелудочно в течение 7 дней) оказывает дозозависимое эндоте-лиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной N0-дефицитной ЭД. Амлодипин 0,5 мг/кг и индапамид 2 мг/кг (однократно в сутки внутрижелудочно в течение 7 дней) как монотерапия обладают эндоте-лиопротективными эффектами на выбранной модели дефицита оксида азота.
9 Сочетанное использование L-аргинина с блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином и тиазидоподобным диуретиком ин-дапамидом оказывает аддитивное эндотелиопротективное действие.
Практическая значимость. В работе обоснована эффективность соче-танного применения L-аргинина, антагониста кальция дигидропиридинового ряда амлодипина и тиазидоподобного диуретика - индапамида для коррекции L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование нормализует суточный профиль артериального давления переводя его из нон-диппер типа в диппер. Кроме того позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на аце-тилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелий-независимая вазодилатация) с уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO), а также добиться положительной динамики мор-фофукциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, диаметр миокардиоцитов и адренореактивности, соотношение интима-медиа и т.д.).
Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания L-аргинина в комбинации с амлодипином и индапами-дом при артериальной гипертензии.
Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопро-тективной активности индапамида «Индапамид» производства ОАО «Фарм-стандарт-Лексредства», включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084).
Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротективной активности амлодипина «Амлодипин», индапамида «Индапамид» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»,
10 включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084).
Результаты работы используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и в лекционных курсах кафедры фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии БелГУ.
Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ, 2007 г., XV Национальном конгрессе «Человек и лекарство», XIII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, II Национальном конгрессе терапевтов, III Всероссийской конференции молодых ученых, организованной Воронежской государственной медицинской академией им. Н.Н. Бурденко и Курским государственным медицинским университетом. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, анатомии человека, гистологии, внутренних болезней № 2, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Положения, выносимые на защиту
Положения, выносимые на защиту.
1. L-аргинин в дозах 30 и 200 мг/кг однократно в сутки течение 7 дней
внутрижелудочно оказывает дозозависимое эндотелиопротективное действие
на модели L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД. При монотерапии
L-аргинином, амлодипином и индапамидом нормализации суточного профи
ля артериального давления не происходило. Амлодипин 0,5 мг/кг и индапа-
мид 2 мг/кг как монотерапия обладали эндотелиопротективными эффектами
на выбранной модели патологии,
2. Совместное использование L-аргинина (200 мг/кг) с амлодипином
0,5 мг/кг нормализует суточный профиль артериального давления, оказывает
эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного де
фицита NO, выражающееся в снижении КЭД, положительной динамики ре-
зультатов нагрузочных проб и морфологических исследований, а также в предотвращении снижения концентрации нитрит-ионов NOx,. При этом цифры артериального давления приближались к целевым.
3. Совместное использование L-аргинина (200 мг/кг) с индапамидом 2 мг/кг нормализует суточный профиль артериального давления, оказывает эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, положительной динамики результатов нагрузочных проб и морфологических исследований, а также в предотвращении снижения концентрации нитрит-ионов NOx. При этом отмечается положительное фармакодинамическое взаимодействие L-аргинина и индапамида в отношении эндотелио- и кардиопротективного действия при L-NAME-индуцированном дефиците N0.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 315 источник, из них 144 - отечественных и 171 - зарубежных авторов. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 18, рисунков - 37, схем - 1.
Эндотелиальная дисфункция
Одной из основных причин АГ является эндотелиальная дисфункция (ЭД) и в первую очередь - нарушение релаксационных свойств эндотелия [52, 56, 63, 81, 88, 96, 106, 108, 295, 309]. Впервые о самостоятельной роли сосудистого эндотелия в регуляции сосудистого тонуса было заявлено в статье Furchgott и Zawadzki, опубликованной в журнале «Nature» в 1980 г. Эндотелий - монослой клеток, выстилающих внутреннюю поверхность сосудов и полостей сердца, - играет важную роль в поддержании тонуса и структуры сосудов, локального гомеостаза и пролиферации клеток сосудистой стенки [116, 285, 298, 307, 312]. Эндотелий выполняет множество функций: секреторную, барьерную, участвует в фагоцитозе, регулирует транспорт многих биологически активных веществ (факторов роста, вазоактивных веществ, гормонов, анти- и прокоагулянтов), контролирует диффузию воды, электролитов, продуктов метаболизма [59, 78, 80, 103, 238, 259, 262]. Основные факторы, активирующие эндотелиальные клетки: изменение скорости кровотока; тромбоцитарные факторы; Эндотелий секретирует мощные вазоактивные вещества: вазодилатато-ры (NO, эндотелиальный гиперполяризующий фактор, простациклин) и вазо-констрикторы (AT II, эндотелии, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, простагландин Б2альфа и тромбоксан А2) [48, 62, 71] [87, 100]. Наиболее важным вазодилататором считается NO. NO вызывает расслабление гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов за счет снижения концентрации Са"+ в цитоплазме, опосредованного цГМФ; влияет на свертывание крови, подавляя агрегацию тромбоцитов и экспрессию молекул адгезии на моноцитах и нейтрофилах; предупреждает структурные изменения эндотелия, ингибируя рост и миграцию ГМК [71, 107, 127, 128,138, 141,291]. NO присутствует во всех эндотелиальных клетках, независимо от размера и функции сосудов. В покое эндотелий постоянно секретирует NO, поддерживая нормальный тонус артерий. Ацетилхолин, брадикинин, гистамин, АДФ, АТФ, тромбин и физические факторы (поток крови, пульсовое давление), а также антидиуретический гормон стимулируют секрецию NO [66, 73, 75, 133, 258, 264]. Оксид азота вырабатывается в эндотелиальных клетках в результате реакции биосинтеза из аминокислоты L-аргинина, при участии молекулярного кислорода, где катализатором выступает энзим NO-синтаза: L-аргинин + Ог — L-цитруллин + NO. N0 синтезируется тремя изоформами фермента NO-синтазы: двумя конституитивными - эндотелиальной и нейрональной и одной индуцибельной. В регуляции сердечно-сосудистой системы главную роль играет конститутивная эндотелиальная NO-синтаза (eNOS). Формирование оксида азота осущетвляется в два дискретных шага с промежуточным образованием гидрокси -аргинина (NHA), который образуется в резуль тате поглощения одной молекулы 02 и двух электронов.
Преобразование NHA в L-цитруллин NO требует участия ещё одной молекулы 02 и ещё одного электрона [43, 147]. После синтеза оксид азота выделяется из клеток эндотелия и переходит в расположенные глубже миоциты стенок сосудов. На уровне клеток гладкой мускулатуры сосудов NO активирует растворимую гуанилатциклазу, в результате чего повышается содержание 3,5- циклического гуанозинмонофос-фата, снижается концентрация кальция и наступают релаксация ГМК и вазо-дилатация [12, 157, 196, 197]. Кроме того, эндотелиальные факторы релаксации дают ряд важных системных эффектов, направленных на защиту сосудистой стенки и предупреждение тромбообразования: блокирование агрегации тромбоцитов, окисления липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), экспрессии молекул адгезии, адгезии моноцитов и тромбоцитов к стенке сосуда и т. д. [149, 218]. Не менее важно присутствие оксида азота в миокарде. Монооксид азота увеличивает диастолическую растяжимость левого желудочка, что наиболее важно при формировании гипертрофии сердца. Также оксид азота учавствует в поддержании инотропного и хронотропного Рі-адренергических эффектов [20, 27]. NO химически нестабилен и существует всего несколько секунд. Он диффундирует внутрь сосудистой стенки и в тромбоциты, которые находятся в тесном контакте с эндотелием, поскольку в просвете сосудов находится на периферии потока крови. В просвете сосуда N0 быстро инактивируется растворенным кислородом, супероксидными анионами и гемоглобином. Это, в свою очередь, предотвращает действие N0 на расстоянии от места его секреции.
Поэтому N0 действует как локальный регулятор сосудистого тонуса и функции тромбоцитов, и нарушение или отсутствие его продукции при ЭД не компенсируется высвобождением из здоровых эндотелиальных клеток. Известно, что именно N0 регулирует активность большого числа других биологически активных веществ, секретируемых эндотелием. NO блокирует пролиферацию ГМК и препятствует адгезии циркулирующих тромбоцитов и лейкоцитов к эндотелию. Эта функция сопряжена с простациклином, который ослабляет агрегацию и адгезию тромбоцитов, блокирует миграцию моноцитов, активирует тканевой активатор плазминогена, обладает вазорелаксирующей и антиоксидантной активностью и ингибирует окисление липопротеидов низкой плотности, являясь, таким образом, основным антиатеросклеротическим фактором [62, 71, 101, 107, 127, 128, 130, 235, 259, 261]. Особенность строения капиллярной сети в миокарде, относительно малое диффузионное расстояние для N0, низкая токсичность NO при физиологических концентрациях, низкое Р02 в миокарде определяют важность N0 в регуляции митохондриального дыхания миокарда [116, 125, 240, 277, 300]. Одним из главных стимуляторов синтеза NO является брадикинин, который образуется в крови под действием ферментов калликреина и XII фактора свертывания. Блокада В2-кининовых рецепторов на эндотелиальных клетках тормозит вазодилатацию и высвобождение NO. Брадикинин наряду с NO рассматривают в качестве основного модулятора вазодилатации [103, 239,263,268,275,289]. В физиологических условиях между эндотелийзависимыми вазодила-таторами и вазоконстрикторами существует равновесие, нарушение которого ведет к локальному спазму и повышению сосудистого тонуса. Ауторегуля-цию сосудистого тонуса также обеспечивает система механических факторов. Рецепторы, находящиеся в эндотелии, преобразуя механические сигналы, индуцируют NO-синтазу, что приводит к накоплению NO и вазодилатации [75,96, 116,119,244,282]. Нарушение NO-зависимой дилатации артерий у больных АГ может быть обусловлено снижением продукции NO, ускоренной его деградацией и ремоделированием сосудов. К снижению продукции NO, в свою очередь, может вести повышение уровня простагландина Б2альфа, тромбоксана, су-пероксиддисмутазы [63, 77, 103, 107, 127, 231, 233, 257]. Однако имеются
Проведение миокардиальныйх проб в острых экспериментах на наркотизированных крысах
Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов [102]. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазо-тирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Анализ 100 мкл де протеинизированной сыворотки проводили в 96 луночных планшетах с плоским дном. Чувствительность метода на приборе Labsystems Multiskan МСС/340 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,05% раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида в 30% уксусной кислоте) [102]. Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4С в течение нескольких месяцев. Для приготовления раствора хлористого ванадия 400 мг VC13 растворяли в 50 мл IN НС1 с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор. Уровень метаболитов NO (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaN02 в воде, который хранили при температуре -20С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой. Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента, почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксирован в 10%) формалине с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Рего и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов, по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. Мор-фометрия проводилась с помощью окулярмикрометра. Определялись абсолютная и относительная масса надпочечников, в почках оценивался диаметр почечных телец и их клубочков.
Определялось соотношение интима/медиа в участках сонной артерии и брюшной аорты. Исследована эндотелиотропная активность L-аргинина производства EUROBIOPHARM GmgH, Hamburg в дозе 30 мг/кг, что соответствует разрешенной суточной дозе в России по Сан. ПИН - М.Р.2.3.1.1915 (2004), и в дозе 200 мг/кг, которая была определена нами по данным литературы [212] Согласно этим литературных данным именно, начиная с этой дозы L-аргинин проявляет эндотелио- и кардиотропные эффекты [155]. табл.2.1. В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота L-аргинин вводился в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах [271, 272, 288, 310]. Основные препараты с доказанными эндотелиопротективными свойствами вводили внутрижелудочно в течение 7 суток при L-NAME-опосредованной модели дефицита оксида азота, амлодипин («Амлотоп», производства «Макизфарма»), индапамид («Индапамид», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», использовали в дозах 0,5 мг/кг и 2 мг/кг соответственно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие препаратов в экспериментах, ранее проведённых в нашей лаборатории. При комбинированном использовании L-аргинина с препаратами с доказанными эндотелиопротективными свойствами использовались те же дозы, пути введения, и так же продолжительность применения. Дизайн эксперимента представлен на схеме. 2.1.
Он состоит из следующих блоков: 1. Контрольная группа. 2. Оценка эндотелио- и кардиопротективного действия L-аргинина — 30 и 200 мг/кг, амлодипина 0,5 мг/кг, индапамида 2 мг/кг. 3. Оценка эффективности эндотелио- и кардиопротективного действия соче-танного применения L-аргинина - 200 мг/кг с амлодипином 0,5 мг/кг, и ин-дапамидом 2 мг/кг. Протокол и дизайн эксперимента представлен на схеме 2.1. Протокол состоит из следующих разделов: 1. Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и его коррекция с помощью L-аргинина, амлодипина и индапамида, и сочетаний амлодипина, индапамида с L-аргинином. 2. В условиях этаминал-натриевого наркоза оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых реакций артериального давления на внутривенное одномоментное введение ацетилхолина и нитропруссида натрия. 3. Перевод животного на искусственную вентиляцию лёгких, катетеризация левого желудочка, регистрация ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt, ЧСС, ИФС. Проведение нагрузочных проб для оценки функциональных резервов сократимости миокарда. 4. Выведение животного из эксперимента и взятие крови из грудного отдела аорта для биохимических исследований. 5. Морфологические исследования.
Исследуемые химические соединения и дизайн эксперимента
Дизайн эксперимента представлен на схеме. 2.1. Он состоит из следующих блоков: 1. Контрольная группа. 2. Оценка эндотелио- и кардиопротективного действия L-аргинина — 30 и 200 мг/кг, амлодипина 0,5 мг/кг, индапамида 2 мг/кг. 3. Оценка эффективности эндотелио- и кардиопротективного действия соче-танного применения L-аргинина - 200 мг/кг с амлодипином 0,5 мг/кг, и ин-дапамидом 2 мг/кг. Протокол и дизайн эксперимента представлен на схеме 2.1. Протокол состоит из следующих разделов: 1. Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и его коррекция с помощью L-аргинина, амлодипина и индапамида, и сочетаний амлодипина, индапамида с L-аргинином. 2. В условиях этаминал-натриевого наркоза оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых реакций артериального давления на внутривенное одномоментное введение ацетилхолина и нитропруссида натрия. 3. Перевод животного на искусственную вентиляцию лёгких, катетеризация левого желудочка, регистрация ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt, ЧСС, ИФС. Проведение нагрузочных проб для оценки функциональных резервов сократимости миокарда. 4. Выведение животного из эксперимента и взятие крови из грудного отдела аорта для биохимических исследований. 5. Морфологические исследования. наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли разностным методом вариационной статистики с нахождени ем средних значений сдвигов (М), средней арифметической (+т) и вероятности возможной ошибки (Р) по таблицам Стьюдента.
Различия оценивали как достоверные, начиная с р 0,05. Для расчётов использовали программу для статистического анализа Microsoft Excel 7.0. Биохимические исследования показателей Total NO и активности NO синтазы проведены в соответствии с договором (предмет договора «Биохи мическое определение маркёров функционального состояния эндотелия», № 15/12 от 27 декабря) о научно-техническом сотрудничестве между КГМУ и Государственным учреждением «Государственный Научно исследовательский центр профилактической медицины МЗ РФ (ГНИЦ ПМ МЗ РФ)», г. Москва на базе лаборатории под руководством профессора В.А. Метельской, за что выражаем сотрудникам глубокую благодарность. 2Морфологические исследования проведены на базе морфологической лаборатории НИИ ЭМ КГМУ и патанатомического отделения Курской областной клинической больницы при консультативной и методической помощи доцента В.Т. Дудки, доцента А.В. Иванова и зав. отделением В.Г. Пирогова, за что выражаем им глубокую благодарность. Согласно протоколу исследования, эндотелиальную дисфункцию моделировали ежедневным в/б введением L-NAME в течение 7 суток. Суточное мониторировани артериального давления. При обработке полученных результатов было установлено — у интакных крыс тип суточного профиля пердставлял из себя диппер тип, соответсвующий норме. У животных с L-NAME индуцированным дефицитом оксида азота -нон-диппер, соответвующий гипертонической болезни (рис. 3.1, табл.3.1) Рисунок 3.1 График суточного мониторирования артериального давл-нения при моделировании L-NAME индуцированного окида азота. На восьмые сутки наркотизированное животное брали в эксперимент и на первом этапе оценивали реакции артериального давления на эндотелийза-висимую (ацетилхолин) и эндотелийнезависимую (нитропруссид) вазодила-тацию [66, 279]. Методика оценки КЭД была разработана на базе НИИ ЭМ КГМУ (Покровский М.В. и др). На рис. 3.2, 3.3, 3.4 и 3.5 изображена динамика АД при проведении функциональных проб эндотелийзависимой вазодилатации с введением аце-тилхолина 40 мкг/кг и эндотелийнезависимой вазодилатации с введением нитропру сеида в дозе 30 мкг/кг у интактных животных, крыс с L-NAME-индуцированным дефицитом оксида азота.
При оценке результатов функциональной пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) с введением ацетилхолина 40 мкг/кг нами использована площадь треугольника над кривой восстановления АД. При этом за меньший из катетов данного треугольника принималась разность между точкой окончания кардиального компонента и точкой восстановления артерь-ального давления после сосудистой реакции (рис. 3.2, 3.3).
Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина, амлоди-пина и индапамида при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов суточного мониторирования артериального давления, функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Согласно дизайну исследования, в контрольной группе животных эн-дотелиальную дисфункцию моделировали ежедневным в течение 7 суток внутрибрюшинным введением L-NAME. Исследуемые препараты L-аргинин в дозах 30 мг/кг, 200 мг/кг, вводили внутрибрюшинно, амлодипина 0,5 мг/кг и индапамида 200 мг/кг внутриже лудочно однократно за 30 мин до L-NAME в течение 7 суток. По протоколу на восьмые сутки наркотизированное животное брали в эксперимент. Влия ние исследуемых веществ на исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс с моделированием L-NAME-индуцированной па тологии представлены на (рис.3.18). Обнаружено, что изучаемые препараты не предотвращали развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД, были достоверно выше со ответствующих значений интактных животных во всех сериях экспериментов Максимальное снижение АД наблюдалось в группе где применялся амлоло-дипин (рис. 3.18). Коэффициент эндотелиальной дисфункции. В таблице 3.8. и рис. 3.19. представлены результаты функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у животных с L-NAME индуцированной патологией на фоне лечения L-аргинином 30 и 200 мг/кг, амлодипином 0,5 мг/кг, и индапамидом 2 мг/кг. С последующим расчетом КЭД. Обнаружено, что L-аргинин 30 и 200 мг/кг снижали КЭД до 2,7±0,1 и 2,5±0,1, соответственно, тогда как в группе животных, получавших L-NAME, он составлял 5,4±0,6. На фоне применения препаратов с доказанной эндотелиотропной активностью КЭД составил: амлодипин (0,5 мг/кг) - 2,1±0,3; индапамида (2 мг/кг) - 3,3±0,4.
Обращает на себя внимание, что L-аргинин в использованных дозах, а также препараты с доказанной эндотелиотропной активностью снижали КЭД на фоне L-NAME-индуцированной патологии, не приводя цифры давления к заданному уровню. Это, с одной стороны, свидетельствует о том, что КЭД имеет самостоятельное значение, а с другой - то, что L-NAME-индуцированная артериальная гипертензия на 7-сутки вовлекает в патогенетический процесс не только нитроксидергическую систему, но и все элементы гуморального и неирогенного контуров регуляции системы кровообращения. В то же время, очевидно, что использованные дозы анти-гипертензивных препаратов с доказанными эндотелиопротективными эффектами в качестве монотерапии нуждаются в коррекции в сторону повышения дозы и/или сочетанного применения с L-аргинином. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективном снижении КЭД под влиянием всех исследуемых соединений у животных с моделированием L-NAME индуцированной артериальной гипер-тензии при недостижении заданных цифр артериального давления. При переводе животных на управляемое дыхание обнаружено, что исходные показатели сократимости левого желудочка у животных, получавших L-NAME на фоне L-аргинина 30 и 200 мг/кг, амлодипина 0,5 мг/кг и индапамида 2 мг/кг достоверно оказались меньше, чем в контрольной группе. Наиболее выраженное гиподинамическое действие оказывал амло-дипин, значения ЛЖД которого приближались к значениям группы ин-тактных животных (табл. 3.9). При этом позволим предположить, что повышение ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt в условиях L-NAME-индуцированной патологии вызвано как повышением постнагрузки на левый желудочек, связанное с повышением общего периферического сопротивления, так и включением ангиотензинзависимых механизмов гипертрофии миокардиоцитов. Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных с L-NAME-индуцированным дефицитом оксида азота проводились нагрузочные пробы (табл.3.10, рис.3.20, 3.21).
Проба на адренореактивность характеризовалась выраженным приростом абсолютных значений ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt. В контрольной группе (животные, получавшие L-NAME) ЛЖД, +dp/dt и -dp/dt составили, соответственно, 247,3+4,8, +12109±263 и -6820±303. Максимальное предотвращение повышения адренореактивности вызванное L-NAME-индуцированной патологией выявлено при использовании амлодипина (0,5 мг/кг), значения ЛЖД, которое соответственно составило 201,3 ±14,4. L-аргинин дозозависимо предотвращал повышение адренореактивности, и в дозе 200 мг/кг адренореактивность приближалась к таковой у интактных животных (табл. 3.10, рис. 3.20). Тиазидоподобный диуретик индапамид 2 мг/кг не проявлял протек-тивного действия на функциональной пробе с введением адреналина (табл. 3.10, рис. 3.20). При проведении пробы на нагрузку сопротивлением L-аргинин в дозах 30 и 200 мг/кг и препараты с доказанной эндотелиопротективной активностью предотвращали падение сократимости с 5 на 25 секунду пережатия аорты (рис. 3.20). Так, прирост ЛЖД на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составил 83.6% от величины прироста сократимости миокарда на 5 секунде (что принято за 100%). В контрольной группе (L-NAME - индуцированный дефицит NO) - 66,0%). Тогда как результаты у животных, где применялись исследуемые соединения, оказались в промежуточном положении. А L-аргинин в дозе 200 мг/кг обладал наилучшей эффективностью - 84,3 %. Учитывая, что проба на нагрузку сопротивлением направлена на выявление скрытой сердечной недостаточности, анализ полученных результатов будет проведен в сопоставлении с данными морфологических исследований. Результаты гипоксической пробы (табл. ЗЛО) у интактных животных характеризовались увеличением сократимости в первые минуты ре-оксигенации. В обработку нами взяты максимальные значения прироста сократимости (табл. 3.10). Как видно из представленных данных, L-аргинин в дозе 200 мг/кг, достоверно увеличивали значение ЛЖД до 257,8+7,4 мм рт. ст. по сравнению с контрольной группой, а L-аргинин в дозе 30 мг/кг, амлодипин и индапамид не влияли на результаты гипоксической пробы (табл. 3.10). Таким образом, результаты исследования функционального состояния миокарда при проведении нагрузочных проб выявили отчетливое кардио-протективное действие L-аргинина в дозе 200 мг/кг выражающееся в предотвращении увеличения адренореактивности, падения ЛЖД при проведении пробы на нагрузку сопротивлением и увеличение сократимости на пике реоксигенации по сравнению с животными у которых моделировали L-NAME-индуцированный дефицит NO. L-аргинин в дозе 30 мг/кг, амлодипин и индапамид проявляли кардиопротективное действие в меньшей степени.
Похожие диссертации на Исследование эндотелиопротективных свойств L-аргинина и его комбинаций с амлодипином и индапамидом.
![Экспериментальное исследование нефропротекторных свойств глицина [Электронный ресурс]](/i/i/4506/184806.png "Экспериментальное исследование нефропротекторных свойств глицина [Электронный ресурс] Селиванова Ольга Сергеевна")
