Введение к работе
Актуальность научного исследования. Остеопороз – одно из наиболее распространенных метаболических заболеваний скелета человека. По мнению экспертов ВОЗ он занимает третье место после сердечно-сосудистых заболеваний и сахарного диабета в рейтинге главных медико-социальных проблем современности. Данная патология характеризуется низкой массой кости и микроструктурной перестройкой костной ткани, которая приводит к повышенной ломкости костей и, как следствие, к повышению риска переломов, изменениям в нервной системе и внутренних органах. Это определение было сформулировано на международных конференциях по остеопорозу в Копенгагене (1990 г.) и Гонконге (1993 г.) и является в настоящее время общепринятым (Аврунин А.С., 1998; Беневоленская Л.И., 2003; Дыдыкина И.С., 2008).
Вероятность развития остеопоротических переломов в пожилом возрасте очень высока. С учетом возрастающей продолжительности жизни, старение популяции ведет к двукратному увеличению частоты переломов бедра между 2005–2050 гг. (Беневоленская Л.И., 2005; Burgе R., 2007; Аdасhi J.D., 2010). Достаточно сказать, что смертность при характерном для этого заболевания переломе шейки бедра в течение первых 6 месяцев после перелома достигает 30% (Михайлов Е.Е., 1999; Сеntеr J.R., 2007; Аbrаhаmsеn B., 2009). С каждым годом растет число проводимых оперативных вмешательств по поводу переломов в метаэпифизарных зонах длинных трубчатых костей с применением разнообразных имплантатов, включая использование эндопротезов крупных суставов на фоне травматической патологии и ортопедических заболеваний. По имеющимся данным, на каждые пять операций первичного эндопротезирования приходится одно реэндопротезирование, что чаще всего связано с развитием асептической нестабильности на фоне остеопоротических нарушений в костной ткани (Миронов С.П., 2006; Родионова С.С., 2007).
В настоящее время патогенетическая терапия остеопороза традиционно включает препараты, замедляющие костную резорбцию (эстрогены, кальцитонин), стимулирующие костеобразование (фториды, анаболические стероиды), и препараты многопланового действия (витамин D) (Рожинская Л.Я., 2000, 2007; Марченкова Л.А., 2010). Это разграничение в известной мере условно, поскольку все они действуют в той или иной степени на оба процесса ремоделирования.
Однако увеличение частоты остеопороза и его осложнений показывает, что на сегодняшний день надежных методов медикаментозного лечения и профилактики этого заболевания нет. Все это указывает на актуальность поиска новых подходов к фармакологическим методам воздействия, а также обосновывает избранное направление исследования.
Положение о значительном вкладе микроциркуляции в процесс ремоделирования костной ткани является общепризнанным (Гудырев О.С., 2008; Корокин М.В., 2006; Alаgiаkrishnаn К., 2003). Как известно, строение микроциркуляторного русла костной ткани существенно отличается от морфологии сосудистого русла остальных тканей организма. Костные микрососуды имеют только эндотелий и не имеют мышечного и соединительнотканного слоев. Таким образом, именно эндотелий опосредует всю гуморальную регуляцию обмена между остеобластами, остеокластами и кровью (Брощусь В.В., 2003; Грибкова И.В., 2002; Nароli С., 2001).
В условиях повреждения тканей активируются процессы неоангиогенеза. Одним из основных условий для нормального течения ангиогенеза является повышение проницаемости эндотелия, что преимущественно связано с действием оксида азота (NО) (Покровский М.В., 2008). Повышение проницаемости сосудов необходимо для выхода белков плазмы крови, что приводит к образованию фибриновой основы для последующей миграции эндотелиоцитов. Главным механизмом регуляции процессов неоангиогенеза является высвобождение ангиогенных факторов, источником которых могут быть эндотелиальные клетки, тучные клетки, макрофаги и другие клетки. Под действием ангиогенных факторов происходит активация эндотелиоцитов и миграция их за пределы базальной мембраны с формированием ответвлений основных сосудов (Шляхто Е.В., 2002; Кurеishi Y., 2000). Таким образом, одной из причин нарушения регионарного кровоснабжения является дисфункция эндотелия (Мартынов Н.Г., 2005; Небиеридзе Д.В., 2004; Шестакова М.В., 2001). Следовательно, дисфункция эндотелия посредством нарушения микроциркуляции может приводить к нарушению процессов остеогенеза и остеорепарации, вызывая тем самым ряд остеологических заболеваний, в том числе и остеопороз.
В свою очередь, среди активных факторов контроля микроциркуляции на передний план все чаще в последнее время выходит эндотелиальный механизм регуляции просвета и тонуса сосуда. Экспериментальные исследования выявили положительные остеопротективные эффекты у ингибитора ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) эналаприла и блокатора ангиотензиновых рецепторов (АТ1) лозартана при остеопоротических нарушениях (Гудырев О.С., 2008). Данные результаты свидетельствуют о целесообразности дальнейшего изучения веществ для целенаправленного фармакологического воздействия на дефицит оксида азота при остеопоротических изменениях.
Таким образом, все вышеизложенное указывает на актуальность исследования остеопротективного действия препаратов с доказанными положительными эндотелиотропными эффектами.
Цель исследования – изучение и анализ остеопротективных свойств препаратов, корректирующих дефицит оксида азота при экспериментальном остеопорозе и переломах на его фоне.
Задачи исследования:
1. Изучить развитие экспериментального остеопороза и дефицита оксида азота, вызванного двусторонней овариэктомией, с использованием результатов оценки кровоснабжения костной ткани, функциональных сосудистых тестов, биохимических и гистологических исследований.
2. Изучить процессы консолидации экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости с использованием результатов оценки кровоснабжения костной мозоли, рентгенологических, биохимических и гистологических исследований.
3. Изучить остеопротективные эффекты эналаприла и лозартана на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.
4. Изучить остеопротективное действия этоксидола на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.
5. Изучить остеопротективное действие резвератрола на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.
6. Изучить остеопротективное действие комбинаций резвератрола с эналаприлом и лозартаном на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.
7. Изучить остеопротективное действие тетрагидробиоптерина на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.
8. Изучить остеопротективное действие клопидогреля на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.
9. Провести комплексную оценку морфофункциональных характеристик с помощью интегрального векторного анализа и выявить степень остеопротективного действия изучаемых препаратов на модели экспериментального остеопороза.
Научная новизна.
В работе продемонстрировано, что развивающийся экспериментальный остеопороз через восемь недель после двусторонней овариэктомии сопровождается ухудшением кровоснабжения костной ткани, отрицательной динамикой морфологических показателей, наличием прямой зависимости между качеством кровоснабжения кости и микроархитектоникой, наличием признаков развития эндотелиальной дисфункции на основании функциональных тестов и биохимических исследований.
Было выявлено, что эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг, резвератрол в дозе 2 мг/кг, комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном, тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг, клопидогрел в дозе 3,3 мг/кг, вводимые ежедневно в течение восьми недель после двусторонней овариэктомии, проявляя эндотелиотропную активностью, обладали также остеопротективным действием, что выражалось в предотвращении ухудшения внутрикостного кровоснабжения, благодаря чему изучаемые препараты способствовали замедлению истончения трабекул в спонгиозной костной ткани и предотвращению возникновения микропереломов.
Исследование впервые показало, что этоксидол, вводимый животным в дозе 12,5 мг/кг в течение восьми недель после двусторонней овариэктомии, не оказывает статистически значимого влияния на состояние кровоснабжения костной ткани проксимального метафиза бедра экспериментальных животных, а также не вызывает положительной динамики морфофункциональных и биохимических показателей на выбранной модели патологии.
В работе впервые выявлено, что эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг, резвератрол в дозе 2 мг/кг, комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном, тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг, клопидогрел в дозе 3,3 мг/кг на модели экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости предотвращают ухудшение кровоснабжения в костной мозоли, а также положительно влияют на качество и количество сращений экспериментальных переломов.
В ходе исследования впервые выявлено, что этоксидол в дозе 12,5 мг/кг не оказывает положительного влияния на кровоснабжение в костной мозоли и консолидацию экспериментальных переломов проксимального метафиза бедренной кости лабораторных животных.
Проведенная с помощью интегрального векторного анализа комплексная оценка остеопротективной активности препаратов позволила ранжировать их в зависимости от степени выраженности фармакологической активности на модели экспериментального остеопороза.
Таким образом, в результате выполнения диссертационного исследования разработан комплекс положений и целостных представлений о роли эндотелиальной дисфункции в процессах ремоделирования и репаративной регенерации костной ткани, а также патогенетически обоснованных подходов к фармакологической профилактике и коррекции их нарушений.
Научно-практическая значимость.
В работе доказана эффективность применения эналаприла, лозартана, резвератрола, комбинаций резвератрола с эналаприлом и лозартаном, тетрагидробиоптерина и клопидогреля для коррекции остеопоротических нарушений костей скелета и фармакотерапии остеопоротических переломов. В эксперименте доказано, что использование исследуемых препаратов и их комбинации позволяет нормализовать изменения соотношений сосудистых реакций в тестах эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации. Данные препараты способствуют нормализации кровоснабжения костной ткани при развивающемся остеопорозе, замедлению отрицательной динамики микроструктурных изменений кости и биохимических показателей, улучшению процессов консолидации остеопоротических переломов проксимального метафиза бедра.
Результаты исследования позволяют рекомендовать проведение целенаправленных клинических испытаний эналаприла, лозартана, резвератрола, комбинаций резвератрола с эналаприлом и лозартаном, тетрагидробиоптерина и клопидогреля для изучения их фармакологической остеопротективной активности при остеопорозе и переломах костей скелета на его фоне.
Внедрение результатов исследования.
На основании данных диссертационной работы запланировано проведение целенаправленных клинических исследований эналаприла, лозартана, резвератрола и их комбинаций, тетрагидробиоптерина, клопидогрела в фармакологической коррекции остеопоротических нарушений при переломах костей.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелио- и остеопротективной активности ингибитора АПФ эналаприла малеат («Рениприл» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) и блокатор АТ1-рецепторов лозартана калия («Блоктран» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства») использованы в НИОКР ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (акт о внедрении от сентября 2008 г.). Также в лаборатории доклинических исследований Научно-исследовательского института Экологической медицины при Курском государственном медицинском университете применяется, разработанный вспомогательный лаботарный инструментарий: «Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных» и «Канюлированный стержень-кондуктор для проведения экспериментальных измерений» (акт о внедрении от 21 мая 2007 г.).
Полученные результаты используются в лекционных курсах кафедр фармакологии и травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет», кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ФГАОУ ВПО НИУ «Белгородский государственный университет».
Связь диссертационного исследования с темами научно-исследовательских работ организации.
Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов лечения и профилактики остеопоротических нарушений с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни пациентов» на 2009-2013 гг., номер государственной регистрации темы – 01201051081.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Через восемь недель после двусторонней овариэктомии у самок крыс линии Wistar развивается дисфункция эндотелия сосудов, в том числе кровоснабжающих костную ткань, которая сопровождается увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции и снижением концентрации в крови стабильных метаболитов оксида азота, как следствие - ухудшается кровоснабжение костной ткани, что ведет к развитию генерализованного остеопороза, проявляющегося истончением костных трабекул и возникновением в их структуре микропереломов.
2. Консолидация экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедра у самок крыс линии Wistar протекает в условиях эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся снижением концентрации в крови стабильных метаболитов оксида азота, а также ухудшением кровоснабжения костной мозоли, что отрицательно сказывается на результатах их сращения и вдвое увеличивает число несращений костно-травматических повреждений.
3. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг, резвератрол в дозе 2 мг/кг на модели остеопороза, вызванного двусторонней овариэктомией, оказывают выраженное эндотелиопротективное действие, предотвращают ухудшение кровоснабжения костной ткани бедра и обладают остеопротективным действием; на модели экспериментальных остеопоротических переломов указанные препараты увеличивают количество сращений костно-травматических повреждений.
4. Комбинированное использование резвератрола в дозе 2 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг по сравнению с монотерапией препаратами оказывает более выраженное положительное воздействие на морфофункциональные характеристики на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов.
5. Этоксидол в дозе 12,5 мг/кг на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов бедренной кости не влияет на морфофункциональные показатели эндотелиальной системы, не предотвращает ухудшения кровоснабжения костной ткани и костной мозоли, а также не обладает антиостеопоротическими свойствами, что негативно сказывается на результатах консолидации экспериментальных переломов бедра.
6. Тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг, клопидогрел в дозе 3,3 мг/кг на модели остеопороза, вызванного двусторонней овариэктомией, оказывают выраженное эндотелиопротективное действие, предотвращают ухудшение кровоснабжения костной ткани бедра и обладают остеопротективным действием; на модели экспериментальных остеопоротических переломов указанные препараты увеличивают количество сращений костно-травматических повреждений.
Апробация диссертации.
Материалы работы были представлены на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Республика Татарстан, г. Казань, 2012); на VIII и IX съездах травматологов-ортопедов России «Травматология и ортопедия XXI века» (Самара, 2006; Саратов, 2010); на III и IV конференциях по остеопорозу с международным участием «Проблема остеопороза в травматологии и ортопедии» (Москва, 2006; 2009); на VI Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция - от молекулярных мишеней к органам и системным изменениям» (Ярославль, 2007); на VIII и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008, 2010); на региональной научно-практической конференции «Факультет последипломного образования: 20 лет на службе здравоохранения» (Курск, 2006); на 72-й научной конференции КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН «Университетская наука: Взгляд в будущее» (Курск, 2007); на 74-й научной конференции КГМУ, сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН «Университетская наука: теория, практика инновации (Курск, 2009); на межвузовской научной конференции «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» (Курск, 2009); на межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» (Курск, 2009); на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010); на третьей международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2010); на межрегиональной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 40-летию кафедры травматологии, ортопедии и ВПХ, «Современные технологии лечения и реабилитации повреждений и заболеваний опорно-двигательной системы» (Курск, 2010); на заседаниях Курского регионального отделения ассоциации травматологов-ортопедов России (Курск, 2010, 2011, 2012).
Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр: фармакологии; травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии; клинической фармакологии; терапии факультета последипломного образования; хирургии факультета последипломного образования; гистологии, цитологии и эмбриологии; анатомии человека; оперативной хирургии с топографической анатомией; биоорганической химии; инфекционных болезней и эпидемиологии; Научно-исследовательского института «Экологической медицины» при Курском государственном медицинском университете; кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин Института последипломного медицинского образования при Белгородском государственном национальном исследовательском университете.
Личный вклад автора.
Автору принадлежит ведущая роль в составлении плана и дизайна исследования, в постановке цели и поиске путей её достижения. Им проведен подробный анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, выполнялись экспериментальные исследования на 905 самках белых крыс линии Wistar с разделением их на группы: основных, сравнения и контрольных; выбраны критерии рандомизации. Диссертантом самостоятельно производился анализ и обобщение полученных результатов, составление графиков, таблиц и диаграмм, написание диссертации, сопоставление с литературными данными. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия 80-90%.
Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 44 печатные работы, в том числе 19 из них – в центральных рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации. Получено 2 патента РФ на полезные модели, 4 патента РФ на изобретения, а также 5 удостоверений о рационализаторских предложениях.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований экспериментального гипоэстрогенного остеопороза, результатов исследований экспериментальных переломов при моделированном гипоэстрогенном остеопорозе и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 281 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 112 рисунками. Библиографический список содержит 295 источников, из которых 119 отечественных и 176 зарубежных авторов.
