Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 20
1.1. Синтез оксида азота в организме человека и животных 20
1.2. Физиологическая роль оксида азота в системе кровообращения 25
1.3. Эндотелиальная дисфункция как предиктор ряда сердечно-сосудистых заболеваний 32
1.4. Гипергомоцистеинемия как фактор развития эндотелиальной дисфункции 34
1.5. Тетрагидробиоптерин и эндотелиальная дисфункция 41
1.6. Ингибиторы аргиназы и их роль в защите эндотелия 50
1.7. L-аргинин - естественный донор оксида азота 58
1.8. Препараты с доказанной эндотелиотропной активностью 61
1.9. Эндотелиопротективные эффекты препаратов с различным механизмом действия 67
Глава 2. Материалы и методы 82
2.1. Моделирование гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции и оценка эндотелийзависимых и эндотелиинезависимых сосудистых реакций 82
2.2. Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и оценка эндотелийзависимых и эндотелиинезависимых сосудистых реакций 83
2.3. Оценка степени развития эндотелиальной дисфункции при моделировании патологии и ее коррекции исследуемыми препаратами 84
2.4. Проведение функциональных нагрузочных проб на открытом сердце у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании 86
2.5. Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции 86
2.6. Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной ЭД 90
2.7. Исследуемые химические соединения и дизайн эксперимента 90
2.8. Статистическая обработка результатов исследования 95
Глава 3. Результаты собственных исследований 100
3.1. Разработка комплекса методических подходов для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при моделировании метионин индуцированной гипергомоцистеинемии 100
3.2. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов тетрагидробиоптерина, L-норвалина, L-аргинина и их комбинаций при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции 118
3.3. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов эналаприла, лозартана и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции 133
3.4. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов витамина В6 и фолиевой кислоты, эссенциальных фосфолипидов, препаратов «Кардионат», «Мексикор» и «Импаза» при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции 146
3.5. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинации тетрагидробиоптерина и эналаприла при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции 161
3.6. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинации тетрагидробиоптерина и лозартана при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции 174
3.7. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинации тетрагидробиоптерина и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции 187
3.8. Разработка комплекса методических подходов для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований 199
Реоксигенация 203
3.9. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов тетрагидробиоптерина, L-норвалина, L-аргинина и их комбинаций при моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции... 211
3.10. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов эналаприла, лозартана и амлодипина при моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции 229
3.11. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов витамина В6 и фолиевой кислоты, эссенциальных фосфолипидов, препаратов «Кардионат», «Мексикор» и «Импаза» при моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции 241
3.12. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинации тетрагидробиоптерина и эналаприла при моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции 255
3.13. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинации тетрагидробиоптерина и лозартана при моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции 266
3.14. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинации тетрагидробиоптерина и амлодипина при моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции 277
Заключение 288
Выводы 331
Практические рекомендации 334
Список литературы 335
- Физиологическая роль оксида азота в системе кровообращения
- Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и оценка эндотелийзависимых и эндотелиинезависимых сосудистых реакций
- Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной ЭД
- Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов тетрагидробиоптерина, L-норвалина, L-аргинина и их комбинаций при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции
Введение к работе
Актуальность научного исследования
В патогенезе и клинике артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции сосудистого эндотелия (Napoli С., 2001; Falk Е., 2006; Чазова И.Е, Маколкин В.И., 2008; Мычкина В.Б., 2002). Развитие эндотелиальной дисфункции при дефиците оксида азота представляются многообразным комплексом соединяющихся и взаимообусловленных механизмов.
Коррекция эндотелиальной дисфункции и, как следствие, нарушений метаболизма оксида азота приводит к снижению риска возникновения, а также предупреждению патогенетических механизмов развития и клинических проявлений артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений (Гомазков О. А., 2000; Мазуров В.И., 2006; Das М., Das D.K., 2008; Lin K.Y., Ito A., 2002).
Сравнительно недавно к потенциальным факторам риска сердечнососудистых заболеваний стали относить гипергомоцистеинемию. Гипергомоцистеинемия может являться независимым фактором развития эндотелиальной дисфункции или усиливать уже имеющееся повреждение эндотелия (J. Zhou, G. H. Werstuck, S. Lhotak, 2008). Известных факторов коррекции гипергомоцистеинемии не так много и, пожалуй, к ним следует отнести лишь экзогенное введение витамина В6 и фолиевой кислоты. В клинических исследованиях применение фолиевой кислоты или 5- метилтетрагидрофолата (5-МТГФ, активная и циркулирующая форма фолиевой кислоты) заслужило наибольшего внимания, так как данные агенты/средства могут оказывать потенциально благоприятное влияние на метаболизм тетрагидробиоптерина (ВН4).
Одновременно, появление в последние годы понятий «эндогенного ингибирования» эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) и «разрыва eNOS» привело к интенсификации исследований, направленных на их предотвращение, как ключевых звеньев в коррекции эндотелиальной дисфункции. Метилированные аналоги L-аргинина - ассиметричный диметиларгинин (ADMA) и монометиларгинин (L-NMMA) - являются эндогенными ингибиторами эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). (Antoniades С., 2006; Bode-Boger SM, Scalera F, Ignarro LJ., 2007). «Разрыв eNOS» представляет собой переключение ферментной активности eNOS на выработку супероксида, а не окиси азота. При этом на ключевую роль в регуляции функции eNOS выдвигается кофактор птерина тетрагидробиоптерин (ВН4). Дефицит ВН4 при сосудистых заболеваниях вызван, в основном, окислением тетрагидробиоптерина пероксинитритом. Следовательно, стратегии, направленные на защиту эндогенного ВН4 от окислительных атак со стороны пероксинитрита, могут привести к сохранению оптимальной эндотелиальной концентрации тетрагидробиоптерина.
Кроме того, ограничение образования оксида азота может быть обусловлено высокой активностью аргиназы - фермента, разрушающего L-аргинин в слизистой оболочке тонкого кишечника. Становится очевидной необходимость подавления высокой активности аргиназы для снижения риска и частоты развития болезней сердца и сосудов. С этой целью возможно использовать ингибиторы аргиназы. Среди веществ данной группы наибольший интерес представляет L-норвалин - неселективный ингибитор фермента аргиназы (D. L.Costanzo, М. Ilies, 2010).
В ранее проводимых исследованиях было показано, что L-аргинин как при монотерапии, так и в сочетании с антигипертензивными средствами на ADMA- подобной модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции эффективно увеличивал активность эндотелиальной NO-синтазы и продукцию оксида азота и предотвращал развитие эндотелиальной дисфункции в эксперименте (Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., 2008; Корокин М.В., Артюшкова Е.В., 2009; Корокин М.В., Носов А.М., 2006).
Таким образом, среди нарушений метаболизма NO можно выделить факторы, ведущие к снижению его выработки (пониженное поступление L- аргинина, повышенная активность аргиназ, ингибирование и разобщение eNOS, повреждение эндотелиоцитов и т.д.) и уменьшению биодоступности (окислительный стресс, гиперлипидемия, воспаление). Очевидно, что в настоящее время достаточно большое внимание уделяется изучению путей фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота при эндотелиальной дисфункции. Однако, в доступной литературе не обнаружено сравнительного комплексного изучения эндотелио- и кардиопротективной активности терапевтических подходов, направленных на предотвращение эндогенного ингибирования и разобщения eNOS с субстратом с помощью тетрагидробиоптерина, L-аргинина, L-норвалина, витамина В6 и фолиевой кислоты, а также их комбинаций с представителями основных групп препаратов, обладающих эндотелиопротективными эффектами (эналаприл, лозартан, амлодипин, мексикор), при различных экспериментальных моделях эндотелиальной дисфункции.
Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007-2012 гг., номер госрегистрации 0120.0710379. Номер государственной регистрации темы диссертационного исследования -01201055010.
Цель исследования - провести сравнительную оценку фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота с помощью терапевтических подходов, направленных на предотвращение эндогенного ингибирования и разобщения эндотелиальной NO-синтазы с субстратом при различных экспериментальных моделях дефицита оксида азота.
Основные задачи исследования
-
Исследовать развитие эндотелиальной дисфункции при гипергомоцистеин индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
-
Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность тетрагидробиоптерина, L-аргинина и L-норвалина при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции
-
Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения L-аргинина с тетрагидробиоптерином и L-норвалином при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции
-
Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность эналаприла, лозартана и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME- индуцированной эндотелиальной дисфункции
-
Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и эналаприла при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции
-
Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и лозартана при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции
-
Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тетрагидробиоптерина и амлодипина при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
-
Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность эссенциальных фосфолипидов, потенцированных антител к эндотелиальной NO-синтазе, мельдония и этилметилгидроксипиридина сукцината, витамина В6 и фолиевой кислоты при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
Научная новизна исследования
В работе впервые предложен способ моделирования гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Продемонстрировано, что эндотелиальная дисфункция на фоне внутрижелудочного введения метионина связана с гипергомоцистеинемией и характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3,6 раза. Одновременно гипергомоцистеин индуцированная эндотелиальная дисфункция не сопровождается повышением абсолютных значений систолического и диастолического артериального давления. Кроме того, развитие эндотелиальной дисфункции сопровождалось снижением показателей биохимических маркеров (концентрация стабильных метаболитов оксида азота (Total NO, NOx), экспрессия эндотелиальной NO-синтазы), повышением концентрации гомоцистеина а также отрицательной динамикой морфометрических показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов).
В работе впервые показано, что преодоление разобщения eNOS c cубстратом путем введения тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг в качестве кофактора и влияние на метаболизм L-аргинина путем блокирования фермента аргиназы с помощью L-норвалина 10 мг/кг в качестве монотерапии оказывают эндотелио- и кардиопротективное действие при внутрибрюшинном введении в течение 7 суток как на модели L-NAME-индуцированной, так и гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. При гипергомоцистеин индуцированной патологии продемонстрировано выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие L-аргинина.
Впервые предложен способ комбинированной фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида азота с помощью сочетанного применения тетрагидробиоптерина и L-аргинина, L-норвалина и L-аргинина. При сочетанном применении тетрагидробиоптерина и L-аргинина, L-норвалина и L-аргинина обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном приближении исследуемых показателей функции сосудистого эндотелия к таковым показателям интактных животных.
Эналаприл 0,5 мг/кг, лозартан калия 6 мг/кг, амлодипин 0,5 мг/кг обладали эндотелиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии. Впервые показано, что сочетанное использование тетрагидробиоптерина с вышеперечисленными представителями основных групп антигипертензивных препаратов приводит к положительному фармакодинамическому взаимодействию, что обусловлено различными точками приложения фармакологических эффектов изучаемых препаратов.
Впервые доказано, что комбинация витамина В6 и фолиевой кислоты, эссенциальные фосфолипиды, мельдоний, этилметилгидроксипиридина сукцинат и потенцированные антитела к эндотелиальной NO-синтазе оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие при моделировании эндотелиальной дисфункции с помощью внутрибрюшинного введения L-NAME в дозе 25 мг/кг и внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг.
Впервые установлено увеличение экспрессии eNOS под влиянием тетрагидробиоптерина в качестве монотерапии и в комбинации с эналаприлом, лозартаном, амлодипином и L-аргинином.
Таким образом, на основании выполненных исследований разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицировать как крупное научное достижение, заключающееся в формировании целостных представлений о механизмах нарушения и путях фармакологической коррекции нарушений метаболизма оксида при эндотелий ассоциированной патологии путем предотвращения эндогенного ингибирования, преодоления разобщения eNOS с субстратом и увеличения биодоступности оксида азота.
Научно-практическая значимость
Предложенная модель гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции и комплексный подход к оценке патологии дает возможность в дальнейшем оценивать эндотелиопротективные свойства фармакологических агентов и проводить скрининг эндотелиопротективной активности новых веществ.
Экспериментально обосновано применение тетрагидробиоптерина в качестве монотерапии и в комбинации с L-аргинином, комбинации L-аргинина с L-норвалином, витамина В6 и фолиевой кислоты, фосфоглива, кардионата, мексикора и импазы, а также комбинаций тетрагидробиоптерина с эналаприлом, лозартаном и амлодипином для коррекции выраженной гипергомоцистеинемии, эндотелиальной дисфункции и снижения риска развития сердечно - сосудистой патологии. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки и внедрения фармакологических препаратов на основе тетрагидробиоптерина, L-аргинина и L-норвалина в качестве средств для профилактики и лечения эндотелий ассоциированной патологии. По результатам проведенных исследований на мощностях ОАО "Новосибхимфарм" готовится к промышленному выпуску препарат, содержащий в своем составе L-аргинин и L-норвалин.
Сравнительный анализ полученных экспериментальных данных о эндотелио- и кардиопротективной активности традиционных антигипертензивных препаратов в комбинации с тетрагидробиоптерином позволит разработать новые лекарственные средства для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Внедрение результатов научных исследований
На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований L-норвалина, L-аргинина, тетрагидробиоптерина, их комбинаций, а также комбинаций тетрагидробиоптерина эналаприлом, лозартаном и амлодипином при эндотелий ассоциированной патологии.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив форте производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛCP-008120/08), фосфоглив производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУР N002528/01) и мельдоний (Кардионат) производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛCP-006481/08), включены в состав документов, поданных на регистрацию в М3 РФ.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности комбинации L-аргинина и L-норвалина включенны в состав документов для промышленного выпуска нового оригинального препарата, содержащего в своем составе L-аргинин и L-норвалин (ООО "Новосибхимфарм").
Полученные результаты используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и учебных программах кафедр фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии, фармакологии и фармацевтических дисциплин, биохимии и фармакологии Белгородского государственного университета, фармакологии Воронежской медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Гипергомоцистеин индуцированная эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 3 раза, снижением показателей биохимических маркеров, повышением концентрации гомоцистеина а также характерной динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы.
-
Тетрагидробиоптерин 10 мг/кг, L-аргинин 200 мг/кг, L-норвалин 10 мг/кг, а также комбинации тетрагидробиоптерина 10 мг/кг и L-аргинина
200 мг/кг, L-норвалина 10 мг/кг и L-аргинина 200 мг/кг оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие при моделировании гипергомоцистеин- и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции. -
Комбинация витамина В6 и фолиевой кислоты, препараты «Фосфоглив», «Кардионат», «Мексикор» и «Импаза» в качестве монотерапии обладают эндотелио- и кардиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии.
-
Эналаприл 0,5 мг/кг, лозартан 6 мг/кг и амлодипин 0,5 мг/кг оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на моделях гипергомоцистеин- и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции. При комбинированном использование тетрагидробиоптерина 10 мг/кг с энаиаприлом 0,5 мг/кг, лозартаном 6 мг/кг и амлодипином 0,5 мг/кг на моделях гипергомоцистеин- и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований.
Апробация диссертации
Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых КГМУ в 2005 - 2011 гг., I-IV всероссийских конференциях молодых ученых-медиков, Росийской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), шестой международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2007), съезде терапевтов юга России «Врач XXI века: сегодня и завтра» (Росто-на-Дону, 2009), научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2009), XIII - XVII национальных конгрессах «Человек и лекарство», I, II, V национальных конгрессах терапевтов и кардиологов, VII съезде аллерголов и иммунологов СНГ, V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт- Петербург, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Москва, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011).
Апробация диссертации проведена 27 июня 2011 года на совместном заседании кафедр Курского государственного медицинского университета и Белгородского государственного национального исследовательского университета.
Диссертационная работа обсуждена на научно-практической конференции кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней Первого МГМУ имени И.М. Сеченова 10 ноября 2011 г. (протокол № 12)
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке цели и поиске путей ее достижения. Им проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, на основании чего выдвинуты рабочие гипотезы о возможных фармакотерапевтических стратегиях и биологических моделях для исследования эндотелио- и кардиопротективной активности выбранных веществ и препаратов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.
В печатных работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, моделирование исследуемой патологии и введение тестируемых препаратов, выведение животных из эксперимента с помощью аппаратного комплекса Biopac, регистрация необходимых показателей гемодинамики (САД, ДАД, ЧСС, интенсивность функционирования структур, ЛЖД, максимальная скорость сокращения и расслабления) on-line с помощью программного комплекса «Asqknowledge 3.8.1», проведение функциональных проб (эндотелийзависимая и эндотелийнезависимая вазодилатация, нагрузка объемом и сопротивлением, пробы на адренореактивность, гипоксию и реоксигенацию) статистическая обработка, научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, из них 25 в российских рецензируемых научных журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций, отражающих полностью содержание диссертации. Получено 8 патентов РФ на изобретения
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 615 источников, из них 87 отечественных и 528 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 394 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 69, рисунков - 110, схем -1.
Физиологическая роль оксида азота в системе кровообращения
Огромный интерес исследователей к изучению патогенетической роли оксида азота обусловлен сведениями, свидетельствующими о том, что фактор расслабляющий сосуды идентичен оксиду азота, а многочисленные лекарственные нитраты реализуют свой ангиотропный эффект благодаря освобождению из нитратов оксида азота. Большие трудности на пути открытия физиологической и патофизиологической роли оксида азота были связаны с тем, что молекула оксида азота имеет лишний электрон, что обусловливает высокую химическую реактивность молекулы и короткий полупериод жизни (от 6 до 3 Осек) [196].
За короткий период, прошедший с момента открытия ангиотропной функции оксида азота, накоплен огромный экспериментальный и клинический материал, позволивший установить субстрат биосинтеза оксида азота, ферменты и изоферменты, принимающие участие в биосинтезе оксида азота, тканевую специфичность изоферментов оксида азота, активаторы и ингибиторы изоферментов оксида азота, молекулярный механизм физиологического и патофизиологического эффекта оксида азота, разработать и внедрить в практику препараты, активирующие и ингибирующие функцию различных изоферментов синтазы оксида азота, установить функциональную взаимосвязь ангиотензина II и оксида азота в регуляции сосудистого тонуса, а также сопряженность эффектов супероксидного радикала и оксида азота в реализации окислительного стресса.
Оксид азота является аутокринным и паракринным медиатором, так как, будучи синтезирован в каких-либо клетках, он способен влиять на метаболические процессы как в самих этих клетках, так и в расположенных по соседству. [18, 19]. Оксид азота, как мощный эндогенный вазодилататор, принимает участие в регуляции системного и легочного сосудистого сопротивления и процессах коагуляции крови. Оксид азота функционирует в центральной и вегетативной нервной системе. По эфферентным нервам этот агент регулирует деятельность органов дыхательной систем, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы. Оксид азота подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов. Совершенно закономерно, что снижение активности оксида азота вызывает вазоконстрикцию и тромбоз. [267,277,312,367]. Что же можно отнести к клеточным мишеням оксида азота? Во-первых, это железосодержащие ферменты и белки, такие как гуанилатциклаза (Гц), собственно сама NOS, НЬ, митохондриальные ферменты, ферменты цикла Кребса, ферменты синтеза белка и ДНК. Связывание N0 с железосодержащим участком фермента приводит к их изменению активности. Взаимодействие NO с этими мишенями имеет важное значение в цитотоксическом действии макрофагов, в расслаблении мышц сосудов и ЖКТ, в переносе кислорода, образовании АТФ и формировании долговременной памяти.
Вторая важная молекулярная мишень для оксида азота - это белки, содержащие SH=rpynnbi. NO служит эффективным катализатором образования дисульфидных мостиков. Благодаря взаимодействию с SH=rpynnaMH NO может регулировать такой важный для клетки процесс, как биосинтез белка.
Наконец, третья важная молекулярная мишень - активные формы кислорода. NO связывается с кислородом с образованием чрезвычайно токсичных соединений — пероксинитритов [366]. Последние по токсичности во много раз превосходят сам NO. Образование пероксинитритов выступает существенным элементом во многих патофизиологических процессах, включая септический шок, а также ишемические и язвенные повреждения органов.
Современное представление о механизме реализации биохимического действия оксида азота достаточно обосновано разработано для сосудистой системы. Так, в ответ на физическую и химическую стимуляцию в сосудистом эндотелии на короткий период повышается исходное образование оксида азота с помощью СОА I и III типов. Увеличение синтеза оксида азота синтазой оксида азота происходит под влиянием ацетилхолина, брадикинина, 5-гидрокситриптамина, адениловых нуклеотидов. Участие синтазы оксида азота в сосудистой регуляции сопряжено с сосудорасширяющим эффектом этих нейротрансмиттеров, стимулирующих вход кальция в эндотелиальную клетку. Повышение уровня внутриклеточного кальция сопровождается активиацией, прежде всего, эндотелиальной формы синтазы оксида азота кальмодулин-зависимым механизмом, что ведет к кратковременному выделению небольших количеств оксида азота (пикомоли). Последний диффундирует в клетки прилежащих гладких мышц сосудов и связывается со специфическими рецепторными сайтами гема, который является составной частью молекулярной структуры растворимой цитоплазматической гуанилатциклазы. Связывание оксида азота с группой гема растворимой гуанилатциклазы индуцирует конформационное изменение, которое смещает железо из плоскости порфиринового кольца, тем самым активирует растворимую гуанилатциклазу. При этом увеличивается концентрация циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в клетке-мишени, что вызывает физиологическое действие [29]. Так, в гладкомышечных клетках цГМФ снижает уровень внутриклеточного кальция, что приводит к расслаблению клетки и вызывает вазодилятацию .
Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и оценка эндотелийзависимых и эндотелиинезависимых сосудистых реакций
Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. Блокатор эндотелиальной NOS N-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг. На 7 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей гемодинамики, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. По данным литературы такой умеренно пролонгированный среднедозовый режим введения L-NAME приводит к провоспалительным (увеличение адгезивных и инфильтративных эффектов моноцитов) и пролиферативным (появление пролиферирующих антигенпозитивных ядерных клеток) изменениям сосудистого русла, характерных для патофизиологических проявлений при развитии раннего первичного атеросклеротического процесса [83, 99]. При этом повышается активность АПФ и AT I рецепторов, приводящая к повышению активности AT II [79, 82], повышается экспрессия хемокинов, хемотаксических пептидов моноцитов [83, 88], адгезивных молекул эндотелия, транформирующего фактора роста [89, 92, 93]. Кроме того, повышается продукция супероксид-анионов и активность факторов транскрипции (нуклеарный фактор каппа В, активатор плазминогена 1) [95, 98, 102]. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и аппаратного комплекса для инвазивного измерения показателей гемодинамики Biopac (USA) и компьютерной программы AsqKnowledge 3.8.1. Функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг).
Развитие эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных, а также степень ее коррекции исследуемыми препаратами и их комбинациями оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД).
Формула расчета коэффициента эндотелиальной дисфункции впервые предложена в лаборатории кардиофармакологии НИИ Экологической медицины коллективом авторов под руководством профессора М.В. Покровского [23, 43, 46, 57].
При оценке результатов функциональной пробы на ЭЗВД использовалась площадь прямоугольного треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг (рис. 7). При этом за меньший из катетов данного треугольника принималась разность между исходным значением АД (перед проведением пробы) и минимальным значением АД после окончания кардиального компонента.
При оценке результатов ЭНВД с введением нитропруссида в дозе 30 мкг/кг также использовалась площадь прямоугольного треугольника над кривой восстановления АД, точками меньшего катета которого являлись: исходное значение АД (перед проведением пробы) и точка максимального падения АД при сосудистой реакции.
Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов [85, 143]. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Анализ 100 мкл депротеинизированной сыворотки проводили в 96 луночных планшетах с плоским дном. Чувствительность метода на приборе Labsystems Multiskan МСС/340 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,05% раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида в 30%) уксусной кислоте) [85, 143]. Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4С в течение нескольких месяцев. Для приготовления раствора хлористого ванадия 400 мг VCI3 растворяли в 50 мл IN НС1 с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор.
Уровень метаболитов NO (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaN02 в воде, который хранили при температуре -20С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой.
Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson [85, 143, 165] с небольшими модификациями. По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, рН 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл лизирующего буфера: 0,1 М ацетат Na, рН 6,8, содержащего 5 мМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SDS), центрифугировали 10 мин при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS, согласно методу. В лунку наносили 20 мкг белка. На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope Prestained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м. которой 140000 Да). Белок в клеточном лизате определяли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта.
По окончании электрофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану - Вестерн-блот (60 В, 1 час). Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA). После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональных кроличьих антител против eNOS человека (BD Transduction Labs, USA), разведённых (в соотношении 1:500) в 5 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1% азида натрия. Затем мембрану отмывали 7 раз по 10 мин в том же буфере. В течение часа мембрану инкубировали с разведёнными в соотношении 1:300 вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (goat anti-rabbit IgG antibodies, Sigma, USA). При этом неспецифическое связывание конъюгатом блокировали добавлением в буфер 5% обезжиренного сухого молока. Затем мембрану снова отмывали в фосфатном буфере (7 раз по 10 мин).
Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной ЭД
В рамках данной работы проведено исследование эндотелио- и кардиопротективной активности ряда фармакологических агентов. В хронических экспериментах при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции препараты вводились в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно или внутрижелудочно (в соответствии с основным путем введения препарата в клинике) в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME или метионина. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах [248, 249, 302, 388]. Исследование активности тетрагидробиоптерина (ВН4) (Sigma Aldrich, USA) проводили при введении внутрибрюшинном введении ВН4 в дозе 10 мг/кг. Данная доза выбрана в соответствии с литературными данными, где диапазон дозировок при исследовании активности тетрагидробиоптерина находится в пределах от 5 мг/кг до 20 мг/кг. L-норвалин (WIRUD GmgH, Hamburg) вводился в дозе 10 мг/кг. Согласно данным современных исследователей, именно начиная с этой дозировки L-норвалин способен ингибировать фермент аргиназу [314].
Исследована эндотелиотропная активность L-аргинина производства EUROBIOPHARM GmgH, Hamburg в дозе 200 мг/кг, которая была определена нами по данным литературы, в соответствии с которыми эндотелиопротективные эффекты L-аргинина проявляются в дозах от 30 до 500 мг. В соответствии с исследованиями, проводимыми в лаборатории кардиофармакологии НИИ ЭМ КГМУ дозозависимые эндотелиопротективные эффекты L-аргинина обнаружены в дозах 30 и 200 мг/кг (табл. 1). Фолиевую кислоту (Валента Фармацевтика,ОАО) вводили внутрижелудочно в дозе 0,2мг/кг/сутки в течение 7 дней. Витамин В6 (Верофарм) вводили внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг/сутки. Эндотелио- и кардиопротективная активность мельдония (Кардионат, производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия) исследовалась в дозе 80 мг/кг. Максимальная суточная доза мельдония для человека массой 70 кг равняется 1000 мг, т.е. 14,28 мг/кг, коэффициент пересчета на площадь поверхности тела человека - 39,0, коэффициент для крысы массой 200г равен 6,5 в результате максимальная терапевтическая доза для крыс с данной массой тела равнялась 84,26 мг/кг. Таким образом, исследования проводились на крысах линии Wistar при внутрижелудочном введении в терапевтической дозе, полученной в результате переноса доз с человека на крысу.
«Мексикор» (ООО «ЭкоФармИнвест») вводили внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг. Данная доза препарата определена в соответствии с ранее полученными экспериментальными данными исследования активности препарата «Мексикор».
Для исследования эндотелио- и кардиопротективной активности препарата «Импаза» (сверхмалые дозы аффинно очищенных антител к эндотелиальной NO-синтазе, смесь гомеопатических разведений С12+С30+С200, производства ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг», Россия) препарат разводили в поилках из расчёта 1 таблетка на 100 мл воды. Крысы получали импазу в свободном доступе к питью с учётом объема потребляемой жидкости 20±3 мл/животное/сут., что соответствовало суточной дозе 1 таб/кг массы животного.
Для изучения эффективности эссенциальных фосфолипидов был выбран препарат «Фосфоглив», капсулы производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» в дозе 2,2 г/кг. Доза препарата рассчитывалась по входящему в их состав фосфатидилхолину, равноэквивалентно содержанию последнего в препарате эссенциале форте Н (капсулы) и последующему пересчету доз с человека на крысу в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.
Препараты с доказанными эндотелиопротективными свойствами вводили внутрижелудочно в течение 7 суток. Эналаприла малеат («Рениприл», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), лозартан калия («Блоктран», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), амлодипин («Амлотоп», производства «Макизфарма»), использовали в дозах 0,5 мг/кг, 6 мг/кг, 0,5 мг/кг соответственно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие препаратов в экспериментах, ранее проведённых в нашей лаборатории. Оценка эндотелио- и кардиопротективного действия комбинации витамина В6 2 мг/кг и фолиевой кислоты 0,2 мг/кг, препаратов «Фосфоглив» 2,2 г/кг, «Кардионат» 80 мг/кг и «Импаза» 1 таб/кг при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции. Оценка эндотелио- и кардиопротективного действия эналаприла 0,5 мг/кг, лозартана 6 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции. Оценка эффективности эндотелио- и кардиопротективного действия сочетанного применения тетрагидробиоптерина 10 мг/кг с эналаприлом 0,5 мг/кг, лозартаном 6 мг/кг и амлодипином 0,5 мг/кг при моделировании гипергомоцистеин и L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции.
Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов тетрагидробиоптерина, L-норвалина, L-аргинина и их комбинаций при моделировании гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции
Согласно дизайну исследования, эндотелиальную дисфункцию моделировали ежедневным в течение 7 суток внутрижелудочным введением метионина в дозе 3 г/кг. Исследуемые препараты: тетрагидробиопетрин (ВН4) в дозе 10 мг/кг, L-аргинин в дозе 200 мг/кг вводили внутрибрюшинно, L-норвалин в дозе 10 мг/кг вводили внутриже луд очно однократно через 30 минут после введения метионина в течение 7 суток. При изучении эффективности совместного применения субстанций препараты вводили в тех же дозах и теми же путями введения что и при монотерапии. По протоколу на восьмые сутки наркотизированное животное брали в эксперимент. Влияние исследуемых веществ на исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс с моделированием гипергомоцистеин индуцированной патологии представлены на рисунке 17.
Обнаружено, что изучаемые препараты не влияли на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД, достоверно не отличались от таковых значений животных контрольной группы во всех сериях экспериментов (рис. 17, табл. 7). В таблице 7 и на рисунке 18 представлены результаты функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у животных с гипергомоцистеин индуцированной патологией на фоне лечения изучаемыми препаратами. Обработка полученных экспериментальных данных позволила установить что ВН4 в дозе 10 мг/кг, L-норвалин в дозе 10 мг/кг и L-аргинин в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии предотвращали повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции. Комбинированное применение тетрагидробиоптерина и L-аргинина, а также L-норвалина и L-аргинина привело к оптимальному снижению коэффициента эндотелиальной дисфункции, значения которого в указанных группах приближались к таковым в контрольной серии экспериментов (табл. 7, рис. 18).
При анализе абсолютных значений площадей над кривыми восстановления артериального давления при проведении проб обнаружено, что оптимальное соотношение эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации (близкое к животным контрольной серии) характерно для группы животных, получавших тетрагидробиоптерин и L-аргинин. Площадь сосудистой реакции над кривой восстановления артериального давления в ответ на внутривенное введение ацетилхолина в группе животных, получавших BH4+L-aprnHHH, составила 1028,6±41 усл. ед. (в контроле 1124,2±63,7), в ответ на внутривенной введение нитропруссида натрия - 1131,4±86,3 усл. ед. (в контроле - 1011,8±94,6). Кроме того, снижение КЭД в группе животных, получавших L-норвалин в качестве монотерапии, произошло за счет статистически значимого уменьшения площади эндотелийнезависимой реакции, однако площадь эндотелий зависимой реакции статистически значимо не изменялась (табл. 7.). При переводе животных на управляемое дыхание обнаружено, что исходные показатели сократимости левого желудочка у животных, получавших метионин на фоне изучаемых препаратов достоверно не отличались от таковых в контрольной серии экспериментов. Достоверно более низкое значение интенсивности функционирования структур в группе животных получавших комбинацию L-аргинина и ВН4 можно объяснить незначительно выраженным гиподинамическим эффектом комбинации, выразившимся в одновременном, не носящем статистически достоверного характера, снижении ЛЖД и частоты сердечных сокращений .
Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных с гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункцией проводились нагрузочные пробы (табл. 9, 10, 3.11, рис.19, 3.20). Проба на адренореактивность характеризовалась выраженным приростом абсолютных значений ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt. В группе животных, получавших метионин в дозе 3 г/кг ЛЖД, +dp/dt и -dp/dt составили, соответственно, 238,1 ±9,2, 13957±391 и7934±481 (табл 9., рис. 19). Одновременно обнаружено статистически значимое увеличение показателя интенсивности функционирования структур, что подтверждает общую перестройку механизмов регуляции кровообращения на гипердинамический тип (табл. 9). Анализ полученных экспериментальных данных позволил установить статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность во всех сериях экспериментов с L-норвалином, L-аргинином, тетрагидробиоптерином и их комбинацией. Максимальное предотвращение повышения адренореактивности, вызванного гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункцией, выявлено при использовании комбинации L-норвалина (10 мг/кг) и L-аргинина (200 мг/кг) (табл. 9, рис. 19). При проведении пробы на нагрузку сопротивлением обнаружены результаты, сопоставимые с таковыми при проведении пробы на адренореактивность (рис. 20).
